磁性親水親脂平衡萃取材料輔助基質(zhì)固相分散萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定中藥材中76種農(nóng)藥殘留

魏 丹, 國 明

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院,河北 石家莊 050061;2.浙江省化工產(chǎn)品質(zhì)量檢驗站有限公司,浙江 杭州 310023)

中草藥主要來源于天然藥及其加工品,其中以植物藥居多,是中華文化的傳統(tǒng)用藥,至今在我國預防治療、養(yǎng)生與保健中發(fā)揮著不可替代的作用[1]。隨著中草藥市場規(guī)模的不斷擴大,其生產(chǎn)量與消費量不斷增加[2,3],大部分野生藥材資源已無法滿足藥用需求,栽培藥材已成為目前中藥材市場的主流藥品。在中藥材的栽培過程中不可避免地會發(fā)生病蟲草害,需要使用農(nóng)藥進行防治,然而農(nóng)藥的頻繁使用和濫用會導致中藥材中農(nóng)藥殘留超標,直接影響我國中藥材的質(zhì)量與安全[4,5]。

為了有效控制中藥種植中違規(guī)使用高安全風險、高殘留、高毒農(nóng)藥,從源頭把控中草藥質(zhì)量和安全,保障人民用藥安全,我國不斷改善中草藥中農(nóng)藥殘留標準。2020年版《中國藥典》全面制定植物類中藥材和飲片禁用農(nóng)藥的限量標準,不僅有效保障了人民用藥的安全性,同時引導中藥材種植過程中農(nóng)藥的合理使用,有效控制了大量使用禁用農(nóng)藥和濫用農(nóng)藥等行業(yè)共性問題,有助于推進中醫(yī)藥國際化[6]。建立可操作性強、準確度高、靈敏度高的中藥材中多種農(nóng)藥殘留同時篩查和檢測的方法顯得越來越重要。目前,色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有高靈敏度、專屬性強、高通量檢測等優(yōu)點,能夠滿足當前快速、準確、高效的檢測要求,已廣泛用于農(nóng)藥多殘留的檢測中[7-9]。中藥基質(zhì)復雜,含有有機酸、糖分、色素等基質(zhì)干擾物質(zhì),需要有效的樣品前處理方法實現(xiàn)對樣品的萃取富集。目前,應用于農(nóng)藥殘留的前處理方法有固相萃取[10,11]、液液萃取[12,13]和磁性固相萃取[14]等。這些方法通常適用于液體樣品。對于固體或粉末狀中藥材樣品,需要使用一定量的有機溶劑預提取后再進行凈化或吸附萃取。

基質(zhì)固相分散萃取(MSPD)通過將樣品和萃取材料混勻后研磨分散,可以均質(zhì)并將待測目標物很好地分散至萃取材料表面,以達到良好的分散萃取效果,具有樣品使用量少、有機試劑消耗少等優(yōu)點,適用于固體樣品前處理[15]。目前，QuEChERS常用于中藥材中農(nóng)藥多殘留的樣品前處理中[16,17]。但是,QuEChERS步驟通常包括提取、鹽析和離心等,而傳統(tǒng)的基質(zhì)固相分散萃取通常需要采用固相萃取柱進行裝柱,操作較為繁瑣。同時大多數(shù)的吸附劑無法滿足農(nóng)藥多殘留同時萃取的要求。因此,本實驗通過制備具有廣譜吸附特性的磁性親水親脂平衡萃取材料(Fe3O4@PLS),可以同時萃取非極性農(nóng)藥和極性農(nóng)藥(logP<4.5)[18],將其與粉末狀中藥材樣品一起研磨,在外部磁場的作用下,利用磁性基質(zhì)固相分散萃取法(MMSPD),實現(xiàn)了中藥材中多種類農(nóng)藥的分離和萃取,然后與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用,建立了同時測定中藥材中76種農(nóng)藥殘留的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 infinity高效液相色譜-6460 TripleQuad質(zhì)譜儀、ZORBAX EclipsePlus C18色譜柱(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)(美國Agilent公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);傅里葉變換紅外光譜分析儀(FT-IR)(德國Bruker公司);Gemini SEM 500型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)(德國Carl Zeiss公司);D8 Advance型X射線粉末衍射(XRD)(德國Bruker公司)。

甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純;三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、正硅酸乙酯(TEOS)、二乙烯基苯(DVB)、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、偶氮二異丁腈(AIBN)、甲基丙烯酸3-(三甲氧基硅基)丙酯(MPS)，以及76種農(nóng)藥標準品(10 mg/L)均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。76種農(nóng)藥標準品(10 mg/L)于-20 ℃冰箱內(nèi)避光保存,使用前將混合標準儲備液恢復至室溫,并用甲醇稀釋至所需濃度,于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。中藥材樣品金銀花、菊花、三七塊根(干)來源于杭州當?shù)刂兴幉氖袌?、藥房?/p>

1.2 磁性吸附劑的制備

1.2.1Fe3O4納米顆粒

采用溶劑熱法制備[19],準確稱取1.950 0 g FeCl3·6H2O分散于22.5 mL乙二醇中,攪拌均勻,加入2.600 0 g醋酸鈉,攪拌均勻后通入氮氣30 min,隔絕空氣轉(zhuǎn)移至50 mL反應釜中,于185 ℃條件下反應12 h,靜置冷卻至室溫,使用磁鐵從反應溶液中分離得到黑色沉淀,用水、乙醇交替沖洗至近中性,真空烘箱干燥,得到Fe3O4納米顆粒。

1.2.2Fe3O4@SiO2@MPS

參考文獻[20]方法,稱取1.0 g Fe3O4,置于500 mL三口燒瓶中,加入300.0 mL水,超聲分散均勻,加入100 mL乙醇超聲分散均勻后,加入1.2 mL純氨水溶液,渦旋振蕩均勻。然后通入氮氣,在氮氣保護下依次逐滴滴加2.5 mL TEOS和5.5 mL乙醇至上述溶液中,于60 ℃條件下反應12 h,冷卻至室溫后,利用磁性分離得到黑色沉淀,依次用丙酮和乙醇洗去未反應的TEOS,于50 ℃真空干燥,得到Fe3O4@SiO2納米顆粒。

稱取0.2 g Fe3O4@SiO2,置于500 mL三口燒瓶中,加入30 mL乙醇,超聲分散均勻后,用移液槍逐滴滴加3 mL MPS,于25 ℃攪拌24 h,反應完成后,利用磁性分離得到黑色沉淀,用乙醇洗去未反應的MPS,于50 ℃真空干燥，得到Fe3O4@SiO2@MPS。

1.2.3Fe3O4@PLS磁性材料

稱取3.0 g Fe3O4@SiO2@MPS,置于1 000 mL三口燒瓶中,加入500.0 mL乙腈,超聲10 min,依次加入6.3 mL DVB、7.5 mL NVP和0.180 0 g AIBN,超聲分散均勻,將燒瓶中的溶液轉(zhuǎn)移至蒸餾裝置中,收集乙腈層,于75 ℃預聚合反應20 min,于115 ℃聚合反應1 h。反應完成后靜置冷卻至室溫,加入收集得到的乙腈溶液(約150.0～200.0 mL),超聲分散,然后在外加磁場作用下收集沉淀物,依次用乙腈和乙醇清洗,于50 ℃真空干燥后得到核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@PLS。

1.3 中藥材樣品前處理

研磨分散吸附:取50 g中藥材,充分粉碎,過3號篩(50目)后,放入聚乙烯袋中備用。準確稱取10 mg已粉碎的中藥材樣品,置于研缽中,加入10 mg磁性吸附劑Fe3O4@PLS,研磨分散吸附5 min。

淋洗:將研磨均勻的混合物轉(zhuǎn)移至25 mL燒杯中,加入10 mL 20%(v/v)甲醇水溶液,渦旋振蕩1 min,利用磁鐵磁性分離淋洗液和混合物,收集混合物,棄去淋洗液。

洗脫:在上述收集后的混合物中加入0.5 mL 0.1%(v/v)甲酸乙腈,渦旋振蕩1 min進行洗脫,待洗脫完全后,使用磁鐵磁性分離,收集洗脫液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC-MS/MS定量分析。

1.4 HPLC-MS/MS條件

色譜分離采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×3.0 mm,1.8 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.2 mL/min;流動相:0.05% (v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B)。梯度洗脫程序:0～4 min,90%A～50%A;4～15 min,50%A～40%A;15～18 min,40%A～20%A;18～19 min,20%A～90%A;19～25 min,90%A。進樣量:10 μL。

離子源為電噴霧電離(ESI)源,采用正離子檢測模式;多反應監(jiān)測(MRM)模式進行定量分析。干燥氣溫度為300 ℃,干燥氣流速為5 L/min;霧化氣壓力為0.3 MPa;鞘氣溫度:250 ℃,鞘氣流速:10 L/min;毛細管電壓為4 000 V。76種農(nóng)藥的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 76種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the 76 pesticides

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性萃取材料的表征

Fe3O4@PLS和Fe3O4納米顆粒的粒徑大小和表面形態(tài)如圖1a所示,Fe3O4納米顆粒表面較為光滑,呈規(guī)則的球形,顆粒形狀大小較為均勻,粒徑約為50 nm。通過硅烷化、雙鍵以及有機共聚物修飾后得到的Fe3O4@PLS粒徑約為500～600 nm,呈較規(guī)則的球形,粒徑遠大于Fe3O4納米顆粒,且其表面有大量褶皺,增大了比表面積,提高了對目標物的吸附效率。如圖1b所示,30.12°、35.47°、43.11°、53.49°、57.06°和62.62°的2θ值的特征峰對應于Fe3O4的(222)、(331)、(400)和(422)、(511)和(440),PLS無定形結(jié)構(gòu)的特征尖峰、Fe3O4@PLS的特征峰與Fe3O4特征峰一致。

此外采用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)對Fe3O4@PLS進行表征,如圖1c所示,560 cm-1處為Fe3O4中Fe-O-Fe的伸縮振動特征峰,1 068 cm-1處為Si-O-Si基團的面內(nèi)伸縮振動的特征吸收峰,1 636 cm-1、3 436 cm-1處分別為Si-OH的彎曲振動峰和伸縮振動峰,說明Fe3O4表面形成SiO2涂層,而得到Fe3O4@SiO2,在1 500～1 600 cm-1處為DVB中芳環(huán)的C=C彎曲振動特征吸收峰,1 250～1 300 cm-1和1 400～1 500 cm-1處分別為NVP中C-C伸縮振動特征峰和C-N伸縮振動特征峰[21],綜上所述,表明DVB和NVP單體成功負載于Fe3O4表面。

圖1 Fe3O4@PLS和Fe3O4的表征結(jié)果Fig.1 Characterization results for Fe3O4@PLS and Fe3O4a.SEM micrographs;b.X-rays diffraction patterns;c.Fourier transform-infrared spectra.PLS:macroporous copolymer of divinyl benzene (DVB)and N-vinyl pyrrolidone (NVP).

2.2 MMSPD萃取條件的優(yōu)化

2.2.1磁性萃取劑用量

磁性萃取劑用量是影響萃取效率的重要因素之一。實驗考察了Fe3O4@PLS的用量(5、10、12、15、20 mg)對76種農(nóng)藥萃取回收率的影響。如圖2a所示,Fe3O4@PLS用量為5～10 mg時,多數(shù)目標物的回收率隨著磁性吸附劑用量的增加而增加,當Fe3O4@PLS用量為10 mg時,75種農(nóng)藥萃取回收率≥70%,其中,62種農(nóng)藥的萃取回收率為80%～120%,繼續(xù)增加Fe3O4@PLS用量,回收率<70%的目標物個數(shù)呈增加趨勢。因此選擇Fe3O4@PLS的用量為10 mg。

圖2 不同萃取條件對76種農(nóng)藥回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction parameters on the recoveries of the 76 pesticides a.amount of magnetic material;b.grinding adsorption time;c.volume fraction of methanol in rinsing agent;d.type of eluent solvent;e.volume of eluent solvent;f.elution time. ME:methanol;ME-0.1% FA:methanol containing 0.1% formic acid;ACN:acetonitrile;ACN-0.1% FA:acetonitrile containing 0.1% formic acid.

2.2.2研磨分散吸附時間

磁性吸附劑在樣品中的分散程度是影響MMSPD萃取回收率的關(guān)鍵因素之一,充足的研磨分散時間可以使樣品基質(zhì)中的目標物充分吸附于磁性吸附劑表面,進而提高萃取回收率。實驗對比了不同研磨分散時間(2、3、4、5、6 min)的萃取回收率。如圖2b所示,當研磨時間從2 min增加至5 min時,回收率≥70%的目標物個數(shù)明顯增加,研磨時間為5 min時,76種農(nóng)藥萃取回收率≥70%,繼續(xù)增加研磨分散時間,回收率≥70%和回收率在80%～100%的目標物個數(shù)變化均不顯著。因此最終確定研磨分散時間為5 min。

2.2.3淋洗液中甲醇的體積分數(shù)

磁性萃取劑和樣品混合物研磨分散后使用甲醇水溶液作為淋洗液。甲醇水溶液通常可以作為金銀花、菊花和三七有效成分的提取劑[22-24],適當增加淋洗液中甲醇的體積分數(shù)有利于去除金銀花、菊花和三七中的基質(zhì)干擾,同時淋洗液中甲醇的體積分數(shù)也會影響磁性萃取劑對目標物的萃取效率。實驗對比了甲醇以及體積分數(shù)為5%、10%、20%、25%的甲醇水溶液對76種農(nóng)藥回收率的影響。如圖2c所示,當甲醇體積分數(shù)<20%時,約73～75種目標物萃取回收率大于70%,繼續(xù)增加有機相的體積分數(shù),回收率<70%的目標物個數(shù)明顯增加。因此,為了獲得更好的回收率且能去除更多的雜質(zhì),選擇20%甲醇水溶液作為淋洗液。

2.2.4洗脫劑種類

采用渦旋振蕩對目標物進行洗脫,以甲醇、0.1%甲酸甲醇、乙腈、0.1%甲酸乙腈作為洗脫劑進行考察。以乙腈作為洗脫劑時,3種樣品的洗脫液較為澄清,說明有機雜質(zhì)共萃取物較少。如圖2d所示,使用乙腈、甲醇作為洗脫劑時,萃取回收率為80%～120%的目標物個數(shù)分別為43和40,說明乙腈的萃取回收率相對優(yōu)于甲醇。乙腈中加入0.1%甲酸后,76種農(nóng)藥的萃取回收率均≥70%,其中,64種農(nóng)藥的萃取回收率達到80%～120%。因此最終選擇0.1%甲酸乙腈溶液作為洗脫劑。

2.2.5洗脫劑體積

實驗對比了洗脫劑體積分別為0.5、1、2、2.5和5 mL時76種農(nóng)藥的萃取回收率。如圖2e所示,洗脫劑體積為0.5 mL時,除地蟲硫磷的萃取回收率為68.56%外,其他75種農(nóng)藥的回收率≥70%。因此選擇0.5 mL作為洗脫劑體積。

2.2.6洗脫時間

實驗同時考察了渦旋振蕩洗脫時間為1、2、3、4和5 min時76種農(nóng)藥萃取回收率的變化。如圖2f所示,當渦旋洗脫時間為1 min時,除敵敵畏的回收率為65.12%外,75種目標物的萃取回收率均大于70%,繼續(xù)增加渦旋時間，目標物的萃取回收率未有顯著變化，為了保證檢測效率，選擇渦旋振蕩洗脫時間為1 min。

2.3 方法驗證

2.3.1基質(zhì)效應

基質(zhì)效應是由于樣品中基質(zhì)與待測目標物共存而導致待測目標物在儀器中響應信號有不同程度增強或抑制的現(xiàn)象,從而影響測定的精確度。為了考察基質(zhì)效應,選擇3種空白基質(zhì)萃取液,配制系列空白基質(zhì)匹配標準溶液(0.5、1.0、10、50和100 μg/L),同時用甲醇逐級稀釋配制相同濃度的溶劑混合標準溶液。通過計算基質(zhì)匹配標準曲線與溶劑混合標準曲線斜率的比值來考察基質(zhì)效應。若等于1,表明無基質(zhì)效應;若比值范圍為0.8～1.2,表明無明顯基質(zhì)效應或基質(zhì)效應可以忽略。結(jié)果表明,金銀花、菊花、三七塊根(干)3種中藥材的基質(zhì)效應值分別為0.58～1.30、0.81～1.45和0.73～1.36,均超出上述無明顯基質(zhì)效應范圍,3種中藥材的基質(zhì)效應主要表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應。因此本實驗采用空白基質(zhì)匹配標準補償基質(zhì)效應。

2.3.2線性范圍、檢出限和定量限

用1.3節(jié)方法處理后的空白中藥材萃取液稀釋混合農(nóng)藥標準儲備液，配制成2、10、20、100和200 μg/kg的系列基質(zhì)匹配標準溶液,在優(yōu)化實驗條件下進行測定,得到線性方程和線性相關(guān)系數(shù)(r2),76種農(nóng)藥在10～200 μg/kg范圍內(nèi),呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.996 5。以S/N≥3和S/N≥10分別計算檢出限(LOD)、定量限(LOQ),結(jié)果見表S1所示(詳見http://www.chrom-China.com)。

2.3.3回收率和精密度

采用1.3節(jié)樣品處理方法,對金銀花、菊花、三七塊根(干)3種中藥材進行76種農(nóng)藥3個水平(20、80和150 μg/kg)的加標回收率試驗,每個水平重復3次,采用外標法定量。如表S2所示,3個水平下,金銀花、菊花、三七塊根(干)3種中藥材的萃取回收率分別為69.1%～112.2%、67.1%～102.8%和70.1%～105.1%,RSD分別為2.0%～12.4%、2.1%～13.2%和2.0%～13.5%,滿足藥用植物檢測要求[25],說明所建立方法整體準確度和精密度良好。

2.4 方法比較

本文所建立方法與其他文獻中報道方法比較如表2所示,本文所使用方法具有低消耗(樣品、磁性萃取材料用量)、操作簡便、靈敏度較高等優(yōu)點,適用于非液態(tài)中藥材基質(zhì)中多種類農(nóng)藥殘留的檢測。

表2 本方法與其他方法的比較Table 2 Comparison of the proposed method with some other methods

2.5 實際樣品測定

將建立的MMSPD-HPLC-MS/MS分析方法應用于3種中藥材,包含市售金銀花5個、菊花3個、三七塊根(干)2個共計10個樣品,除1個金銀花檢出多菌靈外,其余樣品均未檢出農(nóng)藥殘留或低于定量限,并且檢出陽性金銀花樣品中多菌靈的殘留量未超出2020年版中《中國藥典》的限度規(guī)定[26]。金銀花陽性樣品的多反應監(jiān)測色譜圖見圖3。

圖3 金銀花陽性樣品的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatogram of the positive honeysuckle sample

同時,采用GB 23200.11-2016和本文所建立方法對金銀花陽性樣品進行定量分析,平行測定5次,以GB 23200.11-2016方法所測得多菌靈的平均含量(11.9 μg/kg)為已知值,本文所建立方法多菌靈的5次檢出含量依次為11.6、12.7、12.9、12.1和13.2 μg/kg,采用t檢驗法比較本方法測定值和已知值,t測定=2.20

3 結(jié)論

本研究針對中藥材農(nóng)藥多殘留檢測中前處理步驟復雜、吸附劑萃取目標物種類少等問題,制備了磁性親水親脂平衡材料Fe3O4@PLS,采用磁性萃取劑與樣品直接研磨分散,無需有機溶劑預提取,同時借助施加外部磁場進行磁性基質(zhì)固相分散萃取,有效簡化了傳統(tǒng)基質(zhì)分散固相萃取的裝柱步驟,結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測,建立了一種有效測定固體或粉末狀中藥材樣品中農(nóng)藥多殘留的方法。本方法在非液體中藥材中痕量農(nóng)藥多殘留的檢測方面具有較高的應用價值,將為中藥材中農(nóng)藥殘留的篩查和質(zhì)量控制的研究提供可靠依據(jù)。