基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探尋蛇床子改善睡眠的分子機(jī)制

郭晉良，馮瑪莉

（山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012）

睡眠是人不可或缺的生命活動(dòng)，機(jī)體通過充足的睡眠來保證生命各項(xiàng)功能的正常與穩(wěn)定［1］。隨著社會(huì)發(fā)展及生活方式的轉(zhuǎn)變，人們壓力逐漸增大，致使失眠人群逐年增多，發(fā)病率高達(dá)為30%～35%［2］。長期睡眠不足，不僅造成生理機(jī)能紊亂，影響人們身心健康及生活質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)還將并發(fā)高血壓、心絞痛等各種疾病，甚至死亡。目前廣泛用于臨床的鎮(zhèn)靜催眠化學(xué)藥物，短期療效好、靶點(diǎn)單一明確，但長期口服后出現(xiàn)耐藥性、成癮性等，副反應(yīng)大且很難以從根本上提高睡眠質(zhì)量［3，4］。故從中藥材或天然藥物中尋求催眠作用顯著的活性成分，從突觸傳遞、受體信號(hào)通路、膜電位、神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬镞^程調(diào)節(jié)探索其作用機(jī)制，為現(xiàn)代新型治療睡眠障礙藥物的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

蛇床子為傘形科蛇床屬植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實(shí)。除傳統(tǒng)已知功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其在神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、中樞抑制、鎮(zhèn)靜催眠等方面效果顯著［5-7］，馬瀾等［8］對(duì)蛇床子的宿醉反映及耐受性做了相關(guān)探究，發(fā)現(xiàn)蛇床子鎮(zhèn)靜催眠作用顯著，且宿醉反應(yīng)和耐受性等較地西泮小，可見它在改善睡眠方面具有較好的臨床應(yīng)用前景，此外對(duì)其香豆素類成分的安神功效、催眠作用及其機(jī)制做了相關(guān)研究［9，10］，但由于實(shí)驗(yàn)的局限性，目前活性成分及其作用機(jī)制尚不完全清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于大數(shù)據(jù)的分析平臺(tái)，通過篩選中藥中有效化合物成分，結(jié)合相關(guān)疾病數(shù)據(jù)，構(gòu)建出藥物作用于疾病的靶點(diǎn)及機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，對(duì)藥物作用及機(jī)制的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘［11，12］。應(yīng)用多種數(shù)據(jù)庫及相關(guān)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，以直觀反映藥物與疾病的關(guān)聯(lián)程度，預(yù)測出藥物在體內(nèi)的靶蛋白及相互作用蛋白，同時(shí)分析這些蛋白所涉及的信號(hào)通路［13，14］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)探索蛇床子催眠作用可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫

中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php）；Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：// www.uniprot.org/）；Drugbank（https：//www. drugbank. ca/）；Gene Cards（https：//www.genecards.org/）；venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；String 數(shù)據(jù)庫（https：// string-db.org/，Version 11.0）；Metascape 數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）.

1.2 分析軟件

Cytoscape 3.7.2 軟件；Omicshare 軟件（https：//www.omicshare.com/tools/）.

1.3 蛇床子活性成分篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“蛇床子”，將口服生物利用度（OB）＞30%，類藥性（DL）＞0.18作為篩選條件，檢索出蛇床子的有效活性成分。

1.4 蛇床子有效成分的靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP 的相關(guān)靶點(diǎn)的檢索功能，依次輸入蛇床子有效活性成分對(duì)應(yīng)的MOL ID，得到200種主要活性成分對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值最終獲得55 種靶點(diǎn)，將所獲得的靶點(diǎn)名稱輸入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫，選擇“reviewed”信息及“human”物種限定，檢索這些靶點(diǎn)名稱對(duì)應(yīng)的Gene Symbol 備用。

1.5 失眠相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以疾病名稱“insomnia”分別在Drugbank、Gene Cards 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將篩選結(jié)果歸納并去除重復(fù)基因，得到與失眠相關(guān)的靶基因。

1.6 蛇床子有效成分-失眠-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別上傳藥物潛在靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)名稱于Uniprot 數(shù)據(jù)庫，選擇“reviewed”信息，種屬“Human”，獲取靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名；二者篩選后的靶點(diǎn)上傳至https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/繪制韋恩圖取交集；將上述信息處理后上傳至Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建蛇床子活性成分-疾病-靶點(diǎn)圖。

1.7 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點(diǎn)篩選

將蛇床子的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，默認(rèn)交互作用大于0.4 的靶點(diǎn)，勾選隱藏游離節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建出蛇床子改善失眠癥狀的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。下載文件信息輸入到Cytoscape 3.7.2 軟件中，根據(jù)節(jié)點(diǎn)重要性，調(diào)整對(duì)應(yīng)圖形大小，最終輸出可視化圖，以確定蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.8 催眠生物過程與通路富集分析

將蛇床子治療失眠的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)，物種Homo sapiens”，選擇個(gè)性化分析，設(shè)置P＜0.01，對(duì)蛇床子催眠作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路的富集分析，排名靠前的催眠生物過程使用Omicshare 軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子主要活性成分及作用靶點(diǎn)

利用TCMSP 檢索OB＞30%、DL＞0.18 的活性成分19 種，見表1，根據(jù)MOL ID 找到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)200 個(gè)，刪除重復(fù)值保留55 個(gè)靶點(diǎn)信息，經(jīng)Gene-Cards，Drugbank 檢索與失眠相關(guān)。應(yīng)用在線韋恩圖制作網(wǎng)站將蛇床子活性成分靶點(diǎn)和與失眠相關(guān)的作用靶點(diǎn)取交集，韋恩圖見圖1，共得到潛在作用靶點(diǎn)27個(gè)，分別是CHRM1、GABRA1、PIK3CG、MAOB、PTGS1、KCNH2、DRD1、CHRM3、GABRA2、CHRM4、ADRB2、SLC6A4、OPRM1、CHRNA7、ESR1、AR、GSK3B、CHRM2、ADRA1B、ADRA2A、SLC6A2、SLC6A3、PLAU、ADRB1、HTR2A、ADRA1A、GABRA3。對(duì)應(yīng)的活性成分12個(gè)，即ammidin、xanthoxylinN、（E）-2，3-bis（2-keto-7-methoxy-chromen-8-yl）acrolein、stigmastero、prangenidin、o-isovalerylcolum bianetin、O-acetylcolumbianetin、diosmetin、cniforin A、cnidimol B、beta-sitosterol、ar-curcumene.

圖1 蛇床子活性成分-失眠-靶點(diǎn)韋恩圖Fig 1 Active component of Fructus cnidii - insomnia -target Venn plot

表1 經(jīng)OB 和DL 篩選的蛇床子活性成分Tab 1 Active components of Fructus cnidii screened by OB and DL

2.2 活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2 所示。

圖2 活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Active ingredient- disease - target network

其中中心“圓形”表示失眠疾病名稱，“綠色三角”表示蛇床子12 種活性成分，“紅色倒三角形”表示失眠作用靶點(diǎn)。連接線越多圖形顯示越大，越能直觀反映關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)信息。12 種活性成分與27 個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)，其中stigmasterol、O-acetylcolumbianetin、o-isovalerylcolum bianetin、xanthoxylin N、prangenidin、beta-sitosterol 作用靶點(diǎn)多，而對(duì)應(yīng)活性成分較多的靶點(diǎn)分別是：PTGS1、PIK3CG、GABRA1、CHRM1、CHRM3、ESR1 這些可能為蛇床子改善失眠的關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將蛇床子的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，物種“人”，選擇交互作用大于0.4 的靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，如圖3 所示，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，邊代表靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)，粗細(xì)代表關(guān)聯(lián)分值不同，若邊越粗，則關(guān)聯(lián)分值也越大，不同顏色區(qū)分不同證據(jù)類型。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，共27 個(gè)節(jié)點(diǎn)，78 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為5.78，平均局部聚類系數(shù)0.534。 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入catosape 軟件進(jìn)一步直觀分析，其中SLC6A4、ADRA1B、HTR2A、SLC6A2、CHRM1、CHRM2 等為網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)，在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

圖3 蛇床子靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Target protein interaction network of Fructus cnidii

2.4 生物功能與通路富集分析

使用Metascape 數(shù)據(jù)庫對(duì)蛇床子治療失眠的27 個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 注釋分析和KEGG 通路分析，并且通過Omicshare 進(jìn)行可視化分析。結(jié)果見圖4。

圖4 GO 富集分析Fig 4 GO enrichment analysis

GO 注釋分析包括3 部分，分別為生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（celluar component，CC）、分子功能（molecular function，MF）［15］。GO分析顯示，在生物過程方面，這些靶點(diǎn)涉及化學(xué)突觸傳遞（chemical synaptic transmission）、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路，偶聯(lián)環(huán)核苷酸對(duì)膜電位的二次信息調(diào)節(jié)（G protein-coupled receptor signalinq pathway，coupled to cyclic nucleotide second messenger）、膜電位調(diào)節(jié)（regulation of membrane potential）、神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸（neurotransmitter transport）、單胺運(yùn)輸（monoamine transport）、離子輸運(yùn)調(diào)節(jié)（requlation of ion transport）、developmental growth、突觸傳遞的正調(diào)控（positive requlation of synaptic transmission）、細(xì)胞對(duì)有機(jī)循環(huán)化合物的反應(yīng)（cellular response to organic cyclic compound）、內(nèi)存調(diào)節(jié)（memory）、體液水平調(diào)節(jié)（regulation of body fluid levels）、信號(hào)受體的活動(dòng)調(diào)節(jié)（requlation of signaling receptor activity）、organ growth、response to ethanol、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)（requlation of calcium ion transmembrane transport）等生物過程。在CC 分析中靠前的分別是突觸后膜（postsynaptic membrane）、膜筏（membrane raft）、谷氨酸突觸（glutamatergic synapse）、樹突膜（dendrite membrane）、細(xì)胞質(zhì)囊泡膜（cytoplasmic vesicle membrane）等細(xì)胞組分。分子功能方面涉及G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性（G protein-coupled amine receptor activity）、腎上腺素能受體的活動(dòng)（adrenergic receptor activity）、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性參與調(diào)控突觸后膜電位（neurotransmitter receptor activity involved in requlation of postsynaptic membrane potential）、銨離子結(jié)合氯離子（ammonium ion binding）、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性（chloride transmembrane transporter activity） 、β-連 環(huán) 蛋 白（beta-catenin binding）、綁定陽離子通道活動(dòng)（cation channel activity）、蛋白域特異性結(jié)合（protein domain specific binding）等分子功能。

KEGG 通路分析顯示，見圖5。蛇床子催眠靶點(diǎn)涉及靠前的通路主要有刺激神經(jīng)組織中的交互通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣信號(hào)通路（calcium signaling pathway）、膽堿能突觸（cholinergic synapse）、CGMP-PKG 信號(hào)通路（CGMP-PKG signaling pathway）、嗎啡成癮（morphine addiction）、含血清素的神經(jīng)突觸（serotonergic synapse）、多巴胺能神經(jīng)突觸信號(hào)（dopaminergic synapse）等信號(hào)通路。

3 討論

失眠中醫(yī)稱“不寐”，陽不入陰，虛陽外浮而夜寤不寐，蛇床子具有補(bǔ)腎壯陽功效，虛陽之體通過溫補(bǔ)腎陽達(dá)到陰平陽秘，陽入于陰而不寐自愈［16］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明蛇床子具有中樞抑制作用［17］，仝立國等［18］利用指紋圖譜與藥效相關(guān)性分析蛇床子鎮(zhèn)靜催眠活性目標(biāo)化合物，包括蛇床子素、歐前胡素外，新發(fā)現(xiàn)佛手柑內(nèi)酯、異虎耳草素等5 種具催眠活性的單體成分。

本次篩選得到蛇床子19 個(gè)有效活性成分，其中12 個(gè)具有潛在調(diào)節(jié)睡眠作用。作用靶點(diǎn)較多的個(gè)活性成分為stigmasterol、O-acetylcolumbianetin、o-isovalerylcolum bianetin、xanthoxylin N、prangenidin、beta-sitosterol，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其總香豆素類成分鎮(zhèn)靜催眠作用［9］。對(duì)應(yīng)活性成分較多的靶點(diǎn)PTGS1、PIK3CG、GABRA1、CHRM1、CHRM3、ESR1 可能為蛇床子改善失眠的關(guān)鍵活性成分和作用靶點(diǎn)。PTGS1 為環(huán)氧合酶-1 是化學(xué)藥佐匹克隆治療失眠的作用目標(biāo)酶之一，也可能為蛇床子改善睡眠的靶點(diǎn)目標(biāo)［19］。GABRA1 是大腦中主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸異五聚體受體的一個(gè)組成部分，抑制性γ-氨基丁酸能突觸的形成，它是大多數(shù)鎮(zhèn)靜催眠化學(xué)藥物的目標(biāo)受體，例如安定、佐匹克隆等藥物［20］，推測蛇床子作用受體相同。ESR1是雌激素受體蛋白，雌激素分泌水平影響睡眠，女性絕經(jīng)期會(huì)引發(fā)更年期潮熱、盜汗等導(dǎo)致入睡困難，因而蛇床子可能通過作用于這種蛋白，調(diào)節(jié)更年期的睡眠障礙［21，22］。

本文通過富集分析得出蛇床子主要的12 個(gè)活性成分作用于27 個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)，作用于刺激神經(jīng)組織的中的交互通路、鈣信號(hào)通路、膽堿能突觸、CGMP-PKG 信號(hào)通路含血清素的神經(jīng)突觸、多巴胺能神經(jīng)突觸信號(hào)等信號(hào)通路發(fā)揮作用。該過程涉及GO 分析所得的化學(xué)突觸傳遞、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路，偶聯(lián)環(huán)核苷酸對(duì)膜電位的二次信息調(diào)節(jié)、膜電位調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸、單胺運(yùn)輸、離子輸運(yùn)調(diào)節(jié)、突觸傳遞的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)有機(jī)循環(huán)化合物的反應(yīng)、內(nèi)存調(diào)節(jié)、體液水平調(diào)節(jié)、信號(hào)受體的活動(dòng)調(diào)節(jié)、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)生物過程。G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素能受體的活動(dòng)、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性參與調(diào)控突觸后膜電位、銨離子結(jié)合氯離子、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、β-連環(huán)蛋白、綁定陽離子通道活動(dòng)、蛋白域特異性結(jié)合等分子功能。突觸后膜、膜筏、谷氨酸突觸、樹突膜、細(xì)胞質(zhì)囊泡膜等細(xì)胞組分。SLC6A4、ADRA1B、HTR2A、SLC6A2、CHRM1、CHRM2等靶標(biāo)是PPI 網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶蛋白，這些靶點(diǎn)也是核心調(diào)控基因。SLC6A4 為血清素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要功能包括通過將血清素分子從突觸間隙轉(zhuǎn)運(yùn)回突觸前末端進(jìn)行再利用來調(diào)節(jié)血清素能信號(hào)，在調(diào)節(jié)血清素對(duì)血清素能系統(tǒng)的其他受體的可用性中起著關(guān)鍵作用，藥物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)5-羥色胺水平可改善睡眠［23-25］。ADRA1B 作為G 蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，通過與激活磷脂酰肌醇-鈣第二信使系統(tǒng)的G 蛋白結(jié)合來介導(dǎo)發(fā)揮作用，它是去甲腎上腺素的主要靶受體之一，蛇床子可能通過抑制其釋放可調(diào)節(jié)睡眠［26］。HTR2A 為5-HT 的G 蛋白偶聯(lián)受體［27］，可作為各種藥物和精神活性物質(zhì)的受體，通過鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)以調(diào)節(jié)下游效應(yīng)物的活性［28］，同時(shí)，信號(hào)可激活磷脂酶和磷脂酰肌醇-鈣第二信使系統(tǒng)，用于調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶的活性并促進(jìn)鈣的釋放影響神經(jīng)活動(dòng)，從而在行為調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，包括對(duì)精神活性物質(zhì)的反應(yīng)及失眠情況［29］。SLC6A2 為胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過去甲腎上腺素的高親和力鈉依賴性進(jìn)入突觸前末端來減少突觸部位去甲腎上腺素的降解，延長神經(jīng)遞質(zhì)的興奮性，蛇床子可能通過提高去甲腎上腺素的作用時(shí)間調(diào)節(jié)睡眠［30，31］。睡眠調(diào)節(jié)還涉及分布在大腦區(qū)域的特殊神經(jīng)元之間相互依賴的信號(hào)傳遞，而膽堿能通路對(duì)于快速眼動(dòng)睡眠是必需的，并且Niwa 等［32］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表明毒蕈堿乙酰膽堿受體CHRM1 和CHRM3對(duì)睡眠調(diào)節(jié)至關(guān)重要，尤其是對(duì)快速眼動(dòng)睡眠。CHRM2 作為毒蕈堿乙酰膽堿受體，同樣可對(duì)睡眠進(jìn)行調(diào)節(jié)［33］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測了蛇床子催眠的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、關(guān)鍵靶標(biāo)及信號(hào)通路，明確其發(fā)揮作用化學(xué)成分。通過建立蛇床子藥效成分-失眠-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，多角度探索蛇床子改善睡眠的潛在作用機(jī)制，通過調(diào)控相關(guān)生物過發(fā)揮其改善失眠的功能。雖有部分成分及靶蛋白有相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但通路有待進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)的確證，仍需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證與支持。

作者貢獻(xiàn)度說明：

郭晉良：論文撰寫及修改；馮瑪莉：提出修改建議。