• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    UV-B 脅迫提高斜紋夜蛾對綠僵菌的抗性研究

    2022-04-01 11:09:16黃圓圓王明慧何麗艷熊澤恩ShaukatALI孟建玉
    亞熱帶植物科學 2022年6期
    關(guān)鍵詞:僵菌斜紋懸浮液

    黃圓圓,王明慧,何麗艷,熊澤恩,陳 潔,Shaukat ALI,孟建玉,桑 文*

    (1. 華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院 / 生物防治教育部工程研究中心,廣東廣州 510640;2. 貴州省煙草科學研究院,貴州 貴陽 550081)

    斜紋夜蛾(Spodoptera litura)屬于鱗翅目夜蛾科 昆蟲,在亞洲、歐洲及非洲均有分布,在我國主要分布于長江流域、南方各省以及黃河以北少部分地區(qū)。斜紋夜蛾能取食109 科389 種植物,包括葫蘆科、薔薇科、豆科、十字花科蔬菜以及柑橘(Citrus reticulata)等果樹[1]。其初孵幼蟲常聚集于葉背啃食,3 齡后分散取食植物葉片、嫩莖,也可取食花蕾、花,嚴重時可將整株植物全食。5~6 齡幼蟲進入暴食期,其食量約占整個幼蟲期的90%以上[2]。斜紋夜蛾不但直接危害作物,其排泄物還可引起植株腐爛[3]。斜紋夜蛾重發(fā)區(qū)域的作物減產(chǎn)達80%以上,甚至絕收[4]。

    目前,以氯蟲苯甲酰胺、蟲螨腈、茚蟲威、甲維鹽·茚蟲威、甲維鹽·蟲螨腈等藥劑為核心防治手段的化學防治是控制斜紋夜蛾的主要策略,但殺蟲劑的長期大量使用會帶來“3R”(病蟲抗性、農(nóng)藥殘留、病蟲再猖獗)問題[5—8]。昆蟲病原真菌是一種被廣泛使用的生物農(nóng)藥,專一性強,殺蟲效果好,是害蟲綠色防控技術(shù)的重要組成部分。綠僵菌(Metarhizium anisopliae) 用于防治澳洲疫蝗(Chortoicetes terminifera)[9]、云杉八齒小蠹(Ipstypographus)[10]和黑豆蚜蟲(Aphis craccivora)[11],致死率均在70%以上。綠僵菌同時被證實對夜蛾科害蟲具有良好的防治效果[12]。萊氏綠僵菌(Metarhizium rileyi)對草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) 的自然感染率達29.83%,在室內(nèi)條件下,用分離獲得的1×108個·mL-1孢子懸浮液侵染草地貪夜蛾3 齡幼蟲,7 d 后幼蟲死亡率可達100%[13]。

    昆蟲病原真菌資源豐富,具有寄主范圍廣、代謝類型復雜、生態(tài)友好、不易產(chǎn)生抗性、可擴散傳播等諸多優(yōu)點,但其田間應用效果易受環(huán)境影響,難以在防控蟲害方面繼續(xù)發(fā)揮優(yōu)勢[14—17]。紫外線對微生物的殺傷主要通過使DNA 分子產(chǎn)生嘧啶二聚體,進而使遺傳物質(zhì)失活,導致微生物失去繁殖能力或死亡[18]。研究表明,紫外光直接照射會導致附著昆蟲體壁的昆蟲病原真菌孢子萌發(fā)率降低,殺蟲能力大為減弱[19—20]。

    昆蟲受到真菌侵染時,體內(nèi)免疫系統(tǒng)被觸發(fā)。昆蟲主要依靠細胞免疫和體液免疫等先天免疫系統(tǒng)來抵御真菌感染[21]。細胞免疫中,昆蟲血液循環(huán)系統(tǒng)中自由移動的血細胞構(gòu)成昆蟲免疫的第一道防線[22—23]。血細胞通常會吞噬入侵血漿的微生物,并將其包裹控制[24]。美洲大蠊細胞接種綠僵菌后,血細胞通過吞噬作用形成結(jié)節(jié)使綠僵菌孢子鈍化、不能萌發(fā),或者徹底分解孢子[25]。體液免疫的機制多樣化,如黑化反應、血淋巴凝固或抗菌肽的產(chǎn)生[23,26]。體液免疫往往依賴于特定的信號通路,比如果蠅受到真菌感染后被誘導合成抗真菌肽(Drosomycin)和碧蝽金屬肽(Metchnikowin)等[27]。除了真菌侵染會引起昆蟲的免疫反應,其他物理脅迫也會誘導昆蟲的免疫反應[28—29]。例如,紫外線-B(UV-B)脅迫誘導激活桃蚜(Myzus persicae)的抗原加工、呈遞、趨化因子信號等[30]。那么,UV-B 能否通過提前激活免疫反應間接抑制昆蟲病原真菌殺蟲效果呢?

    本研究通過篩選出對斜紋夜蛾幼蟲具有較高致病力的綠僵菌株系,測定UV-B 照射對斜紋夜蛾幼蟲抵抗綠僵菌致病力的影響,隨后利用異硫氰酸熒光素(FITC)對綠僵菌進行熒光標記,分析紫外線脅迫下斜紋夜蛾血細胞數(shù)量、血細胞吞噬作用、血漿抗真菌活性變化,明確紫外輻射對昆蟲抵御病原真菌侵染的間接效應,為綠僵菌田間應用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 昆蟲飼養(yǎng)

    斜紋夜蛾從華南農(nóng)業(yè)大學試驗田的棉花上采集。按照David 等[31]方法連續(xù)多代飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學教育部生物防治工程研究中心。飼養(yǎng)溫度(25±2)℃,相對濕度(80±5)%,光周期(L/D) 16 h/8 h。

    1.2 蟲生真菌培養(yǎng)和孢子懸液配制

    金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)分離株SCHX46、SM036 和ZB16 來自華南農(nóng)業(yè)大學教育部生物防治工程研究中心蟲生真菌種質(zhì)資源庫。將綠僵菌接種于PDA 平板上,在(26±2) ℃下培養(yǎng)10 d[32]。待菌株充分產(chǎn)孢后,用0.01% Tween-80 去離子水溶液洗脫平板上的真菌分生孢子,用濾紙(Whatman No. 2)篩選后裝入無菌小瓶。用顯微鏡計數(shù),配制1×109分生孢子·mL-1綠僵菌孢子懸浮液,以此為原液,用含0.01% Tween-80 去離子水連續(xù)稀釋,制備較低濃度(1×105、1×106、1×107和1×108分生孢子·mL-1)分生孢子懸浮液[17]。

    1.3 斜紋夜蛾幼蟲的綠僵菌處理

    用飼喂法比較不同株系、不同濃度綠僵菌分生孢子懸浮液處理對斜紋夜蛾4 齡幼蟲死亡率的影響。在未凝固人工飼料中添加5 種濃度(1×105、1×106、1×107、1×108和1×109分生孢子·mL-1)的各個綠僵菌分離株。以不添加真菌孢子為對照。將制備好的飼料冷卻,置于4 ℃?zhèn)溆?。將剛蛻皮的斜紋夜蛾4 齡幼蟲饑餓3 h 后移入直徑4 cm 小塑料杯,分別投喂飼料1 g。每處理設置5 個生物學重復,每重復30 頭幼蟲,每天更換新鮮飼料。統(tǒng)計處理7 d后幼蟲死亡率,選擇致死率最好的綠僵菌分離株。利用所選的綠僵菌菌株孢子懸液注射法檢測斜紋夜蛾4 齡幼蟲死亡率。按照1.2 制備綠僵菌菌株分生孢子懸液(1×103、1×104和1×105分生孢子·mL-1)。將4 齡斜紋夜蛾幼蟲靜置于冰上5 min 使其休眠,然后用75%乙醇擦拭蟲體滅菌。對幼蟲腹部進行注射孢子懸液以感染斜紋夜蛾。對照組注射等量的DPBS 溶液。

    1.4 UV-B 處理斜紋夜蛾幼蟲

    將4 齡斜紋夜蛾幼蟲置于UV-B 熒光燈(光源波長的峰值在303 nm,TL 20W/12 RS,東莞智臣電子有限公司,中國)下照射0.5 h,以未照射UV-B 的斜紋夜蛾幼蟲作為對照。每天記錄幼蟲死亡率。每處理設置3 個生物學重復,每重復20 頭幼蟲。

    1.5 斜紋夜蛾幼蟲血淋巴吞噬能力測定

    采用異硫氰酸熒光素(FITC)對綠僵菌進行標記[34]。將4 齡幼蟲分為2 組,每組20 頭幼蟲。紫外線處理幼蟲0.5 h,對照組幼蟲置于實驗室條件下。幼蟲孵育后先用75%乙醇擦拭蟲體滅菌,再用顯微注射器從幼蟲腹部氣門處注射FITC 標記的孢子懸液(1×107分生孢子·mL-1) 20 μL。注射后對幼蟲進行取血,并立即向血淋巴中加入抗凝劑。在暗視野顯微鏡下觀察不同時間點血淋巴中血細胞的吞噬情況,確定吞噬一個或多個分生孢子的血細胞百分比,測定其吞噬率。每樣本觀察200 個以上血細胞,每處理3 次重復。

    1.6 斜紋夜蛾幼蟲血漿抗真菌活性測定

    用含有100 μg·μL-1氨芐西林的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)稀釋綠僵菌分生孢子懸浮液至4×104分生孢子·mL-1。分別在紫外脅迫處理0 h、4 h、8 h及24 h 時將紫外線照射0.5 h 的斜紋夜蛾4 齡幼蟲置于冰上5 min,然后解剖并收集血淋巴,以相同時間點未作UV-B 處理的斜紋夜蛾4 齡幼蟲為對照。將收集的血淋巴加入DPBS,1/5 稀釋,然后測定每毫升血淋巴細胞數(shù)。剩余樣品離心提取血漿,將血漿置于-80 ℃冰箱保存。

    取稀釋的綠僵菌孢子懸浮液100 μL分別與不同處理幼蟲的100 μL 血漿混合,置于96 孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后,混合培養(yǎng)板內(nèi)溶液,從每個孔中取出50 μL 溶液,用PDB 稀釋至100 μL。將溶液涂抹在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)平板上,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),10 d 后測定孢子數(shù)。每處理3 次重復。

    1.7 數(shù)據(jù)分析

    用SPSS 19.0 進行單因素方差分析(one way ANOVA)和多重比較,通過Tukey’s HSD 檢驗差異顯著性(P<0.05)。采用GrapgPad Prism 8 軟件繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 飼喂法篩選綠僵菌毒力菌株

    為保證對照組和實驗組用金龜子綠僵菌處理的斜紋夜蛾幼蟲死亡率有顯著差異,先篩選出毒力最強的菌株。用含有不同濃度分生孢子的人工飼料飼喂斜紋夜蛾4 齡幼蟲,幼蟲死亡率隨飼料中孢子濃度升高而升高。比較相同濃度(1×109分生孢子·mL-1)菌株處理斜紋夜蛾5 d 后的死亡率,ZB16、SM036和SCHX46 處理后的死亡率分別為82.22%、73.00%和71.00% (圖1)。三種綠僵菌菌株中,ZB16 毒力最強,其次為SM036 和SCHX46。此外,ZB16 菌株的致死速度也較快。因此,后續(xù)采用金龜子綠僵菌菌株ZB16 實驗。

    圖1 三種綠僵菌菌株不同濃度孢子懸浮液對斜紋夜蛾幼蟲的致死率比較Fig. 1 Concentration-mortality response of Spodoptera litura to topical application of three different isolates of Metarhizium anisopliae

    2.2 不同濃度綠僵菌ZB16 孢子懸浮液對斜紋夜蛾幼蟲死亡率的影響

    斜紋夜蛾4 齡幼蟲的死亡率與綠僵菌分生孢子濃度成正比(圖2)。注射1×105分生孢子·mL-1懸浮液7 d 后,幼蟲死亡率最高(72.22%),而注射1×103分生孢子·mL-1懸浮液的幼蟲死亡率最低(30.00%)。注射1×104分生孢子·mL-1懸浮液的幼蟲死亡率為50%,該劑量用于后續(xù)實驗。

    圖2 綠僵菌ZB16 不同孢子濃度懸浮液處理的斜紋夜蛾幼蟲死亡率Fig. 2 Concentration-mortality response of Spodoptera litura to injection of Metarhizium anisopliae isolate ZB16

    2.3 UV-B 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲抗真菌能力的影響

    UV-B 照射斜紋夜蛾幼蟲0.5 h,然后注射不同濃度綠僵菌分生孢子懸浮液。結(jié)果表明,未經(jīng)UV-B照射的斜紋夜蛾幼蟲注射綠僵菌懸浮液(1×104分生孢子·mL-1) 7 d 后存活率為49.67%,而UV-B 照射0.5 h 后再注射綠僵菌懸浮液的斜紋夜蛾幼蟲7 d 后存活率為65.56%(圖3)。多重比較表明,相同時間內(nèi)不同處理間幼蟲死亡率有顯著差異(圖3)。

    圖3 UV-B 脅迫下注射綠僵菌孢子懸浮液的斜紋夜蛾死亡率(%)Fig. 3 Effect of UV-B stress on mortality (%) of Spodoptera litura injected with Metarhizium anisopliae

    2.4 UV-B 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲血淋巴中血細胞數(shù)量的影響

    UV-B 照射0.5 h 再用綠僵菌處理的斜紋夜蛾4齡幼蟲與未照射UV-B 只用綠僵菌處理的幼蟲相比,其在不同時間測得血細胞數(shù)量均有顯著差異。UV-B處理0.5 h 后的4 h、8 h 以及24 h,用綠僵菌處理的斜紋夜蛾幼蟲血細胞數(shù)量與對照組(未照射UV-B)相比顯著增加(表1)。

    表1 UV-B 脅迫對幼蟲血細胞數(shù)量的影響Table 1 Effect of UV-B exposure on the amount of hemocyte of Spodoptera litura larvae

    2.5 UV-B 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲血細胞吞噬功能的影響

    UV-B 照射0.5 h 后用綠僵菌處理的斜紋夜蛾4齡幼蟲與未照射UV-B 的幼蟲相比,兩者在不同時間測得的血細胞吞噬率均有顯著差異。UV-B 照射組的斜紋夜蛾幼蟲血細胞吞噬率在處理4 h 后最高,達30.2%,隨后逐漸降低(表2)。

    表2 UV-B 照射對斜紋夜蛾幼蟲血淋巴中血細胞吞噬活性的影響Table 2 Effect of UV-B exposure on phagocytic activity of Spodoptera litura haemocyte in haemolymph

    2.6 UV-B 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲血漿抗真菌活性的影響

    金龜子綠僵菌孢子懸浮液分別與不同時間實驗室條件下飼養(yǎng)幼蟲的血漿以及UV-B 照射0.5 h 處理后幼蟲的血漿混合培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d 后,UV-B 處理后4 h 與8 h 的幼蟲與實驗室條件下飼養(yǎng)的相同時間點的幼蟲相比,其血漿與真菌孢子懸浮液混合物中真菌孢子數(shù)顯著降低。說明紫外脅迫能夠增加斜紋夜蛾幼蟲血漿的抗真菌活性(表3)。

    表3 UV-B 照射對斜紋夜蛾血漿抗真菌活性的影響Table 3 Effect of UV-B exposure on anti-fungal activity in Spodoptera litura plasma

    3 討論

    綠僵菌是一種寄主范圍較廣的昆蟲病原真菌,被應用于多種害蟲防治[15]。然而,諸多因素可能抑制綠僵菌活性,其防治效果一定程度上取決于自身對這些環(huán)境因素的耐受性。太陽輻射中的紫外線成分(UV-A 和UV-B)對生物有機體,包括真菌有破壞作用[36]。UV-B 照射可抑制真菌分生孢子的活性[37—38]。此外,亞致死劑量的紫外線照射不僅降低綠僵菌的萌發(fā)率還能降低其毒力[39—40]。綠僵菌這種易受環(huán)境干擾的不穩(wěn)定性是對其應用于田間防治害蟲的一種嚴重阻礙[41—42]。然而,紫外線作為自然環(huán)境中廣泛存在的物理脅迫因子,不僅對綠僵菌產(chǎn)生直接影響,同時可能通過影響昆蟲免疫,如上調(diào)昆蟲中熱激蛋白基因的表達來影響綠僵菌防治效果[43]。因此明確UV-B 對綠僵菌侵染昆蟲的影響,有助于提高蟲生真菌類生物農(nóng)藥在害蟲防治中的應用效果。

    本研究發(fā)現(xiàn)UV-B 脅迫能使被綠僵菌侵染的斜紋夜蛾死亡率降低。實驗中為了排除幼蟲死亡是由UV-B 對真菌孢子的直接影響造成的,皆對斜紋夜蛾幼蟲先進行UV-B 脅迫,后用綠僵菌處理。有類似的研究表明,物理脅迫能減少蟲生真菌對昆蟲的侵染。自然感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的大蠟螟(Galleria mellonella)幼蟲,分別在43 ℃和28 ℃飼養(yǎng)15 min。43 ℃下飼養(yǎng)的幼蟲存活時間顯著更長,且大蠟螟幼蟲先受到熱脅迫后再注射球孢白僵菌,也有類似表現(xiàn),說明大蠟螟幼蟲存活率增加并非熱脅迫對真菌的不利影響造成的[44]。Mowlds 等[45]研究表明,大蠟螟幼蟲被白色念珠菌(Monilia albican)感染前在4 ℃或37 ℃下預孵育24 h,與在30 ℃下預孵育24 h 相比,對白色念珠菌的抗性增強。Richards 等[44]的研究表明,熱脅迫24~48 h 能在一定程度上減少甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)幼蟲受綠僵菌和白僵菌的感染。溫和的物理刺激(搖晃)幼蟲也可以減少白色念珠菌和煙曲霉(Aspergillus fumigatus)對大蠟螟幼蟲的感染[46—47]。

    物理脅迫可以誘導昆蟲的免疫反應,進而影響真菌的致病潛力[43—44,48]。甘藍夜蛾受熱脅迫(伴隨著真菌感染)后,其血細胞數(shù)量增多、血細胞吞噬功能增強,且幼蟲血淋巴中某些抗微生物肽的水平增加[44]。有研究表明,血細胞可以吞噬真菌分生孢子,并通過傷口愈合和血凝固保護昆蟲免受真菌感染[34,49]。本研究中,紫外脅迫能提高斜紋夜蛾幼蟲血細胞數(shù)量、血細胞吞噬功能和血淋巴抗真菌活性,并且受紫外脅迫后斜紋夜蛾幼蟲的真菌抗性顯著提高。說明在綠僵菌侵染昆蟲時,UV-B 脅迫下的斜紋夜蛾幼蟲免疫反應被激活,從而抵御真菌侵染。

    4 結(jié)論

    本文從對斜紋夜蛾幼蟲具有較高致病力的金龜子綠僵菌3 種株系中篩選出毒力最高的菌株ZB16,研究表明紫外脅迫降低了受綠僵菌侵染的斜紋夜蛾4 齡幼蟲的死亡率。進一步利用異硫氰酸熒光素(FITC)對綠僵菌進行熒光標記,證實紫外線脅迫下斜紋夜蛾血細胞數(shù)量、細胞吞噬活性以及血漿抗真菌活性均上升,說明紫外線脅迫下的昆蟲免疫反應發(fā)生變化,對綠僵菌的抗性增強。

    猜你喜歡
    僵菌斜紋懸浮液
    綠僵菌對植物的促生防蟲作用研究進展
    湖北植保(2022年5期)2022-12-24 21:26:00
    斜紋軟呢新姿
    斜紋軟呢再續(xù)睛采
    廣德市笄罩山毛竹根際綠僵菌物種多樣性及生態(tài)位研究
    重介質(zhì)懸浮液中煤泥特性對分選的影響分析
    云南化工(2020年11期)2021-01-14 00:51:00
    噴霧干燥前驅(qū)體納米Al 懸浮液的制備及分散穩(wěn)定性
    含能材料(2020年8期)2020-08-10 06:44:20
    4種綠僵菌乙酸乙酯初提物抗菌活性比較
    分選硫鐵礦用高密度重介懸浮液特性的分析研究
    一株蠐螬綠僵菌的分子鑒定
    茶葉學報(2018年4期)2018-02-28 01:00:48
    EcR-RNAi和印楝素處理斜紋夜蛾幼蟲誘導腹足發(fā)育受阻表型
    亚洲精品在线观看二区| 日韩人妻高清精品专区| 99视频精品全部免费 在线| 特级一级黄色大片| 免费在线观看影片大全网站| 色吧在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 国模一区二区三区四区视频| 成年av动漫网址| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产亚洲精品久久久com| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 少妇高潮的动态图| 婷婷六月久久综合丁香| 成人无遮挡网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩精品中文字幕看吧| 免费看a级黄色片| 久久久久久国产a免费观看| 国产成人影院久久av| 国产精品久久电影中文字幕| 大香蕉久久网| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 69人妻影院| 最新在线观看一区二区三区| 国产伦在线观看视频一区| 国产爱豆传媒在线观看| av免费在线看不卡| 久久国内精品自在自线图片| 久久久a久久爽久久v久久| 国产在线男女| 久久久精品大字幕| 亚洲精品亚洲一区二区| h日本视频在线播放| 99久久九九国产精品国产免费| 网址你懂的国产日韩在线| 青春草视频在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 看黄色毛片网站| 国产毛片a区久久久久| 国产视频一区二区在线看| 小说图片视频综合网站| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 九九热线精品视视频播放| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲人成网站在线观看播放| 日本五十路高清| 淫秽高清视频在线观看| 久久人人爽人人片av| 国产在线男女| 午夜福利在线在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成年版毛片免费区| 美女黄网站色视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩亚洲欧美综合| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩欧美 国产精品| 高清日韩中文字幕在线| 成人无遮挡网站| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 波野结衣二区三区在线| 深夜精品福利| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 91av网一区二区| 国产黄色小视频在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 成人永久免费在线观看视频| 黄片wwwwww| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美成人免费av一区二区三区| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲成人中文字幕在线播放| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 女同久久另类99精品国产91| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产片特级美女逼逼视频| 国产色婷婷99| 国产男靠女视频免费网站| 听说在线观看完整版免费高清| 51国产日韩欧美| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 高清毛片免费看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 99riav亚洲国产免费| 级片在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 男人狂女人下面高潮的视频| 免费av不卡在线播放| 国产在线男女| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产探花在线观看一区二区| 99在线视频只有这里精品首页| 日本黄色片子视频| 极品教师在线视频| 国产探花在线观看一区二区| av天堂中文字幕网| 丰满乱子伦码专区| 日本黄色片子视频| 国产老妇女一区| 亚州av有码| 人妻少妇偷人精品九色| 一个人看视频在线观看www免费| 在线观看一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久欧美国产精品| 国产男靠女视频免费网站| 69人妻影院| 亚洲国产精品国产精品| 午夜福利高清视频| 日本爱情动作片www.在线观看 | 亚洲精品在线观看二区| 美女内射精品一级片tv| 美女被艹到高潮喷水动态| 此物有八面人人有两片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产成人精品久久久久久| 九九热线精品视视频播放| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品国产高清国产av| 丰满的人妻完整版| 51国产日韩欧美| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 深爱激情五月婷婷| av黄色大香蕉| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 嫩草影院入口| 免费一级毛片在线播放高清视频| 黄片wwwwww| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美另类亚洲清纯唯美| 成人特级黄色片久久久久久久| 少妇的逼好多水| 在线看三级毛片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品久久久久久成人av| 老熟妇仑乱视频hdxx| 舔av片在线| 成年av动漫网址| 身体一侧抽搐| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产色爽女视频免费观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产 一区精品| 国产69精品久久久久777片| 亚洲人与动物交配视频| 九九爱精品视频在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 成人漫画全彩无遮挡| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| av在线老鸭窝| 久久亚洲国产成人精品v| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久久久伊人网av| av视频在线观看入口| aaaaa片日本免费| 免费人成在线观看视频色| 成人特级黄色片久久久久久久| www日本黄色视频网| videossex国产| 可以在线观看毛片的网站| 午夜福利18| videossex国产| 午夜视频国产福利| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产亚洲av嫩草精品影院| 少妇的逼水好多| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 日韩人妻高清精品专区| 一区二区三区免费毛片| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 午夜福利成人在线免费观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 永久网站在线| 色播亚洲综合网| 精品久久久噜噜| 国产三级中文精品| 国产成人a∨麻豆精品| 国产探花在线观看一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 久99久视频精品免费| 天天一区二区日本电影三级| 有码 亚洲区| 欧美中文日本在线观看视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本-黄色视频高清免费观看| 色综合站精品国产| 成年av动漫网址| 日韩人妻高清精品专区| 日本一二三区视频观看| av在线亚洲专区| 97超视频在线观看视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 精品一区二区三区人妻视频| 午夜亚洲福利在线播放| 日韩一区二区视频免费看| 成人国产麻豆网| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲电影在线观看av| 欧美性感艳星| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品成人久久久久久| 毛片女人毛片| 亚洲专区国产一区二区| 午夜亚洲福利在线播放| 美女被艹到高潮喷水动态| 成人国产麻豆网| 午夜激情欧美在线| 悠悠久久av| 欧美激情在线99| 国产在线男女| 天堂√8在线中文| 99久国产av精品| 永久网站在线| 一级毛片我不卡| 中文资源天堂在线| 色吧在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 国产极品精品免费视频能看的| 综合色丁香网| a级一级毛片免费在线观看| 日本色播在线视频| 免费观看人在逋| 国产免费一级a男人的天堂| 国产亚洲精品综合一区在线观看| av在线蜜桃| 亚洲精品色激情综合| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产视频内射| 午夜精品在线福利| 级片在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲av美国av| 97热精品久久久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 日本五十路高清| 一夜夜www| 内地一区二区视频在线| 欧美激情久久久久久爽电影| eeuss影院久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 欧美一区二区国产精品久久精品| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久欧美国产精品| 日韩欧美三级三区| 欧美高清性xxxxhd video| av天堂在线播放| 亚洲精品国产av成人精品 | 久久九九热精品免费| 免费看光身美女| 欧美性猛交黑人性爽| 午夜久久久久精精品| 村上凉子中文字幕在线| 国产中年淑女户外野战色| 永久网站在线| 俺也久久电影网| 国产成人freesex在线 | 小说图片视频综合网站| 欧美成人a在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 九色成人免费人妻av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品一区二区免费观看| 日本在线视频免费播放| 久久这里只有精品中国| 啦啦啦啦在线视频资源| 日日啪夜夜撸| 一进一出抽搐动态| 12—13女人毛片做爰片一| 六月丁香七月| 婷婷精品国产亚洲av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 中文字幕久久专区| 亚洲精品色激情综合| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一级黄片播放器| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 色综合站精品国产| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲电影在线观看av| 欧美日韩综合久久久久久| 搡老岳熟女国产| 性色avwww在线观看| 成年免费大片在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 美女黄网站色视频| 亚洲国产色片| 九九爱精品视频在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 丰满的人妻完整版| 毛片一级片免费看久久久久| 内地一区二区视频在线| 精品不卡国产一区二区三区| 99热只有精品国产| 51国产日韩欧美| 国产成人一区二区在线| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久久精品大字幕| 村上凉子中文字幕在线| 久久久久国内视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 嫩草影视91久久| 丝袜美腿在线中文| 国产成人a∨麻豆精品| 麻豆av噜噜一区二区三区| 99久久九九国产精品国产免费| АⅤ资源中文在线天堂| 夜夜夜夜夜久久久久| 悠悠久久av| 少妇的逼好多水| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产乱人视频| av在线天堂中文字幕| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产一级毛片七仙女欲春2| 激情 狠狠 欧美| 麻豆乱淫一区二区| 婷婷亚洲欧美| 久久久久久久午夜电影| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日韩人妻高清精品专区| videossex国产| 国产 一区 欧美 日韩| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久人人爽人人爽人人片va| 直男gayav资源| 亚洲无线观看免费| 日本色播在线视频| 国产麻豆成人av免费视频| 国产成人一区二区在线| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲av中文av极速乱| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产男靠女视频免费网站| 男人的好看免费观看在线视频| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产成人一区二区在线| 久久久久久久久久黄片| 久久精品国产亚洲网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 我要看日韩黄色一级片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产 一区精品| 午夜激情欧美在线| 身体一侧抽搐| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品久久久噜噜| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 成年版毛片免费区| 亚洲无线在线观看| 亚洲在线观看片| 村上凉子中文字幕在线| 国产真实乱freesex| av天堂中文字幕网| 成人漫画全彩无遮挡| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲精品成人久久久久久| 在现免费观看毛片| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久久久久国产a免费观看| 级片在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 看免费成人av毛片| 草草在线视频免费看| 三级毛片av免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产色婷婷99| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲成a人片在线一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久99热这里只有精品18| 女人被狂操c到高潮| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品一区www在线观看| av福利片在线观看| 久久6这里有精品| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲自偷自拍三级| 直男gayav资源| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 成人午夜高清在线视频| 97超碰精品成人国产| 哪里可以看免费的av片| 午夜激情福利司机影院| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 内射极品少妇av片p| 一级毛片电影观看 | 色在线成人网| 51国产日韩欧美| 熟女电影av网| 国产精品久久久久久av不卡| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久热精品热| 欧美zozozo另类| 一级毛片aaaaaa免费看小| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品伦人一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 夜夜爽天天搞| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99在线人妻在线中文字幕| 中文在线观看免费www的网站| 男人舔奶头视频| 久久久国产成人免费| 国产视频一区二区在线看| 欧美激情在线99| 欧美日本视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品久久电影中文字幕| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产亚洲精品av在线| 久久久久久久午夜电影| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲精品影视一区二区三区av| 成人永久免费在线观看视频| 久久久精品94久久精品| 免费观看精品视频网站| 亚洲综合色惰| 99热6这里只有精品| 欧美一区二区精品小视频在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 啦啦啦韩国在线观看视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 中出人妻视频一区二区| 国产 一区精品| 久久人人爽人人片av| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99久国产av精品国产电影| 1000部很黄的大片| 日本一二三区视频观看| 亚洲经典国产精华液单| 日日干狠狠操夜夜爽| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 国产精品人妻久久久影院| 内地一区二区视频在线| 成人国产麻豆网| 国产久久久一区二区三区| av天堂在线播放| 国产日本99.免费观看| 日本五十路高清| 99热全是精品| 欧美日韩在线观看h| 国产亚洲欧美98| 亚洲av中文av极速乱| 国产69精品久久久久777片| 色在线成人网| 欧美3d第一页| www日本黄色视频网| 成人亚洲精品av一区二区| 久久亚洲精品不卡| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 不卡一级毛片| 亚洲精品国产av成人精品 | 69av精品久久久久久| 18+在线观看网站| 男女边吃奶边做爰视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产成人福利小说| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| aaaaa片日本免费| 中文资源天堂在线| 岛国在线免费视频观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美性感艳星| 国产免费男女视频| 18禁在线播放成人免费| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 69av精品久久久久久| 亚洲最大成人中文| 嫩草影院新地址| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 一区二区三区四区激情视频 | 91在线观看av| 亚洲熟妇熟女久久| 女人被狂操c到高潮| 午夜福利在线在线| 热99re8久久精品国产| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品不卡国产一区二区三区| 日本免费a在线| 国产乱人偷精品视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 91久久精品国产一区二区成人| 99精品在免费线老司机午夜| 国产一区二区在线观看日韩| 热99re8久久精品国产| 在线观看免费视频日本深夜| 少妇的逼好多水| 国产久久久一区二区三区| 不卡一级毛片| 成人漫画全彩无遮挡| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久久国内视频| av专区在线播放| 午夜影院日韩av| 午夜福利视频1000在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产男人的电影天堂91| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美日韩在线观看h| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 一进一出抽搐gif免费好疼| 给我免费播放毛片高清在线观看| 少妇高潮的动态图| 国产精品日韩av在线免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲国产精品久久男人天堂| 波多野结衣高清无吗| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产极品精品免费视频能看的| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 天天一区二区日本电影三级| 听说在线观看完整版免费高清| 国产伦精品一区二区三区四那| 深夜精品福利| 国内精品久久久久精免费| АⅤ资源中文在线天堂| 午夜精品国产一区二区电影 | 成人特级黄色片久久久久久久| 午夜亚洲福利在线播放| 国产探花在线观看一区二区| 黑人高潮一二区| 久久人妻av系列| 国产不卡一卡二| 久久久国产成人精品二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 男女边吃奶边做爰视频| 真实男女啪啪啪动态图| 最新中文字幕久久久久| 国产精品永久免费网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品综合久久久久久久免费| 嫩草影院入口| 亚洲最大成人中文| 九九热线精品视视频播放| 日韩一区二区视频免费看| 国产一区二区激情短视频| 欧美潮喷喷水| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品一二三区在线看| 99国产极品粉嫩在线观看| 少妇熟女欧美另类| 男人舔奶头视频| 国产麻豆成人av免费视频| 大型黄色视频在线免费观看| 99在线视频只有这里精品首页| 麻豆久久精品国产亚洲av| 男女视频在线观看网站免费| 一个人看的www免费观看视频| 成人午夜高清在线视频| 在线播放无遮挡| 99九九线精品视频在线观看视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 九九热线精品视视频播放| 赤兔流量卡办理| 18禁在线播放成人免费| 内射极品少妇av片p| а√天堂www在线а√下载| 国产精品亚洲美女久久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美成人一区二区免费高清观看| av福利片在线观看| 午夜老司机福利剧场| 精品不卡国产一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 成人毛片a级毛片在线播放| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美丝袜亚洲另类| 午夜福利18| 蜜桃久久精品国产亚洲av|