芍藥苷通過(guò)抑制TGF-β1/Smad3通路對(duì)急性心肌梗死后心室重塑的作用研究

閆 娜，楊 妮，董 晗，魏 平

(1. 延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安 716000;2. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004;3. 西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710049)

急性心肌梗死是由冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺氧缺血導(dǎo)致的一種心肌壞死。盡管早期溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)治療降低了急性心肌梗死相關(guān)的病死率，但存活的患者多數(shù)會(huì)出現(xiàn)左室重塑現(xiàn)象[1]。心肌梗死后這種不良的心室重塑可導(dǎo)致心室功能不全和心力衰竭，最終導(dǎo)致疾病預(yù)后差和病死率高[2]。目前，心肌梗死的主要治療藥物有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素I型受體阻滯劑和β-腎上腺素能阻滯劑[3]，但這些治療藥物對(duì)于預(yù)防心肌梗死后左室重構(gòu)的有效性仍然十分有限。因此有必要開(kāi)發(fā)新的治療藥物，以保護(hù)心肌梗死患者免受心室重塑的影響。芍藥苷是常用中藥牡丹、白芍和赤芍的主要有效成分，是一種單萜苷類化合物。Chen等[4]的研究表明，芍藥苷可減少大鼠心肌缺血/再灌注損傷時(shí)的梗死面積，改善血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)水平。然而，芍藥苷能否改善急性心肌梗死后心室重塑及其可能的機(jī)制尚待闡明。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)被認(rèn)為是心肌纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其可影響細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和分化，增加膠原和基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，維持成纖維細(xì)胞的活力，抑制金屬蛋白酶的產(chǎn)生[5-6]。有研究表明，芍藥苷可通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)通路，減輕肝損傷，減少膠原沉積，抑制輻射性肝纖維化[7]。本研究基于TGF-β1/Smad3通路探討了芍藥苷對(duì)急性心肌梗死后心室重塑的影響，以期為明確芍藥苷對(duì)心肌梗死后心室重塑的作用機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0008。所有SD大鼠于動(dòng)物房中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～24 ℃，保持環(huán)境通風(fēng)，及時(shí)清理糞便、更換墊料，提供充足飲水及飼料。

1.2主要試劑及儀器 芍藥苷購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司；曲美他嗪購(gòu)自天津施維雅制藥有限公司；2%TTC染色液和Masson試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1和p-Smad3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Smad3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；GAPDH和HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自武漢Proteintech公司；Super ECL Detection Reagent ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；IL-6 和TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司。Vevo 2100超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)購(gòu)自加拿大VisualSonics公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Nikon；MultiskanTMFC 酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 待大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，將其隨機(jī)分為5組各8只。參考文獻(xiàn)[8]，結(jié)扎模型組、曲美他嗪組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，建立急性心肌梗死模型。假手術(shù)組除不進(jìn)行手術(shù)結(jié)扎外，其余手術(shù)操作與模型組一致。手術(shù)后24h，曲美他嗪組大鼠給予曲美他嗪10 mg/(kg·d)灌胃，芍藥苷高、低劑量組大鼠分別給予芍藥苷10 mg/(kg·d)和5 mg/(kg·d)灌胃，假手術(shù)組和模型組灌胃生理鹽水，均連續(xù)4周。

1.4檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1心功能評(píng)估 末次灌胃24 h后，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。使用21 MHz高頻探頭在標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置下進(jìn)行二維經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查，在3個(gè)連續(xù)的心動(dòng)周期內(nèi)測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESv)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)。EF=(LVEDv-LVESv)/LVEDv×100%，F(xiàn)S=(LVEDd-LVESd)/LVEDd×100%。

1.4.2血清炎癥因子水平檢測(cè) 超聲檢查結(jié)束后，尾靜脈抽取靜脈血，1 000×g離心20 min收集血清，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平。

1.4.3TTC染色心肌梗死面積評(píng)估 各組8只大鼠取血后立即取出心臟，于-20 ℃條件下冷凍15 min，將心臟切片。心臟切片在37 ℃的1%TTC染色液中孵育15 min，紅色表示正常心肌組織，白色表示心肌梗死區(qū)域。用Image Pro-Plus圖像分析軟件分析梗死面積。

1.4.4HE染色心肌結(jié)構(gòu)觀察 取8只大鼠心臟，4%多聚甲醛固定72 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片。石蠟切片常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水洗滌后，伊紅液浸染3 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察分析。

1.4.5Masson染色心肌膠原沉積情況觀察 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染液染色10 min。酸性乙醇分化液分化15 s，水洗。Masson藍(lán)化液返藍(lán)5 min，水洗。麗春紅品紅染液10min。磷鉬酸溶液洗1 min，弱酸工作液洗1 min。苯胺藍(lán)染液染色2 min。弱酸工作液洗后，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察分析。

1.4.6Western blot法心肌組織中TGF-β1、p-Smad3表達(dá)水平檢測(cè) 取8只大鼠，把心臟組織剪切成細(xì)小的碎片，RIPA裂解液裂解組織，離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入Ⅰ型膠原(1∶5000)、Ⅲ型膠原(1∶1 000)、TGF-β1(1∶500)、p-Smad3(1∶1 000)、Smad3(1∶500)抗體和GAPDH(1∶5 000)抗體，4 ℃條件下過(guò)夜孵育。隨后加入HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h后，滴加ECL工作液到膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心功能比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠EF和FS均顯著降低(P均<0.05)，LVIDs和LVIDd均顯著升高(P均<0.05)；與模型組比較，曲美他嗪組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組大鼠EF和FS均顯著升高(P均<0.05)，LVIDs和LVIDd均顯著降低(P均<0.05)，且芍藥苷高劑量組改善情況優(yōu)于芍藥苷低劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 假手術(shù)組和急性心肌梗死各組大鼠心功能比較

2.2各組大鼠血清炎性因子水平比較 模型組大鼠血清TNF-α和IL-6水平均顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)；曲美他嗪組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組大鼠血清TNF-α和IL-6水平均顯著低于模型組(P均<0.05)，且芍藥苷高劑量組均顯著低于芍藥苷低劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 假手術(shù)組和急性心肌梗死各組大鼠血清TNF-α和IL-6水平比較

2.3各組大鼠心肌梗死面積比較 模型組、曲美他嗪組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組大鼠心肌梗死面積分別為(45.82±7.89)%、(15.27±2.05)%、(33.15±4.14)%、(24.51±3.47)%，曲美他嗪組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組均顯著低于模型組(P均<0.05)，且芍藥苷高劑量組顯著低于芍藥苷低劑量組(P<0.05)。

2.4各組大鼠心肌結(jié)構(gòu)比較 HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠肌原纖維排列整齊，有連續(xù)性，見(jiàn)圖1；模型組大鼠肌原纖維排列紊亂，有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫，見(jiàn)圖2；曲美他嗪組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組大鼠膠原纖維排列趨于整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫明顯減少，且芍藥苷高劑量組改善更明顯，見(jiàn)圖3～5。

圖1 假手術(shù)組大鼠心肌結(jié)構(gòu)HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 模型組大鼠心肌結(jié)構(gòu)HE染色表現(xiàn)(×400)

圖3 曲美他嗪組大鼠心肌結(jié)構(gòu)HE染色表現(xiàn)(×400)

圖4 芍藥苷低劑量組大鼠心肌結(jié)構(gòu)HE染色表現(xiàn)(×400)

圖5 芍藥苷高劑量組大鼠心肌結(jié)構(gòu)HE染色表現(xiàn)(×400)

2.5各組大鼠心肌纖維化情況比較 模型組大鼠心肌膠原沉積面積和Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)，曲美他嗪組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組均顯著低于模型組(P均<0.05)，且芍藥苷高劑量組均顯著低于芍藥苷低劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)圖6～7及表3。

2.6各組大鼠心肌組織中TGF-β1、p-Smad3表達(dá)情況比較 模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、p-Smad3表達(dá)量均顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)，曲美他嗪組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組均顯著低于模型組(P均<0.05)，且芍藥苷高劑量組均顯著低于芍藥苷低劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)圖8及表4。

3 討 論

心室重塑包括心肌肥厚和纖維化，是血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷的病理改變，與高血壓和其他心血管疾病有關(guān)[9]，它是許多心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前研究認(rèn)為心肌肥厚和纖維化程度與心力衰竭患者的病死率密切相關(guān)[10]，對(duì)于高血壓、心肌梗死或其他心血管疾病患者，在疾病早期抑制心室重塑是延緩心力衰竭的有效途徑[11]。

圖6 假手術(shù)組和急性心肌梗死各組大鼠Masson染色心肌膠原沉積情況(×200)

1為假手術(shù)組；2為模型組；3為曲美他嗪組；4為芍藥苷低劑量組；5為芍藥苷高劑量組圖7 假手術(shù)組和急性心肌梗死各組大鼠心?、裥湍z原和Ⅲ型膠原表達(dá)情況

表3 假手術(shù)組和急性心肌梗死各組大鼠心肌膠原沉積面積及心肌組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原相對(duì)表達(dá)水平比較

芍藥苷具有多種生物學(xué)功能，包括抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激和抑制血小板聚集、血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化等[12-13]。有研究證明，芍藥苷可抑制IL-6、TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，改善左心室功能，減輕心肌缺血再灌注損傷[14]。另有研究表明，芍藥苷可抑制TNF-α和IL-1β炎性因子的表達(dá)，從而減少LPS刺激造成的小鼠死亡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠心功能受損，心肌有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫和膠原沉積，血清TNF-α、IL-6水平和心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)水平顯著增高；芍藥苷干預(yù)可改善急性心肌梗死大鼠心功能，減少心肌梗死面積，抑制膠原沉積和炎性因子的表達(dá)，在急性心肌梗死中發(fā)揮抗炎和心肌保護(hù)作用。

1為假手術(shù)組；2為模型組；3為曲美他嗪組；4為芍藥苷低劑量組；5為芍藥苷高劑量組圖8 假手術(shù)組和急性心肌梗死各組大鼠心肌組織中TGF-β1/Smad3信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)情況

表4 假手術(shù)組和急性心肌梗死各組大鼠心肌組織中TGF-β1、p-Smad3相對(duì)表達(dá)量比較

TGF-β參與骨形成過(guò)程、心臟瓣膜形成、纖維化進(jìn)程和癌癥進(jìn)程，其與肝、肺、腎和心臟纖維化的進(jìn)展密切相關(guān)，抑制TGF-β表達(dá)可阻滯纖維化的發(fā)展[15]。Xu等[16]研究報(bào)道，水蘇堿可通過(guò)抑制TGF-β1/Smads通路逆轉(zhuǎn)橫主動(dòng)脈縮窄導(dǎo)致的心肌膠原沉積，抑制心肌纖維化。Zhou等[17]報(bào)道，芍藥苷的心臟保護(hù)作用與抑制TGF-β/Smads和NF-κB途徑有關(guān)。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過(guò)抑制TGF-β1/Smad通路，減少膠原產(chǎn)生，從而減輕慢性心力衰竭大鼠心室重塑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、p-Smad3表達(dá)水平顯著增高，芍藥苷干預(yù)后心肌組織中TGF-β1、p-Smad3表達(dá)水平均顯著降低，提示芍藥苷可抑制TGF-β1/Smad3通路，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，芍藥苷可通過(guò)抑制TGF-β1/Smad3通路改善急性心肌梗死后心室重塑，為進(jìn)一步明確芍藥苷在急性心肌梗死中的作用機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的心肌梗死治療藥物提供了新的科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。