杵針對糖尿病周圍神經(jīng)病變Keap1/Nrf2/ARE通路及氧化應(yīng)激的影響研究

王 芳，楊 慧，廖順琪，王 瑤，王 寒，翁夕媚，黃亞玲

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075）

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是指糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者出現(xiàn)的周圍神經(jīng)損傷癥狀和/或體征，不包括其他原因所致的神經(jīng)病變，其中至少50%的DM 患者發(fā)生DPN［1，2］。DPN 主要影響四肢遠(yuǎn)端對稱感覺功能，是引起下肢潰瘍、非創(chuàng)傷性截肢的重要原因。目前的研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是DPN 的啟動因素。在高血糖狀態(tài)下，活性氧（reactive oxygen，ROS）和糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）顯著增加，使得機(jī)體的抗氧化防御能力減弱，損傷組織細(xì)胞，破壞血管內(nèi)皮功能，最終引起缺血性神經(jīng)損傷［3］。其中Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Keap1）/核因子相關(guān)因子2（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）是氧化應(yīng)激關(guān)鍵通路，是否能通過調(diào)控該信號通路，達(dá)到抑制氧化應(yīng)激的作用，從而保護(hù)和修復(fù)DPN 神經(jīng)損傷成為研究熱點(diǎn)。國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)李氏杵針是四川省名老中醫(yī)李仲愚教授家傳秘法。杵針療法應(yīng)用特殊針具和手法，通過刺激其特殊穴位和體表腧穴，作用于經(jīng)絡(luò)、臟腑，引導(dǎo)經(jīng)氣運(yùn)行，促進(jìn)經(jīng)絡(luò)氣血的流通。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)杵針可改善DPN 患者的感覺神經(jīng)功能及臨床癥狀，并且患者依從性高［4，5］，但其作用機(jī)制尚不明確。本次研究從氧化應(yīng)激的角度，揭示杵針治療DPN 的機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2021 年4～9 月從成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)院內(nèi)分泌科選擇符合納入標(biāo)準(zhǔn)的住院患者60 例，按1∶1 的分配比例隨機(jī)到對照組和杵針組。由一名獨(dú)立人員進(jìn)行隨機(jī)分組，使用計(jì)算機(jī)生成隨機(jī)數(shù)（1 到60）。并規(guī)定抽到奇數(shù)號的受試者納入杵針組，偶數(shù)號的受試者納入對照組。然后，將隨機(jī)數(shù)密封在不透明信封中，讓患者提取密封的數(shù)字。杵針組30 例，男性17 例，女性13 例，年齡59～75 歲，平均（66.72±5.47）歲，糖尿病病程2～18 年，平均（9.79±4.45）年，DPN 病程1～9 年，平均（4.98±3.56）年；對照組30 例，男性16 例，女性14 例，年齡49～75 歲，平均（63.87±6.46）歲、糖尿病病程3～18 年，平均（10.75±3.67）年，DPN 病程2～9 年，平均（5.43±2.46）年。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究設(shè)計(jì)符合人體試驗(yàn)倫理標(biāo)準(zhǔn)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批件號：2021KL-107。所有患者在干預(yù)前簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

所有患者符合中華醫(yī)會學(xué)糖尿病學(xué)分會《中國2 型糖尿病防治指南》（2020 年）對2 型糖尿病及DPN 的診斷依據(jù)［6］。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）患者符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡18～75歲；（3）意識清醒，配合檢查及治療者；（4）自愿參加本研究并簽署知情同意書者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）合并重要臟器嚴(yán)重疾??；（2）糖尿病急性并發(fā)癥者；（3）取穴施杵部位皮膚受損者；（4）妊娠或哺乳期婦女。

1.5 病例剔除和中止

（1）未按研究方案進(jìn)行常規(guī)治療及杵針干預(yù)者；（2）不愿繼續(xù)參加者；（3）病情惡化，或并發(fā)其他嚴(yán)重疾病的病例者。

1.6 治療方法

1.6.1 對照組 對照組在常規(guī)降糖、降脂等治療的基礎(chǔ)上使用α-硫辛酸（規(guī)格：12 mL∶300 mg），給藥方式靜脈滴注，1 次/d。

1.6.2 杵針組 在對照組的基礎(chǔ)上采用杵針治療。

1.6.2.1 杵針針具 杵針療法的器具：包括奎星筆、金剛杵、七曜混元杵、五星三臺杵。見圖1。

圖1 杵針療法器具Fig 1 Pestle and needle therapy apparatus

1.6.2.2 杵針選穴 根據(jù)《杵針學(xué)》［7］、《針灸學(xué)》［8］及相關(guān)的糖尿病及針灸專家咨詢結(jié)果，確定杵針主穴為至陽八陣（至陽到膈關(guān)穴的距離所布的八陣）、命門八陣（命門到志室穴的距離所布的八陣）、河車命強(qiáng)段以（總7 條線，分別以中線左右旁開0.5 寸、1.5寸、3 寸畫線）并配以足三里、三陰交、太溪、涌泉。見圖2。

圖2 杵針選穴示意圖Fig 2 Schematic diagram of acupoints

1.6.2.3 杵針操作手法 施杵的方法按《杵針學(xué)》所述的操作規(guī)范。根據(jù)穴位的特點(diǎn)選擇適宜的操作手法，每種操作手法均以7 次為一個循環(huán)。（1）患者俯臥于床上，至陽八陣穴用五星三臺杵尖反復(fù)叩擊，如雀啄食。以叩至皮膚潮紅為度，約3～5 min；用七曜混元杵的針柄緊貼施術(shù)腧穴皮膚，作從中宮至外八陣的太極運(yùn)轉(zhuǎn)，重復(fù)操作，約3～5 min。（2）命門八陣穴的操作手法同1。（3）應(yīng)用七曜混元杵針尖循行于河車命強(qiáng)段的7 條線上，作左右分推，上下推退的分理手法，約5 min。再使用五星三臺杵尖反復(fù)叩擊7 條線，約2 min。（4）取仰臥位，持金剛杵杵尖貫力達(dá)于足三里，向下行杵，隨后緩慢上提，但針尖不能離開皮膚，行開闔手法。約2～3 min；再持奎星筆行點(diǎn)叩手法，約2～3 min；最后持五星三臺杵針柄行運(yùn)轉(zhuǎn)手法約2～3 min。（5）三陰交、太溪、涌泉杵針治療手法同足三里。杵針治療每日一次每次約30 min，5 次一個療程，期間休息2 d，共治療4 個療程。

1.7 觀察指標(biāo)

檢測氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)：比色法檢測血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的含量；ELISA 法測定血清Keap1/Nrf2/ARE 信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平；RT-PCR 檢測Keap1、Nrf2mRNA 表達(dá)。分別于治療前后各采血5 mL，送至本院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后血清SOD、GSH-px 含量比較

與治療前相比，治療后對照組和杵針組SOD 含量顯著升高（t=-2.467，P=0.043；t=-3.642，P=0.008），血清GSH-px 含量也顯著升高（t=-4.163，P=0.004；t=-7.728，P＜0.001）；治療后，與對照組相比，杵針組SOD、GSH-px 含量明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組治療前后SOD 和GSH-px 含量比較（U/mL，n=30，±s）Tab 1 SOD and GSH-px levels before and after treatment in the two groups（U/mL，n=30，±s）

表1 兩組治療前后SOD 和GSH-px 含量比較（U/mL，n=30，±s）Tab 1 SOD and GSH-px levels before and after treatment in the two groups（U/mL，n=30，±s）

注：與治療前比較，*P＜0.05。

組別對照組杵針組SOD治療前73.56±7.94 67.77±20.01-0.761 0.466治療后76.21±6.17*85.40±8.94*2.392 0.031 tP GSH-px治療前230.46±40.08 248.41±45.47 0.838 0.416治療后240.51±36.27*282.23±38.74*2.223 0.043

2.2 兩組治療前后血清Keap1、Nrf2 因子含量比較

與治療前相比，治療后對照組Keap1、Nrf2 含量無明顯改變（t=1.946，P=0.093；t=-2.072，P=0.077），杵針組Keap1 表達(dá)量顯著降低（t=8.039，P＜0.001），Nrf2 含量明顯升高（t=-7.874，P＜0.001）。治療后，杵針組Keap1 含量明顯低于對照組，Nrf2 含量明顯高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組治療前后Keap1和Nrf2含量比較（pg/mL，n=30，±s）Tab 2 Keap1 and Nrf2 levels before and after treatment in the two group（pg/mL，n=30，±s）

表2 兩組治療前后Keap1和Nrf2含量比較（pg/mL，n=30，±s）Tab 2 Keap1 and Nrf2 levels before and after treatment in the two group（pg/mL，n=30，±s）

注：與治療前比較，*P＜0.05。

組別Keap1治療前430.93±34.85 Nrf2治療前284.85±43.80治療后423.93±37.87對照組治療后294.90±39.61杵針組339.08±74.79*349.51±46.93*tP 393.13±77.71-1.255 0.230 2.515 0.025-2.915 0.011 281.00±66.12-0.137 0.893

2.3 兩組治療前后血清Keap1、Nrf2 mRNA 表達(dá)量比較

與治療前相比，治療后對照組Keap1、Nrf2mRNA 表達(dá)量無明顯改變（t=0.989，P=0.356；t=-0.674，P=0.0.50），杵針組Keap1mRNA 表達(dá)量顯著降低（t=-2.629，P=0.002），Nrf2mRNA表達(dá)量明顯升高（t=4.640，P=0.047）；治療后，杵針組Keap1mRNA 表達(dá)量明顯低于對照組，Nrf2mRNA 表達(dá)量明顯高于于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組治療前后Keap1 mRNA 和Nrf2 mRNA 含量比較（n=30，±s）Tab 3 Keap1 mRNA and Nrf2 mRNA levels before and after treatment in the two groups（n=30，±s）

表3 兩組治療前后Keap1 mRNA 和Nrf2 mRNA 含量比較（n=30，±s）Tab 3 Keap1 mRNA and Nrf2 mRNA levels before and after treatment in the two groups（n=30，±s）

注：與治療前比較，*P＜0.05。

組別tP對照組杵針組Keap1 mRNA治療前31.33±2.52 31.51±2.86 0.131 0.897治療后33.59±1.86 37.14±1.91*3.104 0.013治療后31.16±2.50 28.48±1.98*-2.373 0.033 Nrf2 mRNA治療前33.48±1.57 35.10±1.71 1.617 0.140

3 討論

DPN 的特點(diǎn)是周圍神經(jīng)纖維彌漫性損傷，導(dǎo)致麻木、疼痛和感覺喪失。中醫(yī)獨(dú)特的外治法通過多靶點(diǎn)及整體觀的治療方案在DPN 治療中取得良好效果［9-11］。杵針作用于體表肌肉分層的經(jīng)絡(luò)氣血，使邪氣祛而不傷及肌肉筋膜之正氣，兼針刺按摩之長，主治DPN 一類以筋肉痹痛為主要癥狀的疾病。本研究選以至陽八陣穴、命門八陣、河車命強(qiáng)段為基礎(chǔ)方，應(yīng)用特殊行杵手法（點(diǎn)叩、升降、分理、開闔）激發(fā)經(jīng)氣，引導(dǎo)經(jīng)氣運(yùn)行，促進(jìn)經(jīng)絡(luò)氣血的流通，以達(dá)到補(bǔ)氣血，平陰陽，補(bǔ)脾益腎，活血通絡(luò)的作用。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)［12，13］，杵針療法可以降低雙足腓淺神經(jīng)及足踝中部前方L4/L5/S1 區(qū)段細(xì)有髓鞘（Aδ）和無髓鞘（C）感覺神經(jīng)纖維的快速電流感覺閾值及患者雙足第一足趾趾腹和足背的震動感覺閾值，但其作用機(jī)制尚未闡明。

氧化應(yīng)激是由高血糖引起的，被認(rèn)為是DPN發(fā)病機(jī)制的啟動因素［14-16］。高血糖通過葡萄糖的自氧化產(chǎn)生氧化應(yīng)激，使致ROS 和活性氮物質(zhì)的產(chǎn)生增加，氧化物質(zhì)超過了抗氧化能力，使得機(jī)體的抗氧化防御能力下降［17］。ROS 通過氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)細(xì)胞中的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等其他大分子，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷［15］。SOD、GSH-px 和谷胱甘肽（GSH）等是保護(hù)細(xì)胞免受ROS 傷害的主要抗氧化酶之一［18］。以往的研究表明，外周血細(xì)胞和高糖處理的RSC96 細(xì)胞中，抗氧化酶（GSH、SOD、GSH-Px）含量降低，而丙二醛（MDA）和ROS 積累［17］。然而，本研究結(jié)果表明，杵針可以使抗氧化酶含量升高，從而拮抗氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果顯示杵針有效提高了DPN 患者血清SOD 和GSH-px 水平。表明杵針治療DPN 可能是通過使血清中抗氧化物含量升高，維持DPN 患者ROS 平衡，從而達(dá)到抗氧化應(yīng)激作用。

核因子相關(guān)因子2（Nrf2）及其基因靶點(diǎn)是內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分［19，20］。在機(jī)體正常生理狀態(tài)下，Nrf2 在細(xì)胞質(zhì)中處于與Keap1 結(jié)合的穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞暴露在氧化劑和毒物中時，Nrf2 從Keap1 中釋放出來，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，并與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，以誘導(dǎo)下游抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄如SOD、GSH-px，從而保護(hù)細(xì)胞免受ROS 導(dǎo)致的損傷［21，22］。研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)Nrf2 的表達(dá)被證明對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DM 和DPN 具有保護(hù)作用［23］。本研究結(jié)果顯示，杵針可增加DPN 患者血清中Nrf2的水平。此外，杵針可阻斷DPN 患者血清Keap1 的高水平表達(dá)。從基因的角度，我們深入研究了Nrf2和Keap1 的mRNA 表達(dá)。杵針顯著增加了DPN 患者血清中Nrf2mRNA 的表達(dá)，并降低了Keap1mRNA 的表達(dá)，表明了杵針對Keap1-Nrf2/ARE 通路具有調(diào)控作用。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明了杵針對DPN 患者氧化損傷的保護(hù)作用與Keap1-Nrf2/ARE 通路的激活有關(guān)。本研究提供了臨床實(shí)驗(yàn)證據(jù)，下一步可進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，從分子水平和形態(tài)學(xué)等方面進(jìn)一步探索杵針治療DPN 的作用機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)度說明：

王芳、楊慧：課題的設(shè)計(jì)，臨床試驗(yàn)指導(dǎo)；王芳、廖順琪：文章撰寫；王寒、王瑤：資料收集、統(tǒng)計(jì)分析；翁夕媚、黃亞玲：患者治療工作；王芳：數(shù)據(jù)審核。

所有作者無利益沖突。