多通道非接觸電導檢測裝置用于自由流電泳分離在線檢測

梁子其, 張 強, 姜曉騰, 劉小平, 曹成喜, 肖 華*, 劉偉文*

(1.上海交通大學電子信息與電氣工程學院,上海 200240;2.上海交通大學生命科學技術學院,上海 200240)

自由流電泳(free-flow electrophoresis,FFE)是一種無支持介質(zhì)的全液相電泳技術,兼具分析和制備兩種功能[1,2]。與其他電泳技術相比,自由流電泳技術具有分離環(huán)境溫和、回收率高、可持續(xù)分離等優(yōu)點,已用于多肽、蛋白質(zhì)、細胞和微生物等的分離[3-5]。在FFE分離實驗中,無論是各組分溶液特性參數(shù)的在線檢測,還是實時掌握分離的實驗進度,對于分離實驗的研究都具有非常重要的意義。然而,因管路系統(tǒng)復雜(通道多),現(xiàn)有的FFE裝置都不具備在線檢測功能,這樣不僅無法實時掌握分離的實驗進度,而且對各組分溶液特性參數(shù)的檢測也仍然依賴于分離后再進行離線檢測,這種方式極不便利,費工費時,另外在進行細胞的細胞器分離時還尤其不利于細胞器生物活性的維持[6-11]。

電容耦合非接觸式電導檢測(capacitively coupled contactless conductivity detection,C4D)為解決這些問題開辟了新的道路。1980年,Ga?等[12]首先提出了C4D的概念,并將其應用于同位素檢測。Zemann等[13-15]在1998年設計了一種軸向雙電極的C4D裝置,用作毛細管電泳分離檢測器。在過去的二十年中,由于C4D具有靈敏度高、體積小、非接觸檢測和成本低等優(yōu)點,其已廣泛應用于電泳及液相色譜中對分析物的電導率進行在線檢測[16-22]。2001～2002年,Laugere等[23,24]提出了四電極的C4D裝置,通過減少耦合電容的影響,提高了芯片電泳中載體緩沖液電導率的檢測范圍(0.2～20 mmol/L,0.014～2.7 mS/cm)。Shih等[25]在2006年運用并聯(lián)諧振的方法,提出了靈敏度提高10 000倍的C4D檢測器,用于檢測稀釋后低濃度的電解質(zhì)。然而目前這種單通道C4D操作繁瑣,無法滿足FFE多通道在線檢測的要求。如果采用32通道并行檢測,則需整體設置32個并行的C4D檢測器,這樣做不但體積非常龐大、電路系統(tǒng)復雜以及安裝調(diào)試困難,而且也將使得FFE設備的造價極其昂貴。

本工作發(fā)展了一種多通道電容耦合式非接觸電導檢測(multi-channel capacitively coupled contactless conductivity detection,MC-C4D)裝置。MC-C4D裝置采用了并行分時的非接觸電導檢測技術,即由多個同樣的非接觸電導檢測模塊并行排列,而單個電導檢測模塊又由多個非接觸電導檢測池組成,采用模擬開關切換這些檢測池以分時檢測流經(jīng)相應檢測池溶液的電導率。多個檢測模塊的檢測池總數(shù)等于FFE的組分數(shù),它們分別串行接入到FFE各流路中,這樣MC-C4D裝置就可在線并行分時測量各組分溶液的電導率。為驗證所設計裝置的檢測性能,采用配制的氯化鉀(KCl)標準溶液作為檢測對象對其進行了標定和測試。另外,將MC-C4D裝置應用于往復式自由流等電聚焦電泳(reciprocating free-flow isoelectric focusing,RFFIEF)在蛋白質(zhì)聚焦過程中對各組分溶液電導率進行實時在線檢測,結果表明,所開發(fā)的MC-C4D裝置不僅可實時在線檢測各組分溶液的電導率,而且還可輔助掌握分離的實驗進度,提高了FFE裝置的實用性。

1 實驗部分

1.1 儀器

通用電源PacTMHV(Bio-Rad,美國)用于自由流電泳。帶有DJS-1C電導電極的商用接觸式電導率儀DDS-307(REX,上海)用于電導檢測[26]。數(shù)據(jù)采集卡MP417(北京雙諾測控技術有限公司,北京)用于采集MC-C4D裝置的輸出信號。旋渦混合器VORTEX-6(其林貝爾儀器制造有限公司,浙江)用于樣品配制,智能手機HUAWEI P30Pro(華為,廣東)用于拍照記錄自由流電泳分離室中蛋白質(zhì)條帶分布情況。超純水系統(tǒng)(SG Water公司,德國)用來生產(chǎn)電導率低至0.055 μS/cm的去離子水。

1.2 試劑

藻藍蛋白(C-PC,Mr40 kDa,pI 5.2)購自上海生物化工股份有限公司。牛血紅蛋白(Hb,Mr64.5 kDa,pI 6.8)購自中國醫(yī)藥集團有限公司。載體兩性電解質(zhì)(pH 3～10,固體含量40%)購自上海伯楷安生物科技有限公司。羥丙基甲基纖維素(hypromellose,HPMC)購自北京百靈威科技有限公司。氫氧化鈉、磷酸、KCl、甘油等化學試劑均為分析純,購自中國醫(yī)藥集團有限公司。

1.3 溶液的制備

稱取一定量的KCl并在干燥器中干燥2 h。之后,在天平上稱量7.456 g KCl,并將其溶解在去離子水中,配制50 mmol/L的KCl原液2 L。用去離子水稀釋原液,得到0.05～20 mmol/L(相當于0.007 5～2.776 mS/cm,溫度為25 ℃時)的一系列KCl標準溶液。放入試劑瓶中備用,用于MC-C4D裝置的標定和性能測試。

在研究FFE等電聚焦過程實驗時,載體緩沖溶液組成為10%(v/v)甘油、3%(v/v)載體兩性電解質(zhì)、0.3 g/L HPMC,其余成分為去離子水;配制120 mL上述載體緩沖溶液,將15 mg藻藍蛋白和15 mg牛血紅蛋白溶于載體緩沖溶液,放入試劑瓶中備用。

取0.614 mL的磷酸(分析純),加去離子水定容,配制100 mL的100 mmol/L的磷酸溶液作為陽極液;取0.4 g的氫氧化鈉(分析純),加去離子水定容,配制100 mL的100 mmol/L的氫氧化鈉溶液作為陰極液。

1.4 MC-C4D裝置

圖1是MC-C4D裝置非接觸電導檢測模塊示意圖,包括非接觸電導檢測池陣列、交流激勵源、激勵信號模擬開關、接收信號模擬開關、信號處理模塊、數(shù)據(jù)采集卡和計算機,其中非接觸電導檢測池陣列包含16個電導檢測池,每個電導檢測池又由激勵電極(a)、接收電極(b)、絕緣測試管道(c)和屏蔽單元(d)組成。在計算機上開發(fā)的自動測量軟件控制下,交流激勵源經(jīng)激勵信號模擬開關分時加載到各檢測池的激勵電極上,而在各接收電極上拾取的接收信號同樣在自動測量軟件的控制下經(jīng)接收信號模擬開關同步分時連接到信號處理模塊,信號處理模塊對接收信號進行電流/電壓轉(zhuǎn)換、放大以及二極管峰值整流處理之后輸出直流電壓信號至數(shù)據(jù)采集卡,最后將經(jīng)數(shù)據(jù)采集卡數(shù)字化的信號輸入計算機由自動測量軟件進行處理。由于交流激勵源和接收信號都為雙極性信號以及為了減小模擬開關接入對C4D檢測性能的影響,這里采用了可雙極性供電和具有低導通電阻的模擬開關。另外,每個電導檢測池都設有屏蔽單元,起到減小電導檢測池的極間干擾和外部干擾的目的。

圖1 MC-C4D裝置非接觸電導檢測模塊示意圖Fig.1 Schematic of contactless conductivity detection module of multi-channel capacitively coupled contactless conductivity detection (MC-C4D)devicea.excitation electrode;b.detection electrode;c.insulating pipe;d.shielding unit.

考慮到FFE裝置通道數(shù)多為16的倍數(shù),單個電導檢測模塊設置為16個電導檢測池(即16通道),當FFE裝置通道數(shù)大于16通道時,則根據(jù)總通道數(shù)目并行設置多個電導檢測模塊。這種設計方式不但大大減小了MC-C4D裝置的體積,而且簡化了裝置的電路系統(tǒng),同時使得MC-C4D裝置易于安裝調(diào)試并減小了制作成本。

自動測量軟件如圖2所示,軟件采用Visual Studio平臺開發(fā),適用于1～96通道MC-C4D裝置,單通道最高采樣頻率最高可達20 Hz,具有連續(xù)測試、FFE測試和標定測試以及測試結果查詢與顯示等功能。由于C4D檢測器直接輸出結果是非線性的,因此自動測量軟件在標定測試結束后對每個通道的測量結果都進行了6次多項式擬合修正,從而實現(xiàn)了C4D檢測器的線性輸出。

圖2 自動測量軟件界面圖Fig.2 Interface diagram of automatic measurement software

圖3是32通道MC-C4D裝置示意圖,它由2個電導檢測模塊、箱體、數(shù)據(jù)采集卡和計算機組成,其中檢測模塊設置在箱體上半部分內(nèi),數(shù)據(jù)采集卡則放置在箱體的下半部分內(nèi)并經(jīng)數(shù)據(jù)線與計算機連接。MC-C4D裝置的核心是電導檢測模塊,它由上盒蓋(a)、電路板(b)、檢測池陣列模塊(c)和下盒蓋(d)組成,其中檢測池陣列模塊(c)又由蓋板(c1)、檢測池陣列(c2)和陣列式通道槽板(c3)組成,單個電導檢測模塊尺寸為23 cm×8.4 cm×3.5 cm。檢測池陣列(c2)是電導檢測傳感單元,它由16個電導檢測池構成,每個電導檢測池又由外殼、PEEK管、激勵電極和接收電極組成。這里,外殼長度6.5 cm;聚醚醚酮(PEEK)管內(nèi)徑0.1 cm,外徑0.16 cm,長度11 cm;激勵和接收電極長度均為2.5 cm;激勵和接收電極間距為0.8 cm。制作時,根據(jù)上述參數(shù)在PEEK管上將銅箔膠帶手動緊密繞制2圈,用這種方法分別繞制激勵電極和接收電極,裝進外殼并用膠水固定。上盒蓋(a)、下盒蓋(d)、蓋板(c1)和陣列式通道槽板(c3)均采用金屬材料制作,安裝好后與電路板的地線連接,起到了屏蔽電導檢測池的極間以及外部干擾作用,提高了MC-C4D裝置的抗干擾能力。MC-C4D裝置中激勵信號的頻率是110 kHz,采用5 V電源供電。

圖3 32通道MC-C4D裝置示意圖Fig.3 Schematic of the 32-channel MC-C4D device a.upper box lid;b.circuit board;c.detection cell array module;d.lower box lid.c1.cover plate;c2.detection cell array;c3.array channel slot plate.

1.5 標定測試和FFE實驗操作方法

將MC-C4D裝置串聯(lián)接入FFE裝置管路系統(tǒng)中,如圖4所示。在開始測試前用去離子水將FFE裝置管路沖洗多次,使得MC-C4D裝置檢測到的各個通道溶液電導率均較低(一般小于0.005 mS/cm)時,表明清洗完成。

圖4 MC-C4D裝置應用于RFFIEF儀器Fig.4 MC-C4D device set in reciprocating free-flow isoelectric focusing (RFFIEF)instrument

標定測試 調(diào)節(jié)多通道流量控制器,打開分離室入口,關閉廢液出口,將120 mL的0.1 mmol/L的KCl標準溶液從靠近離子交換膜一側(cè)的重力平衡管中緩慢加入,在另一側(cè)的重力平衡管用注射器抽出空氣,直到32個重力平衡管中的液面高度一致,表明分離室和MC-C4D裝置中已經(jīng)沒有氣泡。在FFE裝置控制軟件界面打開背景液驅(qū)動泵,設定載體緩沖液在分離室往復流動的速度約為1 mL/min每個進液口,分離室溫度為25 ℃,溫度穩(wěn)定后使用MC-C4D自動測量軟件(見圖2)對各個通道進行連續(xù)測試,待輸出電壓值穩(wěn)定后切換到標定測試,獲得各通道在這種標準溶液下的電導率檢測結果。結束后將裝置內(nèi)的溶液排出,用去離子水將裝置沖洗干凈并排空。接著按照濃度從低到高依次更換標準溶液重復上述操作,獲得各通道在不同濃度標準溶液下的電導率檢測結果。測試完成后點擊標定計算,使用多項式擬合法將各個測試點擬合出平滑曲線并獲得修正系數(shù),結果保存在計算機中。

FFE實驗操作 調(diào)節(jié)多通道流量控制器,打開分離室入口,關閉廢液出口,將120 mL溶有15 mg藻藍蛋白和15 mg牛血紅蛋白的載體緩沖液從靠近離子交換膜一側(cè)的重力平衡管中緩慢加入,溶液沿著離子交換膜流入分離室,在另一側(cè)的重力平衡管用注射器抽出空氣,直到32個重力平衡管中的液面高度一致。在FFE裝置控制軟件界面打開背景液驅(qū)動泵,設定載體緩沖液在分離室往復流動的速度約為1 mL/min每個進液口,分離室溫度為10 ℃。將100 mmol/L磷酸溶液和100 mmol/L氫氧化鈉溶液分別作為陽極和陰極的電極液,打開電極液驅(qū)動泵,電極液在電極室中循環(huán),流速為5 mL/min。溫度穩(wěn)定后使用MC-C4D自動測量軟件進行在線電導率檢測,打開分離電場電源,首先設定在恒功率模式25 W運行60 min,然后采用恒電壓模式1 000 V運行30 min。等樣品被充分等電聚焦分離后,待載體緩沖溶液和樣品都流到靠近離子交換膜一側(cè)的重力平衡管中時,關閉背景液驅(qū)動泵,調(diào)節(jié)多通道流量控制器,關閉分離室入口,打開廢液出口,載體緩沖溶液和已經(jīng)實現(xiàn)分離的各個樣品組分在重力的作用下流入回收器,完成整個過程。實驗之后要使用大量去離子水沖洗裝置,防止污染。

2 結果與討論

2.1 MC-C4D裝置性能

取1.3節(jié)中配制的KCl標準溶液,在一天內(nèi)重復測量3次,得到MC-C4D裝置的檢測范圍、相對標準偏差(RSD,n=3)、檢出限(limit of detection,LOD)、相對誤差(relative error,RE)和通道測量相對偏差。檢測范圍是0.015～2.5 mS/cm,RSD小于2.31%,測試結果表明裝置檢測范圍較大,重復性好。隨著KCl溶液逐漸稀釋,對應溶液的電導率逐漸降低,當輸出的結果和噪聲幅度的比值為3倍時(S/N=3),記錄此時KCl溶液對應的電導率,得到MC-C4D裝置的LOD為0.002 mS/cm。跟標準溶液電導率相比較,MC-C4D裝置的電導檢測結果RE小于3.03%,另外通道間測量相對偏差小于1.60%,這些都說明所開發(fā)的裝置通道間測量相對偏差較小,測量準確性高。

2.2 實驗結果分析

圖5是在RFFIEF運行期間分離室中蛋白質(zhì)條帶的照片。圖5a是等電聚焦開始0 min時分離室的照片,此時在分離室中看不出任何差異。圖5b是等電聚焦開始后30 min時分離室的照片,從圖中可以發(fā)現(xiàn)在下方靠近陽離子交換膜的位置,有較弱的藻藍蛋白條帶。隨著電泳時間延長,藻藍蛋白和血紅蛋白的條帶越來越明顯,如圖5c為電泳開始后60 min時藻藍蛋白和血紅蛋白條帶聚焦狀況。當電泳時間達到90 min后,蛋白質(zhì)條帶變得更加明顯,但是其所處位置和60 min時相比變化不大,這說明此位置pH值與其pI值相等,藻藍蛋白和血紅蛋白已經(jīng)充分等電聚焦(見圖5d)。

圖5 在RFFIEF運行期間分離室中蛋白質(zhì)條帶的照片F(xiàn)ig.5 Photographs of protein bands in the separation chamber during RFFIEF runsa.0 min;b.30 min;c.60 min;d.90 min.

圖6是10 ℃時MC-C4D裝置在RFFIEF運行過程中對32個通道進行組分溶液電導率的自動檢測結果。在等電聚焦開始0 min時,緩沖液和蛋白質(zhì)均勻混合后第一次經(jīng)過分離腔后,離子在電場中未達到平衡裝填且pH梯度尚未完全形成,不同通道溶液的電導率差異較小,整體分布較為平緩。當實驗進行在電泳30 min時,蛋白質(zhì)逐漸在陽極端開始富集,蛋白質(zhì)在向pI點聚集的過程中自身的凈電荷量逐漸減小,這意味著其導電性逐漸減小,此時靠近陽極端通道溶液的電導率明顯減小。在電泳聚焦60 min時,蛋白質(zhì)富集明顯,對應聚焦區(qū)域通道內(nèi)溶液電導率進一步減小,同時靠近電極端離子存在堆積,導致相應通道內(nèi)溶液電導率增大。此時最小電導率值出現(xiàn)在第7通道,這說明蛋白質(zhì)主要富集在第7通道附近。電泳聚焦90 min時,對應聚焦區(qū)域內(nèi)通道溶液電導率不再減小,但是聚焦區(qū)域有所減小且最小電導率值出現(xiàn)在第8通道附近,與60 min聚焦結果相比蛋白聚焦區(qū)域略有偏移,此時可以認為蛋白聚焦完成。

圖6 采用圖4的MC-C4D裝置對RFFIEF的32個通道中載體緩沖溶液電導率進行自動檢測的結果Fig.6 Automatic detection results of carrier buffer conductance in 32 flow channels of RFFIEF by using the MC-C4D device shown in Fig.4

2.3 與其他方法的比較

將本文開發(fā)的MC-C4D裝置與商用接觸式電導檢測裝置和單通道C4D裝置進行比較,結果見表1。

從表1中可知,MC-C4D裝置通道多,測量自動化程度高,因此其在多通道自動檢測場景下?lián)碛歇毺氐膬?yōu)勢。雖然MC-C4D裝置測量范圍不及DDS-307和文獻[27]中的單通道C4D,但其已經(jīng)可以滿足FFE裝置的要求。另外,我們知道,DDS-307是依賴手動切換擋位或者檢測探頭來達到0～100 mS/cm測量范圍的,而單通道C4D要實現(xiàn)0.01～1 000 mS/cm測量范圍也同樣需要手動更換檢測頭。

表1 MC-C4D裝置與DDS-307和單通道C4D裝置性能的比較Table 1 Comparison between MC-C4D device with DDS-307 and single-channel C4D device

3 結論

本文發(fā)展了一種MC-C4D裝置,開發(fā)了自動測量軟件。MC-C4D裝置采用了并行分時的非接觸電導檢測技術,實現(xiàn)了FFE裝置對各組分溶液電導率的實時在線檢測功能。為了驗證MC-C4D裝置的性能,采用配制的KCl標準溶液作為檢測對象對其進行了標定和測試。實驗結果表明,MC-C4D裝置檢測范圍較大、LOD低、重復性好、準確性高以及通道間測量相對偏差小。最后還將MC-C4D裝置成功應用于往復式RFFIEF在蛋白質(zhì)聚焦過程中對各組分溶液電導率的實時在線檢測。研究結果表明MC-C4D裝置具有性能好、體積小、電路系統(tǒng)簡單、安裝調(diào)試容易和成本低廉等優(yōu)點,可在多通道測量、在線檢測和過程監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。