同位素內(nèi)標(biāo)-氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜法檢測血清中多溴聯(lián)苯醚

王夢夢, 謝琳娜, 朱英, 陸一夫

(中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與人群健康重點實驗室,中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所,北京 100021)

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs),是一種持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants,POPs),根據(jù)苯環(huán)上溴原子的取代個數(shù)和位置的不同,共有10類209種同系物。由于其阻燃性能良好,被廣泛應(yīng)用于紡織品、玩具、建筑材料和電子設(shè)備等產(chǎn)品中[1,2]。PBDEs的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,親脂性強(qiáng),容易釋放到環(huán)境中,并通過食物鏈對生物體產(chǎn)生生物蓄積與生物放大作用,產(chǎn)生甲狀腺毒性、神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌毒性、生殖毒性、肝臟毒性、細(xì)胞毒性、致癌性等[3-10]。

PBDEs對人體健康的影響已成為世界范圍內(nèi)高度關(guān)注的問題,目前針對多溴聯(lián)苯醚人群暴露情況的研究,分析樣本主要為血液、母乳和各種組織(脂肪、胎盤等)[11]。由于多溴聯(lián)苯醚是脂溶性化合物,在尿液中含量較低且多以羥基化代謝物的形式存在,脂肪組織的采樣具有侵害性,且母乳和胎盤的采樣僅限于一部分特殊人群,而血液樣本相對較易獲得,所以血液樣本的測定是研究多溴聯(lián)苯醚對人群健康影響的主要途徑。

人體血清基質(zhì)復(fù)雜,PBDEs含量較低,因此需提高富集效率并盡可能降低基質(zhì)干擾,提高檢測靈敏度。目前,液液萃取法、固相萃取法和加速溶劑萃取法是樣品提取時較常使用的方法,樣品凈化主要使用凝膠色譜法和固相萃取柱凈化法,檢測方法主要有液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[12,13]、氣相色譜-負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜法(GC-NCI/MS)[14]和氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜法(GC-HRMS)[15,16]。LC-MS前處理步驟相對簡便,但對PBDEs分辨能力較弱、靈敏度較低,更適合易熱降解的高溴代多溴聯(lián)苯醚的測定;GC-MS/MS、GC-NCI/MS選擇性、靈敏度較高,對復(fù)雜基質(zhì)抗干擾能力強(qiáng),適用于痕量PBDEs的測定,但樣本需求量較大,需采集2～5 mL血清樣本;GC-HRMS同時備有靜電場離子分析器和磁場質(zhì)量分析器,因而使儀器同時具有能量聚焦和方向聚焦的雙聚焦功能,靈敏度高、檢出限低,適用于小體積樣本中痕量和超痕量PBDEs的測定。目前常用的GC-HRMS樣品前處理步驟中主要采用凝膠色譜和酸性硅膠柱對樣品進(jìn)行凈化,其中凝膠色譜法樣本需求量較大(2 mL),酸性硅膠柱對實驗人員填裝操作要求較高,且無法同時測定多種PBDEs組分(如BDE-209等),批量樣品檢測時效率較低。本方法探索使用少量血清(0.5 mL),采用GC-HRMS結(jié)合液液萃取和硅膠柱凈化的方法,建立了人血清中14種PBDEs的測定方法,并用該方法對某地區(qū)15份青少年人群血樣進(jìn)行了檢測,以期了解該地區(qū)青少年人群PBDEs的暴露水平。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Autospec Premier氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜儀(美國Waters公司),JA2003電子天平(上海舜宇恒平公司),FV64氮吹儀(廣州得泰公司),600C離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司),HyperSep Silica固相萃取柱(6 mL,500 mg)(美國Thermo公司)。

正己烷、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、甲醇、壬烷(色譜純,美國Merck公司),超純水(德國Merck公司),硫酸(分析純,中國國藥公司),標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)SRM1958(美國NIST標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。

14種PBDEs(包括BDE-17、BDE-28、BDE-47、BDE-66、BDE-71、BDE-85、BDE-99、BDE-100、BDE-138、BDE-153、BDE-154、BDE-183、BDE-190、BDE-209)購自美國AccuStandard公司;13C標(biāo)記的10種PBDEs (包括13C12-BDE-28、13C12-BDE-47、13C12-BDE-77、13C12-BDE-99、13C12-BDE-100、13C12-BDE-138、13C12-BDE-153、13C12-BDE-154、13C12-BDE-183和13C12-BDE-209)購自美國Cambridge Isotope Laboratories公司。

血清樣本:采集對象為某地區(qū)15名健康青少年,均告知研究目的并簽署了知情同意書。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

PBDEs標(biāo)準(zhǔn)使用溶液:以壬烷為溶劑配成BDE-209質(zhì)量濃度為5 mg/L、其他13種目標(biāo)物質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

PBDEs內(nèi)標(biāo)使用溶液:以甲苯為溶劑配成13C12-BDE-209質(zhì)量濃度為500 μg/L、其他9種13C標(biāo)記的PBDEs質(zhì)量濃度為50 μg/L的內(nèi)標(biāo)使用液。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品前處理

血清樣品解凍后移取0.5 mL于12 mL玻璃離心管中,分別加入200 μL硫酸、0.5 mL甲醇和20 μL內(nèi)標(biāo)使用溶液后混勻。先加入6 mL正己烷充分搖振后,以3 500 r/min離心10 min,收集上層有機(jī)相;再加入6 mL甲基叔丁基醚,重復(fù)萃取,合并兩次萃取液,于40 ℃、5 Pa氮吹25 min至0.5 mL。依次用2 mL甲醇和2 mL正己烷活化硅膠固相萃取柱,將濃縮液轉(zhuǎn)移到硅膠柱上,先收集流出液,再用10 mL二氯甲烷-正己烷(1∶1,v/v)溶液洗脫,合并流出液與洗脫液,40 ℃氮吹30 min至近干。向試管中加入10 μL正己烷復(fù)溶,振蕩混勻,轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣小瓶中,待測。

1.3.2色譜條件

色譜柱:Rtx-1614毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.1 μm);進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度:290 ℃;傳輸線溫度:320 ℃;升溫程序:初始溫度150 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升溫至250 ℃,保持1 min,再以25 ℃/min升溫至290 ℃,保持3 min,然后以25 ℃/min升溫至320 ℃,保持12.5 min;載氣:氦氣,恒定流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量為1 μL。

1.3.3質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源,源溫:280 ℃;電子能量:35 eV;電壓選擇離子檢測(VSIR);分辨率:10 000。14種PBDEs及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 14種PBDEs及其同位素內(nèi)標(biāo)的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and MS parameters of the 14 polybrominated diphenyl ethers (PBDEs)and their corresponding isotope internal standards

1.4 質(zhì)量控制

樣品前處理環(huán)境應(yīng)在每次實驗開始前和結(jié)束后進(jìn)行清理,避免有目標(biāo)物殘留。實驗過程中所用玻璃離心管、試劑、進(jìn)樣小瓶、固相萃取柱、槍頭均做空白對照實驗,未檢出14種待測PBDEs。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

目前PBDEs的氣相色譜-質(zhì)譜檢測通常需用兩根不同的非極性色譜柱完成。這是因為BDE-209熱穩(wěn)定性較差,易在色譜柱中分解,一般采用15 m或更短的色譜柱有利于縮短柱分離時間并提高響應(yīng),其他組分使用30 m的色譜柱進(jìn)行分離,檢測過程中需頻繁切換色譜柱,效率較低。本研究采用Rtx-1614毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.1 μm),相比常用的DB-5MS等非極性色譜柱,在保證低溴代組分分離完好的前提下,縮短柱分離時間,可有效防止BDE-209在色譜柱上的分解,可滿足同時測定多種PBDEs的需求,提高檢測效率。

2.1.2色譜條件的選擇

多溴聯(lián)苯醚沸點較高,沸程較寬(310～425 ℃),程序升溫過快,低溴代組分保留時間接近,不能較好分離;柱溫過低,高沸點組分不能完全氣化,響應(yīng)會明顯降低;柱溫過高會加速柱流失,降低柱效,縮短色譜柱使用壽命,因此升溫程序的最高溫度不宜超過320 ℃。分別比較了程序升溫最高溫度為300、310和320 ℃時目標(biāo)物響應(yīng)情況,發(fā)現(xiàn)320 ℃時可明顯提高高沸點組分(BDE-190和BDE-209)的響應(yīng)(見圖1),同時縮短了BDE-209的柱分離時間,防止其在色譜柱上的分解。

圖1 升溫程序最高溫度對部分目標(biāo)化合物響應(yīng)值的影響Fig.1 Effects of maximum temperature of temperature program on the response values of the target compounds

經(jīng)過優(yōu)化試驗,綜合考慮各組分的分離度、靈敏度及分析時間等因素,最終選擇初始溫度150 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升到250 ℃,保持1 min,再以25 ℃/min升到290 ℃,保持3 min,最后以25 ℃/min升到320 ℃,保持12.5 min的三階升溫模式。各組分分離度良好,14種PBDEs和10種相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的色譜圖見圖2。

圖2 (a)14種PBDEs和(b)同位素內(nèi)標(biāo)的色譜圖Fig.2 Chromatograms of (a)the 14 PBDEs and (b)their isotope internal standards a.The mass concentrations of 13 PBDEs were 50 μg/L and that of BDE-209 was 250 μg/L;b.The mass concentrations of the isotope internal standards of 13 PBDEs were 50 μg/L and that of 13C12-BDE-209 was 250 μg/L.

2.1.3質(zhì)譜條件的選擇

分別考察了離子源溫度分別為280、290和300 ℃時,目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度變化。溫度較高時,相對分子質(zhì)量較小的大部分化合物碎片離子較多,用于定性和定量的離子豐度下降;但相對分子質(zhì)量較大的化合物離子豐度較高。綜合這兩方面的因素,本方法離子源溫度設(shè)為280 ℃。

對傳輸線溫度進(jìn)行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)溫度變化對低溴代組分影響較小,對高溴代組分影響較大,尤其是BDE-209,隨著傳輸線溫度的升高不僅出峰時間加快,響應(yīng)也明顯提高(見圖3),最終傳輸線溫度設(shè)為320 ℃。

圖3 傳輸線溫度對目標(biāo)化合物響應(yīng)值的影響Fig.3 Effects of transmission line temperature on the response values of the target compounds

在特征碎片離子的確定過程中,重點優(yōu)化了BDE-209特征碎片離子的選擇。通過對比不同碎片離子響應(yīng),最終選擇響應(yīng)最強(qiáng)的BDE-209脫掉兩個溴離子的碎片離子[M-2Br]+,即m/z799作為監(jiān)測離子(見圖4)。

圖4 監(jiān)測離子對BDE-209響應(yīng)值的影響Fig.4 Effects of monitoring ion on the response values of the target compounds

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1萃取條件的選擇

酸化條件 由于人體血液樣品中多溴聯(lián)苯醚含量低,且樣品基質(zhì)復(fù)雜,常采用多層硅膠柱進(jìn)行凈化[17]。但由于無相應(yīng)的商品化產(chǎn)品,需人工填裝,過程繁瑣,重復(fù)性較差,大批量樣本檢測時效率較低。本實驗采用柱前加酸的方式完成去脂凈化,分別比較了甲酸、硫酸和鹽酸的去脂效果和回收率。結(jié)果表明,甲酸的效果較差,固相萃取凈化時易堵塞萃取柱,硫酸和鹽酸去脂效果和回收率均較好,但采用硫酸酸化后,高溴代組分如BDE-190和BDE-209的響應(yīng)更好,故選用硫酸酸化法去脂。

萃取溶劑 選擇常用的萃取溶劑正己烷和甲基叔丁基醚,比較了正己烷(12 mL)、甲基叔丁基醚(12 mL)和正己烷(6 mL)-甲基叔丁基醚(6 mL)對回收率的影響。結(jié)果(見圖5)表明,單獨使用正己烷或甲基叔丁基醚時,BDE-17等低溴代組分的回收率較差。最終選用正己烷(6 mL)-甲基叔丁基醚(6 mL)作為萃取溶劑。

圖5 萃取溶劑對目標(biāo)化合物回收率的影響(n=6)Fig.5 Effects of extraction solvent on the recoveries of the target compounds (n=6)

2.2.2固相萃取柱的選擇

液液萃取后需使用固相萃取柱對提取液進(jìn)行富集凈化,不同類型的填充料對實驗結(jié)果影響較大。本研究比較了填充料為硅膠和氧化鋁的固相萃取柱的凈化效果和對回收率的影響。結(jié)果表明,相比于氧化鋁固相萃取柱,使用硅膠固相萃取柱時各組分回收率更好(見圖6)。

2.2.3洗脫溶劑的選擇

洗脫溶劑的極性影響目標(biāo)物的洗脫效果。本方法比較了常用洗脫溶劑正己烷、二氯甲烷和正己烷-二氯甲烷(1∶1,v/v)對回收率的影響。結(jié)果表明,洗脫溶劑選擇正己烷-二氯甲烷(1∶1,v/v)時效果最好(見圖7)。

圖7 洗脫溶劑對目標(biāo)化合物回收率的影響(n=6)Fig.7 Effects of elution solvent on the recoveries of the target compounds (n=6)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍和檢出限

用正己烷配制目標(biāo)分析物質(zhì)量濃度分別為4、10、25、50、100和250 μg/L,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(BDE-209及其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度為上述質(zhì)量濃度的5倍),換算到人血清中的質(zhì)量濃度分別為0.08、0.2、0.5、1、2和5 μg/L(BDE-209質(zhì)量濃度為上述質(zhì)量濃度的5倍)。按照本方法儀器分析條件進(jìn)行測定,以目標(biāo)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)離子峰的峰面積之比為縱坐標(biāo),目標(biāo)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo),繪制校準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,14種PBDEs的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995。

參照美國疾病預(yù)防控制中心關(guān)于方法檢出限計算的要求,對質(zhì)量濃度為預(yù)估方法檢出限3～5倍的樣品重復(fù)測定n次(n≥7),以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為方法檢出限,10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限。本方法檢出限為0.01～0.51 μg/L,定量限為0.04～1.70 μg/L,結(jié)果見表2。

表2 14種PBDEs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限(MDL)和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (r),method detection limits (MDLs),and limits of quantification (LOQs)of the 14 PBDEs

2.3.2加標(biāo)回收率和精密度

以胎牛血清為基質(zhì)進(jìn)行低、中、高3個水平的加標(biāo)回收試驗,加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8 μg/L(BDE-209質(zhì)量濃度為上述質(zhì)量濃度的5倍),每個水平平行測定6次,考察日內(nèi)精密度,連續(xù)測定6天,考察日間精密度。14種PBDEs的平均回收率為75.5%～120.7%,日內(nèi)和日間精密度分別為3.8%～10.9%和4.2%～12.4%,結(jié)果見表3。

2.3.3正確度評價

用本方法測定美國NIST人血清標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)SRM1958,與其參考值進(jìn)行比較,結(jié)果均在參考值范圍內(nèi)(見表4)。

表4 SRM1958測定值與參考值比較(n=6)Table4 ComparisonofexperimentalresultsandcertifiedvaluesofSRM1958(n=6)CompoundExperimentalresult/(ng/g)Certifiedvalue/(ng/g)BDE-170.4530.458±0.032BDE-280.4660.462±0.019BDE-470.6560.651±0.029BDE-660.4710.440±0.041BDE-990.4840.492±0.015BDE-1000.4890.475±0.027BDE-1530.4120.455±0.054BDE-1540.4180.441±0.039BDE-1830.4250.453±0.042 NIST:NationalInstituteofStandardsandTechnology.

2.4 方法比較

對本方法和文獻(xiàn)報道的方法進(jìn)行比較,本方法共有3個優(yōu)點:(1)樣本需求量少:由于血清采集較難獲得大量樣本,本方法僅需0.5 mL血清樣本,更適用于PBDEs暴露對人體健康影響的研究。(2)檢測效率顯著提高:目前PBDEs的檢測需用兩根不同的非極性色譜柱完成,實際應(yīng)用過程中需要頻繁切換色譜柱,本方法可對包括BDE-209在內(nèi)的14種PBDEs同時測定,可有效提高檢測效率。(3)方法靈敏度高:與文獻(xiàn)報道方法[18-20]相比,本方法在減少取樣量的基礎(chǔ)上,可同時測定高溴代組分(如BDE-209),方法檢出限較低,可滿足實際樣品檢測的需求。

比較結(jié)果見表5。

表5 本方法與文獻(xiàn)報道的血清中PBDEs檢測方法的比較Table 5 Comparison of the developed method with other reported methods for the determination of PBDEs in serum samples

2.5 實際樣品測定

對某地區(qū)15份青少年人群的血清樣本進(jìn)行檢測,BDE-47檢出率為100%,含量范圍為1.86～4.66 ng/g(以脂重計),其他13種PBDEs均未檢出。根據(jù)文獻(xiàn)報道,中國普通人群血清中PBDEs單體含量在0.01～14.6 ng/g(以脂重計)之間[21-23],其中檢出率最高的為BDE-47。本研究樣品測定的結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

本文通過對色譜條件、質(zhì)譜條件和固相萃取柱類型、萃取和洗脫溶劑組成等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,建立了液液萃取-氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜測定人體血清中14種PBDEs的分析方法。本方法樣本量需求較少(0.5 mL),操作簡便,靈敏度和精密度可滿足實際樣品大批量檢測的需求。