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    基于MAPK/ERK 信號通路探討冷凍消融對肺癌小鼠的作用機制

    2022-04-02 06:01:38林事成劉殿娜周相男莊垚雪梁天宇王瀟凡胡凱文孫靜宜李泉旺
    關(guān)鍵詞:消融肺癌通路

    林事成,劉殿娜,周相男,莊垚雪,梁天宇,王瀟凡,胡凱文,孫靜宜,李泉旺

    (1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腫瘤科,北京 100078)

    根據(jù)2020 年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計,肺癌是死亡率最高的惡性腫瘤,2020 年死亡人數(shù)高達(dá)180 萬,遠(yuǎn)超其他惡性腫瘤[1]。手術(shù)切除作為早期肺癌首選方法,然而肺癌起病隱匿,大多肺癌發(fā)現(xiàn)時已屬晚期,失去手術(shù)機會。近年來冷凍消融作為新興靶向治療手段,在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中被證實療效顯著。冷凍消融治療中發(fā)現(xiàn)除了物理直接殺傷腫瘤作用,還能降低腫瘤侵襲力,降低腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率,激活抗腫瘤免疫,但對其具體作用機制及分子水平的變化,尚缺乏進(jìn)一步的研究。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是表皮生長因子受體(EGFR)的重要下游,表皮生長因子受體接收細(xì)胞外生長、增殖信號通過MAPK/ERK 信號通路傳遞到細(xì)胞核,從而導(dǎo)致細(xì)胞生長、生存、修復(fù)與增殖[2]。研究表明腎癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤中MAPK/ERK 信號異常激活[3-5]。本研究通過建立Lewis 肺腺癌小鼠皮下移植瘤模型探討冷凍消融對MAPK/ERK 信號通路的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及細(xì)胞

    雄性C57BL/6 小鼠10 只,6~8 周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010,本實驗中所有的實驗動物被飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實驗動物中心,SPF 級飼養(yǎng)環(huán)境,動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行,批號為202020。小鼠肺癌Lewis 細(xì)胞株,購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

    1.2 主要實驗材料及設(shè)備

    DMEM 高糖培養(yǎng)基購自Hyclone 公司;胎牛血清購自默克公司;胰蛋白酶及青鏈霉素混合液購自GIBCO 公司;RIPA(強)裂解液購自碧云天公司;BCA 蛋白定量試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;Reveraid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自賽默飛公司;SYBR qPCR SuperMix Plus 試劑盒購自Novoprotein 公司;NucleoZol RNA提取試劑購自基因公司;KRAS、RAF1、ERK1/2、P-ERK1/2 多克隆抗體均購自Proteintech 公司,P-RAF1、P-MEK1 均購自Abcam 公司,MEK1 多克隆抗體購自Santa Cruz 公司,山羊抗兔(鼠)IgG 二抗均購自Proteintech 公司;氬氦刀冷凍治療系統(tǒng)及1.2 mm 冷凍刀頭(美國Endocare 公司);熒光定量PCR 儀(美國ABI 7300),小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國BIO-RAD 公司1658033)。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及動物模型的建立

    Lewis 細(xì)胞用含10% 胎牛血清、1% 雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基,置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 天換液一次,細(xì)胞貼壁面積達(dá)70%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,取對數(shù)生長期Lewis細(xì)胞,胰酶消化,重懸,以每只小鼠0.2 mL 細(xì)胞懸液含2×106個細(xì)胞接種于小鼠右腿內(nèi)側(cè)皮下,1 周后游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑10 mm×10 mm,開始實驗。

    1.4 小鼠冷凍方案及分組

    將造模成功的小鼠隨機分為假手術(shù)組和冷凍消融組,每組各5 只,手術(shù)時將冷凍消融組小鼠麻醉,固定,備皮,消毒,切開皮膚,暴露腫瘤,1.2 mm冷凍刀頭插入腫瘤中央。采用雙循環(huán)冷凍方法:利用釋放氬氣將刀頭溫度迅速降低至-120℃冷凍10 s,隨后釋放氦氣復(fù)溫至15℃,重復(fù)上述冷凍消融循環(huán)1 次。假手術(shù)組小鼠麻醉固定后,切開皮膚,暴露腫瘤,直接縫合。兩組小鼠麻醉復(fù)蘇后繼續(xù)喂養(yǎng)小鼠,于14 d 后同時處死小鼠,取材,盡量完整剝離腫瘤組織。

    1.5 Western blot 檢測腫瘤組織中MAPK/ERK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

    取50 mg 剝離的小鼠腫瘤組織,將組織剪碎放入玻璃勻漿器中,加入RIPA 裂解液500 μL,反復(fù)研磨充分裂解組織蛋白,離心取上清液獲取總蛋白,采用BCA 蛋白濃度測定法檢測樣本蛋白含量,并將所有樣本總蛋白濃度調(diào)為3 μg/μL。樣本蛋白經(jīng)100 ℃8 min 高溫煮沸變性,進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,取30 μg 樣本上樣,100 V 恒壓電泳至條帶到底部,100 mA 恒流電轉(zhuǎn)100 min,取下轉(zhuǎn)好的PVDF 膜加入TBST 潤洗5 min×3 次,10%脫脂奶粉封閉1 h結(jié)合PVDF 膜上無關(guān)蛋白反應(yīng)位點,TBST 潤洗5 min×3 次,分別加入兔(鼠)多克隆蛋白一抗工作液KRAS(1∶5 000)、RAF1(1∶3 000)、MEK1(1∶200)、ERK1/2(1∶3 000)、P-RAF1(1∶3 000)、P-MEK1(1∶3 000)、P-ERK1/2(1∶3 000)、GAPDH(1∶50 000)室溫孵育1.5 h,TBST 潤洗5 min×3 次,加入山羊抗兔(鼠)二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,TBST 潤洗5 min×3 次,使用超敏ECL 發(fā)光液孵育PVDF 膜,調(diào)整曝光條件進(jìn)行顯影,保存圖片,采用Imagel J 軟件分析條帶灰度值。

    1.6 qRt-PCR 法檢測腫瘤組織中KRas 基因表達(dá)情況

    根據(jù)制造商說明書,取50 mg 腫瘤組織加入NucleoZol RNA 提取試劑500 μL,用玻璃勻漿器充分研磨,加入200 μL 無菌無酶水,渦旋15 s 后室溫靜置5 min,12 000g離心15 min,取上層清液于另一離心管中,加入500 μL 異丙醇,室溫靜置10 min,12 000g離心10 min,棄上清液,此時RNA 沉于管底,加入500 μL 75%乙醇8 000g離心3 min 洗滌RNA,用移液器吸除上層乙醇,再次加入75% 乙醇,干燥管中RNA,加入50 μL 無菌無酶水溶解提取到的RNA。紫外分光光度計測定OD260/OD280,計算各組總RNA 濃度,參照產(chǎn)品說明書使用引物Oligo(dT)18 primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,反應(yīng)時間為:42°C 60 min,70°C 5 min。使用SYBR Green作為熒光染料,以β-actinmRNA作為內(nèi)參,KRas引物上游:5′-TGTGGACGAATATGATCCAACA-3′,下游:5′-GCAAATACACAAAGAAAGCCCT-3′;β-actin引物上游:5′-CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3′,下游5′-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3′。使用ABI 7300 qRt-PCR 系統(tǒng)檢測相關(guān)mRNA的表達(dá),反應(yīng)程序為:95 ℃1 min,95 ℃20 s,60 ℃1 min,共40 個循環(huán),最后一步60°C 時記錄熒光信號,依程序設(shè)定溶解曲線,按照2-ΔΔCt計算KRasmRNA 的相對表達(dá)量。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

    統(tǒng)計數(shù)據(jù)選用SPSS 20.0,圖形構(gòu)建選用Graphpad Prism8.0,正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,正態(tài)分布且方差齊的兩組樣本采用兩獨立樣本t檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 冷凍消融對MAPK/ERK 通路相關(guān)蛋白的調(diào)控

    Western blot 結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,冷凍消融組KRAS 蛋白表達(dá)降低(P<0.05),非磷酸化蛋白RAF1、MEK1、ERK1/2 表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異,磷酸化蛋白P-RAF1、P-MEK1、P-ERK1/2 表達(dá)均受到抑制(P<0.05)。見圖1、表1。

    表1 兩組小鼠腫瘤中MAPK/ERK 通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平比較(n=5,±s)Tab 1 Comparison of MAPK / ERK pathway related protein expression in tumor of mice between two groups(n=5,±s)

    表1 兩組小鼠腫瘤中MAPK/ERK 通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平比較(n=5,±s)Tab 1 Comparison of MAPK / ERK pathway related protein expression in tumor of mice between two groups(n=5,±s)

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05。

    指標(biāo)KRAS/GAPDH P-RAF1/RAF1 P-MEK1/MEK1 P-ERK1/2 / ERK1/2假手術(shù)組0.866±0.060 1.475±0.211 2.437±0.286 1.106±0.082冷凍消融組0.471±0.233 0.931±0.132 1.485±0.678 0.733±0.171 t 2.842*4.884*2.896*4.412*

    圖1 兩組小鼠腫瘤組織中MAPK/ERK 通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量Fig 1 Relative expression of MAPK /ERK pathway related proteins in tumor tissues of mice in two groups

    2.2 冷凍消融對KRas mRNA 表達(dá)的影響

    qRt-PCR 結(jié)果表明,與假手術(shù)組小鼠相比,小鼠肺腺癌組織經(jīng)冷凍消融后腫瘤組織中KRasmRNA 表達(dá)降低(1.000±0.073vs.0.645±0.053)(t=6.825,P<0.05)。見圖2。

    圖2 兩組小鼠腫瘤組織中KRas mRNA 的表達(dá)情況Fig 2 Expression of KRas mRNA in tumor tissue of mice in two groups

    3 討論

    肺癌目前仍然位居我國惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率之首[6]。對于大部分失去手術(shù)切除機會的晚期患者,冷凍消融治療具有副作用小、局部微創(chuàng)、安全有效的特點,可以較好地控制肺癌的病情進(jìn)展,提高患者的生活質(zhì)量,減輕病痛,延長生存期。冷凍消融技術(shù)通常是利用氬氣或液氮等媒介迅速在病灶形成-140 ℃~-160 ℃的冰球,在腫瘤細(xì)胞內(nèi)外快速形成冰晶,逐漸復(fù)溫至30 ℃過程中冰晶消融,使腫瘤細(xì)胞破裂及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)理化變性,引起腫瘤組織的機械性損傷[7]。近年來人們研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞壞死產(chǎn)物會抑制殘余腫瘤的進(jìn)展,并可能影響到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤[8-10],冷凍消融對腫瘤的作用除了直接機械性損傷,可能涉及到更復(fù)雜的分子機制。本研究通過動物實驗,探究冷凍消融對腫瘤經(jīng)典信號通路MAPK/ERK 的影響,以期在臨床上對冷凍消融與分子靶向藥物的聯(lián)合治療有所指導(dǎo)。

    肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多階段、多步驟的過程,在腫瘤進(jìn)展的每個階段,細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的異常激活都起著重要作用[11]。目前針對肺癌研究較多的通路有MAPK 通路、PI3K/AKT 通路、DLL4-Notch1 通路、TGFβ/Smad 通路等,其中MAPK 信號通路是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的主要途徑,在肺癌的病情進(jìn)展中扮演重要角色。MAPK 通路有4種主要的分支路線:ERK、JNK、p38/MAPK 和ERK5。其中,MAPK/ERK 主要參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡、遷移,上游信號是著名的Ras 及Raf蛋白,Ras基因是一種原癌基因,是發(fā)現(xiàn)最早并且突變率最高的人類癌基因之一。KRas基因突變是肺癌中最常見的基因突變之一,約32%的非小細(xì)胞肺癌存在KRas 突變[12]。該信號通路主要是Ras 在細(xì)胞外信號刺激下,與三磷酸鳥苷結(jié)合而激活,從而使Raf 蛋白磷酸化活化,由Raf 再激活Mek,Mek 經(jīng)磷酸化最終激活Erk,只有p-Erk 才具有活性,p-Erk通過轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,激活多種轉(zhuǎn)錄因子和激酶,借此完成將細(xì)胞外刺激信號傳至細(xì)胞內(nèi)過程,引起一系列細(xì)胞反應(yīng),從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等。

    本研究結(jié)果表明,對Lewis 肺癌荷瘤小鼠冷凍消融與假手術(shù)組相比,冷凍消融可以直接抑制KRas基因的轉(zhuǎn)錄,減少了KRAS 蛋白的表達(dá),進(jìn)而引起下游RAF1、MEK1 蛋白磷酸化激活過程的抑制,最終抑制了ERK1/2 磷酸化表達(dá)的進(jìn)程,可能會引起腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移過程的抑制。

    正常情況下KRas表達(dá)受上游EGFR 受體傳遞胞外信息,肺癌中較常見的KRas基因突變,使KRas在無EGFR 外源信號刺激下仍處于激活狀態(tài),且不可控,持續(xù)的激活狀態(tài)將導(dǎo)致腫瘤的無序增殖。因而KRas 基因突變影響了EGFR-TKI 靶向治療的療效,而本次實驗結(jié)果提示冷凍消融除了具有直接機械殺傷腫瘤細(xì)胞的作用,還可以抑制KRas基因的表達(dá),抑制MAPK/ERK 信號通路的活化。KRas基因突變患者在接受冷凍消融后聯(lián)合EGFR-TKI 靶向用藥可能有更好的療效。

    綜上所述,冷凍消融可以通過下調(diào)KRas基因的表達(dá),負(fù)向調(diào)控MAPK/ERK 信號通路,可能與冷凍消融抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移相關(guān)。由于MAPK/ERK 信號通路作為表皮生長因子受體(EGFR)的重要下游通路,冷凍消融與EGFR 靶向藥物聯(lián)合治療可能會產(chǎn)生增敏效果,進(jìn)一步提高療效,而這需要我們進(jìn)一步研究探索。

    作者貢獻(xiàn)度說明:

    林事成:實驗方案的設(shè)計,小鼠喂養(yǎng),小鼠冷凍消融手術(shù)主刀,進(jìn)行各項指標(biāo)檢測,文章撰寫;劉殿娜:完善實驗方案,指導(dǎo)小鼠冷凍消融實驗的進(jìn)行,指導(dǎo)相關(guān)檢測實驗;周相男:協(xié)助完成各項指標(biāo)檢測,檢查修改論文;莊垚雪:協(xié)助小鼠冷凍實驗,小鼠取材,協(xié)助提總蛋白,提總RNA,WB 檢測,PCR 檢測;梁天宇:協(xié)助小鼠冷凍實驗,小鼠取材,協(xié)助WB檢測;王瀟凡:協(xié)助小鼠冷凍實驗,小鼠取材,協(xié)助PCR 檢測;胡凱文:課題設(shè)計及校審;孫靜宜:購買實驗耗材,協(xié)助完成WB 和PCR 檢測,整理數(shù)據(jù);李泉旺:課題負(fù)責(zé)人,提供文章整體思路,完善實驗方案,修改論文。

    所有作者聲明沒有利益沖突。

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