血府逐瘀湯對非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠GSK-3β與β-catenin表達(dá)的影響

王理槐，孫銀輝，張領(lǐng)兄，劉 歡，周 琴，袁蘇云，張亞茹，朱 樂，張 紅

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；3. 重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院，重慶 400000)

肺癌是常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在我國都位居惡性腫瘤之首[1]。肺癌的類型以非小細(xì)胞肺癌常見，占肺癌的80%以上[2]。中醫(yī)認(rèn)為非小細(xì)胞肺癌屬于“肺積”“咯血”范疇，由于正氣虛損、陰陽失調(diào)，邪毒外侵入肺，導(dǎo)致痰濁內(nèi)聚、氣滯血虛、肺氣郁阻，肺功能失調(diào)，日久形成肺部積塊。因此，肺癌的主要病機(jī)為氣滯、血瘀、毒凝[3-4]。血府逐瘀湯具有活血化瘀、行氣止痛兼清熱的功效，用于中晚期非小細(xì)胞肺癌可明顯改善血液高凝狀態(tài)，減輕癥狀，提高近期療效[5-6]，但其作用機(jī)制不明確。本研究基于與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的Wnt/β-catenin信號通路，觀察了血府逐瘀湯對非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)與β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達(dá)的影響，探討其治療非小細(xì)胞肺癌的作用及可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性健康SPF級8周齡C57BL/6小鼠32只，體重(23.16±1.38)g，購于湖南嘉泰實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2020-0006。所有小鼠均于恒溫(21～22 ℃)、恒濕(55%～65%)，安靜通風(fēng)的動物飼養(yǎng)室內(nèi)行適應(yīng)性飼養(yǎng)(喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料和蒸餾水)。

1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人非小細(xì)胞肺癌 A549細(xì)胞，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物 血府逐瘀湯由湖南中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院藥劑科提供，組方：桃仁12 g，紅花、當(dāng)歸、生地黃、牛膝各9 g，川芎、桔梗各5 g，赤芍、枳殼各6 g，柴胡、甘草各3 g。準(zhǔn)確稱取劑量，經(jīng)煎藥機(jī)煮成湯劑，濃縮成含生藥1 g/mL。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將人非小細(xì)胞肺癌 A549細(xì)胞解凍復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)基上，待其培養(yǎng)至對數(shù)生長期后用0.25%胰蛋白酶消化，再以1200r/min離心10 min，制成單細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液重懸，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL。在小鼠右側(cè)腋皮下接種0.2 mL細(xì)胞懸液，待腫瘤體積生長至100 mm3左右，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。模型組給予生理鹽水5 mL/kg腹腔注射和蒸餾水5 mL/kg灌胃，血府逐瘀湯低、中、高劑量組均在腹腔注射生理鹽水5 mL/kg后再分別予以血府逐瘀湯12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg灌胃，均1次/d，連續(xù)14 d。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1瘤重、腫瘤體積、生長抑制率 小鼠脫頸處死后盡量完整剝?nèi)∧[瘤，稱重，計(jì)數(shù)腫瘤體積和生長抑制率。 腫瘤體積=π×腫瘤組織長徑×短徑2/6。生長抑制率=(1-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%。

1.5.2腫瘤組織細(xì)胞凋亡率 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測：取1/3瘤體組織，用眼科剪剪碎后，以1 000 r/min離心5 min，取細(xì)胞懸液，再次離心取細(xì)胞沉淀，采用預(yù)冷的PBS重懸，采用annexin V碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)，嚴(yán)格按說明書中步驟操作，采用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并避光反應(yīng)10 min，之后滴加PI，4 ℃孵育30 min。使用BD Accuri C6 (BD Biosciences,San Jose,CA)流式細(xì)胞儀，在488 nm的激發(fā)下分析細(xì)胞早期和晚期凋亡情況。分別在530/30 nm和585/40 nm的發(fā)射通道中采集經(jīng)FITC和PI染色的細(xì)胞熒光信號，結(jié)果用FCS Express V4軟件(De Novo software,Glendale,CA)進(jìn)行處理。

1.5.3腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin蛋白表達(dá)情況 采用Western blot檢測：提取小鼠腫瘤組織蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉室溫封閉，分別加入兔源GSK-3β一抗(1∶1 500)、兔源β-catenin一抗(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育，ECL顯影，ChemiDoc MP成像。運(yùn)用Adobe Photoshop CS5軟件分析蛋白條帶灰度值，β-actin作為內(nèi)參。

1.5.4腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin mRNA表達(dá)情況 采用qTR-PCR檢測：提取小鼠腫瘤組織，采用組織研磨儀研磨制備細(xì)胞懸液。根據(jù)組織RNA提取試劑盒提取，參照反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR檢測，以GAPDH為內(nèi)參。相關(guān)引物序列：GSK-3β 上游引物5’-AGGCTGTGTGTTGGCTGAAT-3’，下游引物5’-TTTGCTCCCTTGTTGGTGTT-3’；β-catenin上游引物5’-GTTACGGCAATCAGGAAAGC-3’，下游引物5’-GACAGACAGCACCTTCAGCA-3’；GAPDH上游引物5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’，下游引物5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性30 s，共循環(huán)40次。使用相對量化方程2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠瘤重、腫瘤體積和生長抑制率比較血府逐瘀湯各劑量組瘤重、腫瘤體積均明顯低于模型組(P均<0.05)；血府逐瘀湯各劑量組瘤重、腫瘤體積呈劑量依賴性降低，生長抑制率呈劑量依賴性增高，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積和生長抑制率比較

2.2各組小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡率比較 血府逐瘀湯各劑量組細(xì)胞凋亡率均明顯高于模型組(P均<0.05)，且血府逐瘀湯各劑量組細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性增高，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1及圖2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況

圖2 各組非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡率

2.3各組小鼠腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin蛋白表達(dá)情況比較 血府逐瘀湯各劑量組腫瘤組織中GSK-3β蛋白相對表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，β-catenin蛋白相對表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且血府逐瘀湯各劑量組GSK-3β與β-catenin蛋白相對表達(dá)量分別呈劑量依賴性增高和降低，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3及圖4。

圖3 各組非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin蛋白表達(dá)情況

圖4 各組非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin蛋白相對表達(dá)量

2.4各組小鼠GSK-3β與β-catenin mRNA表達(dá)量比較 血府逐瘀湯各劑量組腫瘤組織中GSK-3β mRNA相對表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，β-catenin mRNA相對表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且血府逐瘀湯各劑量組GSK-3β與β-catenin mRNA相對表達(dá)量分別呈劑量依賴性增高和降低，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖5。

圖5 各組非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin mRNA相對表達(dá)量

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為，正氣內(nèi)虛，肺氣虧損，外邪侵入，客邪留滯不去，致肺部血瘀氣滯，結(jié)而成塊；或煙毒內(nèi)侵，熱灼津液，陰液內(nèi)耗，致肺陰虧損，久則氣陰虧虛，而致痰濕瘀血凝結(jié)；或邪毒侵肺，毒瘀互結(jié)，久則形成腫塊；或痰濕聚肺，肺氣宣降失常，導(dǎo)致氣血瘀阻。故而正氣內(nèi)虛、陰陽失調(diào)是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌的內(nèi)因，邪毒內(nèi)侵是外因，氣滯、血瘀、痰凝、毒聚是病理產(chǎn)物[7-8]。血府逐瘀湯方中桃仁、紅花破血行氣、化瘀止痛；牛膝活血通經(jīng)，引血下行；赤芍、川芎活血行氣，助桃仁、紅花活血化瘀止痛；柴胡疏肝解郁，兼升清陽，同桔梗、枳殼共用理氣去滯作用尤佳，且可載藥上行，使藥效達(dá)于胸肺；生地、當(dāng)歸養(yǎng)血益陰又具清熱之功，避免藥性溫燥；甘草調(diào)和諸藥。全方活血化瘀、行氣，血行瘀化有利于新血復(fù)生，氣血和調(diào)，改善機(jī)體氣滯、血瘀、痰凝、毒聚。張嵐等[9]報(bào)道，生脈飲合血府逐瘀湯加減治療可明顯改善非小細(xì)胞肺癌患者血液的高凝狀態(tài)，可通過下調(diào)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平達(dá)到抗腫瘤的效果。本課題組通過制備肺癌荷瘤小鼠模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示血府逐瘀湯各劑量組瘤重、腫瘤體積均明顯低于模型組，且各劑量組瘤重、腫瘤體積呈劑量依賴性降低，生長抑制率呈劑量依賴性增高。說明血府逐瘀湯能夠有效抑制非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，且作用與血府逐瘀湯劑量有一定關(guān)系。

GSK-3β是Wnt/β-catenin信號通路中的一種重要激酶，能夠抑制通路的信號傳導(dǎo)[10-11]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵分子，在細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡中發(fā)揮重要作用[12]。肺癌干細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路活性上調(diào),GSK-3β表達(dá)水平下降,p-GSK3β(Ser9)和β-catenin表達(dá)水平上升，GSK-3β能夠調(diào)控β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的磷酸化和降解，上調(diào)GSK-3β有利于抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[13-14]。方煒等[15]通過檢測肺癌組織標(biāo)本中Wnt、β-catenin、c-myc蛋白及mRNA表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin/c-myc通路活化程度與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間存在密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血府逐瘀湯各劑量組腫瘤組織中GSK-3β蛋白及mRNA相對表達(dá)量均明顯高于模型組，β-catenin蛋白及mRNA相對表達(dá)量均明顯低于模型組，且各劑量組GSK-3β和β-catenin蛋白及mRNA相對表達(dá)量呈劑量依賴性增高和降低。說明血府逐瘀湯能夠上調(diào)GSK-3β表達(dá)，下調(diào)β-catenin表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號通路活性。

綜上所述，血府逐瘀湯可能通過上調(diào)GSK-3β表達(dá)，下調(diào)β-catenin表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號通路活性達(dá)到抑制腫瘤組織生長和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，且作用與血府逐瘀湯劑量有一定關(guān)系。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。