玉蟬顆粒制備工藝與質(zhì)量標準研究

胡穗發(fā)，劉建芳，劉林林，陳琳，郭智強，肖銳

1.南昌市洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330038；2.南昌市博澤康醫(yī)藥科技有限公司，江西 南昌 330029

咳嗽是呼吸系統(tǒng)疾病中常見的癥狀之一，中醫(yī)學認為咳嗽既是肺系疾病中的一個癥狀，又是一種獨立的疾病?！毒霸廊珪芬院嗰S繁，將咳嗽分為外感咳嗽和內(nèi)傷咳嗽兩大類，一直沿用至今。中醫(yī)治療咳嗽可分為：（1）三因制宜，高度個體化，精準辯論治；（2）多環(huán)節(jié)，多靶點復方效應；（3）標本兼治［1］?？人匀菀渍T發(fā)支氣管的痙攣，從而造成呼吸困難。蟬蛻具有散熱、止咳平喘的作用，對表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咽癢等癥可用蟬蛻輔助治療。有研究證明蟬蛻提取物對支氣管和肺組織炎性都有明確的改善作用，可通過改善血瘀情況來緩解支氣管痙攣［2］。玉蟬顆粒由蟬蛻、蘆根、桔梗等11 味中藥組成，臨床用于主治風邪犯肺型咳嗽［1］。玉蟬湯源于《溫病條辯》中沙參麥冬湯和《傷寒論》的桔梗湯加減演化而來。在南昌市洪都中醫(yī)院（以下簡稱我院）臨床用于治療咳嗽效果顯著，無不良反應?，F(xiàn)我院將該方制成中藥顆粒劑，具有儲存攜帶方便，質(zhì)量穩(wěn)定，廣泛使用等優(yōu)點。參考相關文獻，對玉蟬顆粒的制備工藝和質(zhì)量標準作如下研究。

1 儀器及材料

PWN225DZH 電子天平（美國奧豪斯儀器有限公司），YJDJ08 自動煎藥包裝機（長沙市卓成醫(yī)療器械有限公司），DZ-2BC 真空干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司），1260 安捷倫高效液相色譜儀，超聲儀KQ2200DB（昆山超聲波儀器有限公司），NC-BY30 超純水發(fā)生器（重慶隆暾科技有限公司），薄層層析用硅膠G 板（青島海洋化工有限公司）。

麥芽糊精（批號：20220502M，江西景漢藥用輔料公司），牛蒡苷對照品（批號：P2378091，上海詩丹德生物技術有限公司），百部對照藥材（批號：121588-201502）、牛蒡子對照藥材（批號：120903-201811）、甘草對照藥材（批號：121303-201704）、桔梗對照藥材（批號：121028-202113）、甘草苷對照品（批號：111610-201908）、纈氨酸對照品（批號：140681-2017803）、丙氨酸對照品（批號：140680-202005）均來源于中國食品藥品檢定研究院。色譜級乙腈、甲醇（購于安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆渌噭榉治黾?。玉蟬顆粒供試品及陰性樣品由我院制劑室自制。

2 方法與結果

2.1 浸膏制備工藝優(yōu)選

2.1.1 水提工藝優(yōu)選以藥材提取時的加水量、提取時間、提取次數(shù)為單因素指標，考察浸膏中牛蒡苷的含量，確定每個單因素的3 個水平，選定的因素水平見表1。再按玉蟬顆粒的處方比例，分別稱取1 日劑量的飲片9 份，進行正交試驗，并測定各試驗組中牛蒡苷的含量。結果見表2。

表1 正交試驗因素與水平表

表2 正交試驗結果及直觀分析結果

由表2 直觀分析結果可見，以牛蒡苷含量為評價指標考察提取效果的因素順序為B＞A＞C，優(yōu)選工藝為A3B2C2，即藥材飲片加15 倍量水，煎煮兩次，每次1.5 h。

2.1.2 浸膏得率驗證試驗根據(jù)優(yōu)選的提取工藝條件A3B2C2，取玉蟬顆粒的處方比例飲片共3 份，進行平行驗證試驗，合并煎液，濃縮，65 ℃真空干燥成干膏。干膏得率結果見表3。3 次測定的平均值為24.20%，RSD 為1.18%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表3 浸膏得率結果

2.2 樣品的制備

中藥浸膏粉黏性大，且吸濕性強，直接制成顆粒存在困難，在浸膏粉中加入合適的輔料可以降低浸膏粉的黏性，同時也可改善其吸濕性和增加顆粒的流動性，對于顆粒劑的成型、分裝與儲存非常有利。顆粒劑傳統(tǒng)制備時選用輔料有糊精、蔗糖、麥芽糊精、玉米淀粉等。麥芽糊精溶化性好、價格便宜，且在顆粒劑制劑中應用非常廣泛，因此選用麥芽糊精作為輔料［3］。通過制粒難易來優(yōu)選浸膏與麥芽糊精的比例，最終確定玉蟬顆粒中干膏粉：麥芽糊精按1∶0.7 的比例進行混合均勻后，以95%的乙醇為潤濕劑制粒，70 ℃干燥2 h，即得。

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1 桔梗取玉蟬顆粒5 g，研細，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL溶解，用水飽和正丁醇60 mL 振搖提取，分取正丁醇液，用氨試液60 mL 洗滌，棄去氨液，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取桔梗對照藥材1 g，加50%甲醇50 mL，同法制成對照藥材溶液［4］。采用硅膠G 薄層板，點樣量各5 μL，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯示清晰。結果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖1。

圖1 桔梗薄層色譜圖

2.3.2 百部取玉蟬顆粒1.5 g，研細，加乙醇20 mL和鹽酸1 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液。取百部對照藥材0.5 g，加水50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣自“加乙醇20 mL 與鹽酸1 mL”起，同法制成對照藥材溶液［5］。采用硅膠G薄層板，點樣量各1 μL，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（4∶2∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。見圖2。

圖2 百部薄層色譜圖：1.百部對照藥材；2～4.玉蟬顆粒供試品；5.陰性樣品

2.3.3 牛蒡子取玉蟬顆粒10 g，研細，加水50 mL溶解，加乙醇至含醇量60%，靜置，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL 溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液40 mL洗滌，棄去氨液，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取牛蒡子對照藥材1 g，加乙醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至約2 mL，作為對照藥材溶液［6］。采用硅膠G 薄層板，點樣量各2 μL，以三氯甲烷-甲醇-水（40∶10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯示清晰。結果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖3。

圖3 牛蒡子薄層色譜圖：1.牛蒡子對照藥材；2～4.玉蟬顆粒供試品；5.陰性樣品

2.3.4 炙甘草取玉蟬顆粒3 g，研細，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL 溶解，用正丁醇60 mL 振搖提取，分取正丁醇液，用水60 mL 洗滌，棄去水洗液，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇10 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取甘草苷對照品，加甲醇制成每1 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液［7］。采用硅膠G 薄層板，點樣量各1 μL，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱3 min，立即置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。見圖4。

圖4 甘草薄層色譜圖：1.甘草苷對照品；2～4.玉蟬顆粒供試品；5.陰性樣品

2.4 含量測定方法與結果

2.4.1 液相色譜條件［8］選用Agilent 5 TC-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇為流動相A，以磷酸溶液（pH=2.58）為流動相B，梯度洗脫比例按表4進行；檢測波長280 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃。

表4 梯度洗脫表

2.4.2 對照品溶液制備取牛蒡苷對照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含36 μg 的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液制備取玉蟬顆粒粉末約5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理60 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加水30 mL 使溶解，用乙酸乙酯萃取6 次，每次30 mL，合并乙酸乙酯層，置水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解并定容至25 mL，搖勻，即得。

2.4.4 陰性對照溶液的制備按樣品制法制備缺牛蒡子的陰性樣品，取適量，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.4.5 專屬性考察分別吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各5 μL，按“2.4.1”項下的色譜條件測定，記錄高效液相色譜圖，結果方法專屬性好，陰性對照無干擾。見圖5。

圖5 HPLC色譜圖：A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液

2.4.6 提取方式、提取時間考察采用加熱回流提取和超聲提取分別對樣品進行處理并測定含量，當提取方式為超聲提取，提取時間為60 min 時，牛蒡苷含量最高。見表5。

表5 提取方式與提取時間試驗結果

2.4.7 線性關系考察以甲醇為稀釋劑對牛蒡苷對照品儲備液（0.719 1 mg/mL）進行稀釋，制備濃度分別為0.071 9 mg/mL、0.215 7 mg/mL、0.251 7 mg/mL、0.431 5 mg/mL、0.503 4 mg/mL、0.719 1 mg/mL 的對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定。得峰面積（Y）-濃度（X，mg/mL）線性回歸方程為：Y=2 817.1X-6.299 2，r=0.999 7，試驗結果表明牛蒡苷在0.071 9 mg/mL～ 0.719 1 mg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好線性關系。

2.4.8 精密度試驗精密吸取濃度為0.359 6 mg/mL的牛蒡苷對照品溶液5 μL，按“2.4.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，重復進樣6 次。牛蒡苷峰面積RSD 為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.4.9 溶液穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液按“2.4.1”項下色譜條件，分別于室溫放置0 h、3 h、8 h、15 h、23 h、27 h、36 h 后測定峰面積，結果RSD 為0.71%，說明樣品溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定

2.4.10 方法耐用性試驗更換不同的操作人員、不同色譜柱和不同高效液相色譜儀進行方法的耐用性考察，結果該方法穩(wěn)定耐用。

2.4.11 重復性試驗按“2.4.3”項下的方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，結果測得樣品中牛蒡苷平均含量為5.191 3 mg/g，RSD 為1.32%，表明該方法重復性良好。

2.4.12 回收率試驗取已知含量的玉蟬顆粒樣品粉末9 份，每份約2.5 g，精密稱定，每3 份為一濃度組，分別加入低、中、高濃度的牛蒡苷對照品，按“2.4.3”項下方法制得回收率供試溶液品。分別吸取5 μL注入液相色譜儀，計算牛蒡苷的回收率，結果平均加樣回收率為95.70%，RSD 為0.51%，表明該方法準確性良好。見表6。

表6 加樣回收試驗結果

3 討論

玉蟬顆粒重用蟬蛻，其水溶性成分為氨基酸。氨基酸HPLC 含量測定需要柱前衍生成具有熒光吸收的物質(zhì)，經(jīng)過氨基酸專用分析色譜柱洗脫在紫外可見光下進行定量［9］。柱前衍生對實驗環(huán)境和實驗者要求較高，操作過程不易控制。且氨基酸的專屬性不強，故本研究未納入蟬蛻的含量測定，期待后續(xù)能完善方法。

玉蟬顆粒采用了薄層色譜方法對桔梗定性鑒別。桔梗皂苷的紫外最大吸收波長為205 nm，屬末端吸收，溶劑干擾較大，桔梗皂苷E 和D 含量低，單點外標法測定誤差較大，故未將桔梗皂苷含量測定納入本研究。

本研究采用正交試驗優(yōu)化了提取工藝并優(yōu)選了制粒所用輔料和方法。建立了處方中桔梗、百部、牛蒡子、炙甘草四味藥材的薄層色譜鑒別和牛蒡苷的高效液相色譜含量測定方法。所建立的方法為更好地控制該玉蟬顆粒的質(zhì)量提供了依據(jù)。