利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定68 份三角梅基因組大小與染色體倍性

陳宜木，周 群，鐘穎穎，張萬(wàn)旗，李可威，林悅其

(廈門市園林植物園，福建 廈門 361000)

三角梅是紫茉莉科(Nyctaginaceae)葉子花屬(Bougainvillea)中具有園藝價(jià)值的一類藤狀灌木[1]，也叫葉子花、三角花、南美紫茉莉、九重葛、寶巾花、簕杜鵑、賀春紅等，至今已有250 多年的栽培歷史[2]。我國(guó)自1872 年在臺(tái)灣省引種栽培[3]，隨后漸擴(kuò)至大陸各省。20 世紀(jì)80 年代，福建、廣東、云南和海南等地開(kāi)始大量引進(jìn)三角梅優(yōu)良品種，并逐步在我國(guó)南方大面積推廣種植。三角梅因苞葉色彩豐富、花開(kāi)繁茂，適應(yīng)性強(qiáng)、耐修剪、易管理，應(yīng)用范圍廣泛等特點(diǎn)而備受人們喜愛(ài)，現(xiàn)已被國(guó)內(nèi)外30 多個(gè)城市選為市花[4]。但是長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)三角梅繁殖多采用扦插、嫁接等方式無(wú)性繁殖，最終導(dǎo)致品種單一、品性退化、基因池變窄，不利于三角梅種質(zhì)資源庫(kù)的擴(kuò)大及品種創(chuàng)新[5]。因此，選育出更多的三角梅新品種刻不容緩。

三角梅花被管細(xì)長(zhǎng)，自然結(jié)實(shí)率低，且不同種質(zhì)間結(jié)實(shí)性存在較大差異[6]，這與不同品種的花粉活力、花粉形態(tài)、柱頭可授性有一定關(guān)系[6—10]。國(guó)外最初采用自然芽變育種[11]，后來(lái)采用輻射誘變和秋水仙素多倍體育種[12—17]，育種效率大幅提升。在國(guó)內(nèi)，陳庭等[18]、孫利娜等[19]、鄧紅等[20]先后開(kāi)展了三角梅輻射誘變育種，獲得了不同類型的變異植株，也有通過(guò)化學(xué)誘變選育新品種的研究，獲得一些表型變異的植株[21—22]。隨著三角梅育性研究和新品種選育工作的深入開(kāi)展，對(duì)三角梅染色體的倍性進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定是非常必要的。孫魯平[23]采用流式細(xì)胞分析法對(duì)197 份三角梅種質(zhì)染色體倍性進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)‘Formosa’‘Mrs. Eva White'等179 份種質(zhì)為二倍體，‘斑葉畫(huà)報(bào)’等17 份種質(zhì)為三倍體，‘Chitra’為四倍體，此外還發(fā)現(xiàn)‘Miss Manila’的大花變異材料為2n=2X=34 和2n=4X=68 的混倍體。然而，我國(guó)引進(jìn)和自主選育的三角梅種質(zhì)資源已達(dá)上千個(gè)，絕大多數(shù)三角梅種質(zhì)資源染色體的倍性尚未明確，這使三角梅育性研究、倍性育種和雜交育種等工作受到限制，同時(shí)也影響到三角梅育種方法的選擇。廈門市園林植物園建有國(guó)家三角梅種質(zhì)資源庫(kù)，收集保存三角梅活體種質(zhì)資源600 余份，品種320 多個(gè)。為開(kāi)展三角梅倍性育種和雜交育種工作，有必要對(duì)三角梅種質(zhì)資源染色體倍性進(jìn)行鑒定。

染色體倍性鑒定的方法有多種，如染色體觀察法、形態(tài)觀察法。染色體觀察法雖然準(zhǔn)確性高，但操作復(fù)雜、技術(shù)難度大、工作量較大[24—25]，而形態(tài)觀察法的準(zhǔn)確性比染色體觀察法低得多[26]。近年來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)成為植物染色體倍性鑒定、基因組大小測(cè)定等的重要工具[27]。流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)處于液流中各種熒光標(biāo)記的微粒進(jìn)行多參數(shù)快速準(zhǔn)確地定性和定量分析[28]。由于該方法具有快速、靈敏且可同時(shí)進(jìn)行染色體倍性鑒定和基因組大小估測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[29—30]，已成功用于茉莉花(Jasminum sambac)[31]、 杏(Prunus armeniaca)[32]、 蘭 屬(Cymbidium)[33]、香蕉(Musa nana)[34]、文心蘭(Oncidium hybridum)[35]、桑樹(shù)(Morus alba)[36]等多種植物染色體的倍性鑒定。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定54 份國(guó)內(nèi)外引進(jìn)的三角梅種質(zhì)資源及14 份實(shí)生種質(zhì)的基因組大小和染色體倍性，為開(kāi)展三角梅種質(zhì)創(chuàng)新、倍性育種等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料含54 份從國(guó)內(nèi)外收集的三角梅種質(zhì)資源和14 份實(shí)生種子苗，均種植于廈門市園林植物園國(guó)家三角梅種質(zhì)資源庫(kù)三角梅資源圃，管理措施和栽培環(huán)境基本一致。對(duì)照品種為二倍體‘福爾摩莎’。內(nèi)參為番茄(Solanum lycopersicum)，內(nèi)參基因組大小約900 Mbp，以番茄種子萌發(fā)后1 個(gè)月的幼苗嫩葉為實(shí)驗(yàn)材料，番茄種子由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所提供。流式細(xì)胞儀(型號(hào)BD FACScalibur)由美國(guó)Becton Dickinson 公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞懸浮液制備

采集各種質(zhì)嫩葉，參考田新民等[28]的方法配制MGb解離液，參考李春牛等[31]的方法制備細(xì)胞懸浮液。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

參考李春牛等[31]的方法，利用流式細(xì)胞儀對(duì)染色后的細(xì)胞核懸浮液樣品進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 計(jì)算基因組大小和染色體倍性

參考田新民等[28]、李春牛等[31]的方法，計(jì)算待測(cè)樣品基因組大小和染色體倍性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Modifit3.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞法倍性鑒定可行性

采用內(nèi)參法對(duì)待測(cè)樣品與內(nèi)參樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，由此測(cè)定三角梅DNA 含量。結(jié)果顯示內(nèi)參與二倍體‘美露’、三倍體‘狂歡節(jié)’、四倍體‘蒙杜林’待測(cè)樣品的峰值能完全分開(kāi)，并且沒(méi)有重疊峰，峰型也較清晰集中(圖1)。由此表明，選用番茄為內(nèi)參測(cè)定三角梅DNA 含量是可行的。

圖1 三種倍性三角梅的FCM 測(cè)定分析Fig. 1 Histogram of cell peak values of three kinds of ploidy bougainvillea

2.2 三角梅種質(zhì)資源的染色體倍性分析

對(duì)從國(guó)內(nèi)外收集的54 份三角梅資源的DNA含量進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)內(nèi)參和待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度(表1)，計(jì)算出待測(cè)樣品的基因組為2.48～5.12 Gb，其中，對(duì)照品種二倍體‘福爾摩莎’的基因組為2.66 Gb。根據(jù)待檢測(cè)資源的基因組大小與對(duì)照品種的基因組大小的關(guān)系，計(jì)算待檢測(cè)三角梅的染色體倍性。結(jié)果表明，所收集到的54 份三角梅資源中有29 份為二倍體，基因組為2.48～2.86 Gb；有20 份為三倍體，基因組為3.65～4.22 Gb；‘大雜斑葉畫(huà)報(bào)’‘銀葉畫(huà)報(bào)’‘蒙杜林’‘歐洲奇特拉’等4份三角梅種質(zhì)資源為四倍體，基因組為4.98～5.12 Gb (表1)。另外，‘大金邊楊梅’為2X、4X、6X混倍體。

表1 收集的三角梅種質(zhì)資源的基因組大小及倍性Table 1 Genome size and ploidy of collected germplasm of Bougainvillea

續(xù)表

2.3 實(shí)生種質(zhì)的倍性分析

通過(guò)對(duì)14 份三角梅實(shí)生種質(zhì)的DNA 含量進(jìn)行檢測(cè)(表2)，得到其基因組為2.60～5.02 Gb。以二倍體‘福爾摩莎’為對(duì)照，染色體倍性鑒定顯示，三角梅實(shí)生種質(zhì)二倍體5 份、三倍體8 份、四倍體1份。其中，編號(hào)為S-6、S-1、S-4、S-9、S-2 等5 份實(shí)生種質(zhì)為二倍體，基因組為2.60～2.74 Gb；編號(hào)為S-8、S-13、S-14、S-15、S-17、S-16、S-11、S-10等8 份實(shí)生種質(zhì)為三倍體，基因組為3.85～4.05 Gb；編號(hào)為S-3 的實(shí)生種質(zhì)為四倍體，基因組為5.02 Gb。

表2 實(shí)生種質(zhì)的基因組大小及倍性Table 2 Genome size and ploidy of seedings

3 討論與結(jié)論

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞核DNA 含量有兩種方法，分別為內(nèi)參法和外參法。內(nèi)參法的優(yōu)點(diǎn)是可以避免樣品差異、機(jī)器不穩(wěn)定等因素造成的誤差，但選用內(nèi)參法測(cè)定細(xì)胞核DNA 要求所選用的內(nèi)參細(xì)胞核DNA 含量是已知的且能保持穩(wěn)定，并與待測(cè)樣本DNA 含量相近[28]，內(nèi)參樣本的峰值不能與待測(cè)樣本峰值重疊，最好與待測(cè)樣本的G2 或M 期峰值不重疊[37]。目前較常用的植物內(nèi)參有雞紅細(xì)胞核[33,38]、玉米B73[39]、番茄[40]、豌豆[28]等。通過(guò)檢索植物基因組網(wǎng)站(https://cvalues.science.kew.org/search) C值，獲知三角梅基因組為3.5～4.4 Gb。因此，選用番茄作為內(nèi)參能與待測(cè)樣品分開(kāi)，待測(cè)樣品與內(nèi)參樣品的G2 和M 期峰值不重疊，選用番茄為內(nèi)參測(cè)定三角梅DNA 含量是可行的。

檢測(cè)植物基因組大小是開(kāi)展基因組學(xué)研究和進(jìn)化生物學(xué)研究的基礎(chǔ)[41]。我國(guó)在三角梅分子生物學(xué)方面的研究起步比較晚，相關(guān)報(bào)道集中于遺傳多樣性分析和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等方面。隨著國(guó)內(nèi)外基因組學(xué)研究的不斷發(fā)展，基因組大小或?qū)⒊蔀榛蚪M和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的本底資料。本研究通過(guò)試驗(yàn)檢測(cè)估算出三角梅基因組大小為 2.48～5.12 Gb，可為后續(xù)三角梅進(jìn)化生物學(xué)和基因組學(xué)研究提供參考。

確定三角梅染色體倍性是進(jìn)一步研究其生殖發(fā)育特點(diǎn)以及雜交育種或倍性育種的基礎(chǔ)。對(duì)68 份三角梅資源的染色體倍性鑒定表明，34 份是二倍體、28 份是三倍體、5 份是四倍體、1 份是2X、4X、6X混倍體，三倍體和四倍體既有來(lái)源于收集的種質(zhì)資源，也有實(shí)生種質(zhì)，說(shuō)明基于染色體倍性水平的三角梅種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，可為培育新品種提供豐富的親本資源。

植物以多倍體存在是其進(jìn)化的形式之一，多倍體植物一般在外觀形態(tài)和生理生化指標(biāo)等方面發(fā)生較大變化[42]，營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官通常比二倍體個(gè)體大。孫魯平[23]對(duì)‘Miss Manila’二倍體和‘Miss Manila (2×/4×)’三角梅植株的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定比較，發(fā)現(xiàn)后者葉片、苞片、花序柄長(zhǎng)、芽刺長(zhǎng)、花筒長(zhǎng)、口徑粗、染色體數(shù)目和花粉體積均顯著增加。本研究鑒定的28 份三倍體和5 份四倍體共33份多倍體三角梅的葉、花等器官也較二倍體的大，這為選擇三角梅育種策略提供參考。