山東某規(guī)?；i場主要疫病抗體監(jiān)測與分析

朱麗亞

摘要：目的：當前動物疫病已成為規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要威脅之一，特別是豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征（藍耳病）、豬偽狂犬病，已經(jīng)成為目前中國養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴重的3種重要傳染病。檢測這三種疾病的免疫抗體，可及時了解豬藍耳病及豬瘟抗體水平，盡早發(fā)現(xiàn)免疫是否存在不足，了解母豬群免疫狀態(tài)，母豬群是否存在免疫問題及潛在的感染風險。方法：采取90頭份豬的血清，進行豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等疾病免疫抗體檢測，而偽狂犬進行野毒感染抗體檢測。結果：（1）母豬三種疾病整體陽性率，藍耳抗體陽性率為96.29%、豬瘟陽性率為94.81%、偽狂犬野毒抗體陽性率為14.82%。（2）不同生產(chǎn)階段三種疾病的抗體陽性率，妊娠30～60d母豬藍耳病、豬瘟、偽狂犬野毒抗體陽性率分別為97.77%、91.10%、22.23%;而妊娠60～90d藍耳病與豬瘟抗體陽性率分別為100.00%和93.33%，偽狂犬野毒抗體陽性率為8.9%;哺乳15d母豬三種疾病的陽性率分別為91.10%、100.00%、13.33%。（3）不同生產(chǎn)線三種疾病的抗體陽性率，生產(chǎn)一線母豬藍耳病、豬瘟、偽狂犬野毒抗體陽性率分別為100.00%、88.90%、0.00%;生產(chǎn)二線藍耳病與豬瘟抗體陽性率分別為95.53%和100.00%，偽狂犬野毒抗體陽性率為4.47%;生產(chǎn)三線三種疾病的陽性率分別為93.33%、95.53%、40.00%。結論：本場豬瘟、藍耳病整體疫苗免疫較好，但第三線哺乳階段藍耳病免疫較差，需要重新免疫，偽狂犬野毒處于低水平感染;整體豬場免疫效果比較好。

關鍵詞：母豬;抗體;檢測;分析

隨著生豬養(yǎng)殖規(guī)模化、集團化的發(fā)展，生豬的飼養(yǎng)密度越來越高，這就導致豬群活動量減少、抵抗力下降。如果疾病早期發(fā)現(xiàn)不及時，這就導致疾病傳播速度快，波及范圍廣;進而引起巨大的損失，阻礙了我國生豬產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。最近幾年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，因各種豬疫病造成的生豬死亡率占全部死亡生豬的10%以上，給我國生豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。當前動物疫病已成為規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要威脅之一，現(xiàn)今疾病的種類繁多，病原變異頻繁，耐藥性增強，混合感染易發(fā)等不利因素使得規(guī)?；B(yǎng)殖場面臨重大的挑戰(zhàn)。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計近期豬新傳染病多達20種，其中豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病是目前中國養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴重的3種重要傳染病。其中豬瘟與豬繁殖與呼吸綜合征是《2012 國家動物疫病強制免疫計劃》中的必須進行強制免疫的兩種傳染病，可見其重要性。

但目前豬場發(fā)病情形越來越復雜，其中主要以混合感染和繼發(fā)感染的為主，很難看到豬瘟、藍耳病、偽狂犬等病的典型病例，根據(jù)臨床癥狀和病理解剖也很難對疾病進行診斷?？梢酝ㄟ^實驗室血清學檢測來了解3種病的流行動態(tài)，再結合臨床情況來初步診斷。對于偽狂犬、豬瘟，我們可以通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA ）檢測方法來鑒別診斷，而且 ELISA 檢測方法操作簡便、快速準確，目前已成為確診疾病的有效手段。

疫苗免疫是規(guī)?；i場防控重要動物疾病的重要手段，而影響免疫效果的因素眾多，因此，抗體的監(jiān)測就顯得尤為重要。本次試驗通過檢測豬藍耳病、豬瘟、偽狂犬野毒等疾病免疫抗體;及時了解豬藍耳病及豬瘟抗體水平，盡早發(fā)現(xiàn)免疫是否存在不足，了解母豬群免疫狀態(tài);而對偽狂犬野毒進行檢測，可發(fā)現(xiàn)母豬群是否存在免疫問題及潛在的感染風險。以便更好的指導母豬群管理工作。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集與處理

采集山東某規(guī)模豬場母豬群血清，采樣方式為按照50%預期流行率、95%置信區(qū)間確定仔豬樣本量，按照15%預期流行率、95%置信區(qū)間確定母豬采樣量三個階段合計為90個樣本。通過耳緣靜脈采血，凝血處理，分離血清后置于-20℃冰箱凍存待檢。

1.1.2 主要試劑及儀器

MEDIAN公司豬瘟病毒（CSFV）抗體檢測試劑盒、藍耳病病毒（PRRSV）抗體檢測試劑盒、豬偽狂犬病病毒gE（PRVgE）抗體檢測試劑盒，以及每個試劑盒相對應的稀釋液、洗滌液、TMD底物、終止液、陰性、陽性對照以及抗原包被板等。

酶標儀、Eppendorf移液器、恒溫培養(yǎng)箱、全自動洗板機以及振蕩器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

將采集到的豬的血液，傾斜45°放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置 1～2h，待自然凝固析出血清后;吸取上清液轉至新準備的干凈的1.5ml離心管并編號，離心3～5min，分離血清，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗操作

本次試驗是通過ELISA方法檢測豬瘟、藍耳、偽狂犬野毒的抗體水平，三種試劑盒在使用前，須恢復到正常溫室（18～25℃），具體操作步驟如下：

（1）先將待檢樣品在96孔板架上擺好，從E1的位置開始S型依次排列;取出抗原包被板，拿出待檢樣品需要的孔條，多余的孔條密封（放入密封袋中，密封袋中加入干燥劑）后放入2～8℃冰箱保存。在記錄表上記錄樣本的位置。

（2）樣品稀釋：用樣品稀釋液將待檢樣品進行40倍稀釋。先在一次性稀釋板上與待檢樣品相應的位置加入195μl樣品稀釋液，再在相應的位置依次加入5μl待檢樣品。加完后在微量振蕩器上震蕩10s混勻。每個樣品都要更換槍頭，不要稀釋陰陽性對照。

（3）A1和B1的孔加入100μl無稀釋的陰性對照溶液，而陽性對照位于C1和D1的位置，分別加入無稀釋的陽性對照溶液100μl。避免產(chǎn)生氣泡。

（4）從E1的位置開始，在對應的孔中加入100 μl已稀釋好的樣品，排槍加樣，加樣前在孔內(nèi)吹打3次，采用倒吸法加入，避免產(chǎn)生氣泡。

（5）蓋上板蓋或貼上封板膜在22～25℃（室溫達不到時，放25℃恒溫箱）條件下孵育30±2 min，嚴格計時。

（6）之后，板蓋或封板膜去掉，洗滌4次。洗板機洗板：將反應板放在洗板機上，洗滌4次，最后一次在吸水紙（棉墊上放3張干凈吸水紙）上拍干（吸水紙上無明顯水漬，反應板底部無肉眼可見水漬，若孔內(nèi)有氣泡，用一次性槍頭刺破，再次拍干）。手動洗板：將反應板快速翻轉至水平，甩掉孔內(nèi)液體至廢液筒。用300μl排槍每孔內(nèi)加入300μl洗液，水平輕搖5s，甩掉孔內(nèi)液體至廢液筒，如此反復洗滌4次。最后一次在吸水紙（棉墊上放3張干凈吸水紙）上拍干（吸水紙上無明顯水漬，反應板底部無肉眼可見水漬，若孔內(nèi)有氣泡，用一次性槍頭刺破，再次拍干）。

（7）每孔必須立即加入100μl酶標抗體。避免產(chǎn)生氣泡。

（8）蓋上板蓋或貼上封板膜22～25℃（室溫達不到時，放25℃恒溫箱）條件下孵育30±2min，嚴格計時。重復步驟6）。

（9）洗滌拍干后，TMB底物液立刻加入100μl/孔 ，加第一孔即開始計時。避免產(chǎn)生氣泡。

（10）蓋上板蓋或貼上封板膜22～25℃（室溫達不到時，放25℃恒溫箱）條件下避光（蓋黑色蓋板或放置抽屜）孵育15±1min，嚴格計時。

（11）終止液加入100μl/孔，終止反應，添加順序與TMB底物液保持一致。避免產(chǎn)生氣泡。

（12）終止反應10min內(nèi)，測量并且記錄樣本和對照的吸光值A650。

（13）將測量結果以Excel的形式保存，計算結果。

1.3 結果判定

CSFV：阻斷率≥40.0%為陽性，阻斷率≤40.0%為陰性;PRRSV：S/P值（陽性對照平均值的比值）≥0.4為陽性，S/P值<0.4為陰性;PRV gE：S/N值（陰性對照平均值的比值）>0.6為陰性，S/N值≤0.6為陽性。

2 結果與分析

2.1 豬場整體三種疫病抗體檢測結果

由試驗結果可知，母豬藍耳抗體陽性率為96.29%、豬瘟為94.81%、偽狂犬野毒抗體陽性率為14.82%;而三種疫病抗體陽性率離散度分別為37.74%，21.17%，21.01%。

2.2 不同階段三種疫病抗體檢測結果

由試驗結果可知，妊娠30～60d母豬藍耳病、豬瘟、偽狂犬野毒抗體陽性率分別為97.77%、91.10%、22.23%，離散度為33.25%、23.85%、26.54%;而妊娠60～90d藍耳病與豬瘟抗體陽性率分別為100.00%和93.33%，離散度為24.04%與4.38%，偽狂犬野毒抗體陽性率為8.9%，而離散度為14.25%;哺乳15d母豬三種疾病的陽性率分別為91.10%、100.00%、13.33%，離散度為55.94%、15.29%、22.23%。

2.3 不同生產(chǎn)線三種疫病抗體檢測結果

由試驗結果可知，生產(chǎn)一線母豬藍耳病、豬瘟、偽狂犬野毒抗體陽性率分別為100.00%、88.90%、0.00%，離散度為30.87%、30.02%、5.31%;而生產(chǎn)二線藍耳病與豬瘟抗體陽性率分別為95.53%和100.00%，離散度為43.64%與15.97%，偽狂犬野毒抗體陽性率為4.47%，而離散度為14.81%;生產(chǎn)三線三種疾病的陽性率分別為93.33%、95.53%、40.00%，離散度為38.72%、17.53%、42.89%。

3 討論與分析

據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計近期豬新傳染病多達20種，其中豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病是目前中國養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴重的3種重要傳染病。藍耳病病毒可導致豬免疫系統(tǒng)受到印制，進而繼發(fā)或混合感染其他疾病;再加上藍耳病病毒具有高度變異的特性，使得其不斷產(chǎn)生毒力增強的變異毒株，因此，主會場那個科學防控藍耳病最有效的措施就是對其抗體水平進行檢測。而豬瘟目前多以非典型、慢性、隱形的情況發(fā)病，一個豬場往往是全群感染，這就導致全部撲殺不現(xiàn)實，并且其還可進行垂直傳播，進而使得其持續(xù)感染;并且高密度的飼養(yǎng)以及豬群流動頻繁等不規(guī)范的操作，往往可導致豬偽狂犬的流行傳播，其也嚴重影響豬場的發(fā)展與經(jīng)濟效益。

因此，對藍耳、豬瘟、偽狂犬抗體水平進行免疫檢測，既可以快速發(fā)現(xiàn)它們的感染與傳播，同時還可以檢測三種疾病的免疫抗體，對規(guī)模化豬場調(diào)整優(yōu)化免疫程序、保證疫苗免疫效果至關重要;且可有效的評估疫病的感染壓力和風險。離散度是衡量一個豬群抗體陽性率均勻度的一個重要指標，其高低可提示豬場在免疫后抗體水平的整齊度，可對疫苗免疫效果進行評估?？贵w離散度要求是離散度越小越好。藍耳病的離散度一般在35%～45%;母豬群豬瘟的離散度一般≤40%。

涂長春等研究認為豬瘟群體的免疫保護率至少要達到 85%，才能避免豬瘟的發(fā)生。而本次試驗結果，豬瘟整群抗體陽性率在94.81%以上，豬瘟抗體整體離散度為21.17%，而且均低于40%;說明豬瘟免疫后的抗體整齊度較好;因此，本場豬瘟免疫效果較好。

良好豬場的藍耳病抗體陽性率一般在70%以上。本次試驗藍耳病抗體陽性率結果為96.29%，而藍耳病抗體整體離散度為37.74%，這提示該豬場藍耳病陽性比較穩(wěn)定，是一個良好的藍耳病陽性穩(wěn)定場;但母豬處于哺乳期15d時，其藍耳抗體陽性雖然為91.1%，但離散度為55.94%，表明母豬在哺乳期藍耳抗體參差不齊，但S/P值在2.5以內(nèi)，這說明藍耳病疫苗免疫時間較長，或者是免疫效果較差;第三生產(chǎn)線需要進行一次加強免疫。

而偽狂犬野毒抗體水平比較偏低，基本維持在14.82%左右;低于戴愛玲等在 2012～2014 年調(diào)查的閩西南地區(qū)部分規(guī)?；i場母豬陽性率22.0%，但這也說明本豬場存在偽狂犬野毒持續(xù)感染壓力和風險，但對后備豬進場前進行檢測、凈化以及進場后及時消毒等措施相結合，使得其一直維持在低水平的感染風險。

4 結論

本場豬瘟、藍耳病整體疫苗免疫較好，但第三線哺乳階段藍耳病免疫較差，需要重新免疫，偽狂犬野毒處于低水平感染;整體豬場免疫效果比較好。由此可知，抗體水平檢測在豬瘟、藍耳、偽狂犬能夠疾病的防控中有不可替代的作用。

要堅持定期開展免疫監(jiān)測，評價疾病的免疫效果以及感染壓力，及時調(diào)整本場的免疫程序，抗體不合格及時補免，淘汰帶毒種豬，保障健康的母豬群。

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