超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法測定防脫發(fā)化妝品中19種非法添加化學(xué)成分

董亞蕾, 牛水蛟, 喬亞森, 黃傳峰*, 王海燕, 孫 磊

(1.中國食品藥品檢定研究院,國家藥品監(jiān)督管理局化妝品研究與評價重點實驗室,北京 100050;2.山東省食品藥品檢驗研究院,山東 濟南 250101)

由于現(xiàn)代生活工作節(jié)奏加快、精神壓力過大等因素,我國的脫發(fā)人群迅速增加。防脫育發(fā)產(chǎn)品的消費需求呈指數(shù)級增長,防脫發(fā)化妝品的市場規(guī)模也不斷擴大。臨床治療脫發(fā)的藥物主要有雄激素抑制劑、生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、皮質(zhì)類固醇等[1]。受盲目追求利潤的驅(qū)動,一些不法生產(chǎn)者將以上化學(xué)藥物添加到防脫發(fā)類化妝品中,使得這一類化妝品面臨濫用藥物的安全威脅。米諾地爾和螺內(nèi)酯是臨床降壓和利尿藥物,具有刺激毛根、促進毛發(fā)生長的副作用,因此常被非法添加至防脫發(fā)產(chǎn)品,但長期使用會導(dǎo)致多毛癥[2]以及心律失常等不良反應(yīng)。氫化可的松、曲安奈德和醋酸曲安奈德等糖皮質(zhì)激素具有顯著的抗炎、免疫抑制功效,對斑禿等快速起效,但濫用糖皮質(zhì)激素會導(dǎo)致產(chǎn)生接觸性皮炎和激素依賴性;孕酮、睪酮等性激素在一定程度上會促進毛發(fā)生長,但會干擾人體正常激素平衡;酮康唑等抗真菌藥物能夠減輕油脂分泌和脫發(fā);非那雄胺是一種5α-還原酶抑制劑,臨床上能夠抑制頭皮毛囊變少,但會導(dǎo)致性欲減退等[3]?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)[4]明確規(guī)定米諾地爾、螺內(nèi)酯、性激素、糖皮質(zhì)激素和抗感染類藥物為化妝品中禁用成分,并規(guī)定了相關(guān)的5個檢測方法。但現(xiàn)有的檢測方法覆蓋不全,相對分散,操作繁瑣。因此,需要建立能夠?qū)崿F(xiàn)防脫發(fā)化妝品中多種類型非法添加化學(xué)成分的高通量篩查方法。

目前,防脫發(fā)化妝品中非法添加的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[5]、液相色譜法[6]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[7,8]等。與傳統(tǒng)檢測方法相比,超高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有更好的選擇性和更高的分辨率,在化妝品中禁限用物質(zhì)的檢測方面具有更顯著的優(yōu)勢。高分辨質(zhì)譜可用于化妝品中9種抗過敏違禁藥物的定量分析[9]和66種抗生素[10]的高通量檢測。超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)能夠?qū)?zhǔn)分子離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)進行分析,不但對前端分離的要求更低,而且結(jié)合數(shù)據(jù)庫技術(shù),能夠達到更高的質(zhì)量精度和更強的檢測通量,兼之強大的譜庫篩查功能,能夠克服傳統(tǒng)檢測方法的不足,是化妝品中功效成分、限用物質(zhì)、非法添加化學(xué)物質(zhì)篩查確證的強有力工具。Xi等[11]通過建立SPE-UPLC-Q-TOF MS法測定育發(fā)化妝品中人參和甘草類的功效成分,證明高分辨質(zhì)譜具有高靈敏度和高確證性的特點。Luo等[12]利用QuEChERS-同位素稀釋-LC-TOF-MS高通量篩查化妝品中86種糖皮質(zhì)激素,通過方法學(xué)數(shù)據(jù)證明了高分辨質(zhì)譜在定性和定量方面的技術(shù)優(yōu)勢。目前,尚未有防脫發(fā)化妝品中多種類型非法添加化學(xué)成分同時測定的高分辨質(zhì)譜法,也缺乏相關(guān)的篩查方法用于防脫發(fā)化妝品的快速篩查。

因此,本研究選擇了在防脫發(fā)化妝品中法規(guī)規(guī)定的性激素、糖皮質(zhì)激素、抗感染類藥物、生物反應(yīng)修飾因子、利尿劑以及尚未有法規(guī)規(guī)定的非那雄胺、依立雄胺、度他雄胺等19種非法添加化學(xué)藥物為研究對象,通過UPLC-高分辨質(zhì)譜獲得化合物的保留時間、一級母離子和二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)及豐度比,構(gòu)建非法添加化學(xué)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫。通過建立篩查方法,將該數(shù)據(jù)庫用于市售防脫發(fā)化妝品的快速篩查,同時利用定量功能,實現(xiàn)定性確證和定量分析的同時進行。該篩查技術(shù)的建立,可為化妝品中非法添加化學(xué)成分的測定提供有效解決方案。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國Waters公司),配有ACQUITY UPLC I Class超高效液相色譜儀,Xevo G2-XS Q-TOF型飛行時間高分辨質(zhì)譜儀,以及UNIFI科學(xué)信息管理系統(tǒng);G10型離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司);Vortex-5渦旋振蕩器(江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司);KQ-700DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AL204型電子天平(美國Sartorius公司)。

1.2 材料與試劑

米諾地爾、螺內(nèi)酯、聯(lián)苯芐唑、克霉唑、益康唑、氟康唑、灰黃霉素、酮康唑、咪康唑、萘替芬、孕酮、睪酮、甲睪酮、氫化可的松、曲安奈德、醋酸曲安奈德、非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺標(biāo)準(zhǔn)品來自中國食品藥品檢定研究院及Dr.E公司;甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨均為質(zhì)譜純(美國Fisher公司產(chǎn)品)。

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,加入甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用,4 ℃避光保存。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別取標(biāo)準(zhǔn)中間液適量,用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;進樣體積:3 μL;流動相A:2 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.05%甲酸),流動相B:乙腈;流速:0.35 mL/min;梯度洗脫程序:0～0.5 min,2%B;0.5～2.0 min,2%B～30%B;2.0～6.0 min,30%B～40%B;6.0～13.0 min,40%B～70%B;13.0～16.0 min,70%B～98%B;16.0～18.0 min,98%B;18.0～18.5 min,98%B～2%B;18.5～20.0 min,2%B。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子化模式:ESI+;采集模式:MSE模式;離子源溫度:120 ℃;毛細(xì)管電壓:1.0 kV;采樣錐電壓:20.00 V;脫溶劑氣溫度:550 ℃;錐孔氣流:50.0 L/h,脫溶劑氣流:1 000.0 L/h;MSE低碰撞能量:4 eV;MSE高碰撞能量:15～50 eV;實時校正液:亮氨酸腦啡肽溶液(200 μg/L),ESI+模式下m/z556.277 1。

1.4 化學(xué)藥物篩查譜庫建立

配制19種化學(xué)藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L),進行UPLC-Q-TOF-MS測定,在正離子模式下,采用MS采集模式掃描分析,通過一級全掃描確定待測物母離子的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間。再采用MSE模式,即低碰撞能量為4 eV,高碰撞能量為15～50 eV時,獲得各化合物的母離子和所有二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)及豐度比等質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將各化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入UNIFI軟件中[13],匯總各化合物的保留時間、一級母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù),結(jié)合各化合物的名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式mol文件等基本信息,在UNIFI軟件中構(gòu)建19種化合物的篩查譜庫。表1中給出了19種化合物的基本信息、母離子信息和豐度最高和次高的兩個碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)。同時在UNIFI軟件中將所建立的19種化合物的譜庫導(dǎo)入,輸入各級標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,設(shè)置匹配參數(shù),建立分析方法。

表1 19種化合物的UPLC-Q-TOF-MS參數(shù)信息Table 1 Information and analytical parameters for the 19 compounds by ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS)

1.5 樣品的篩查確證和定量分析

市售防脫發(fā)化妝品共77批,包含洗發(fā)水、洗發(fā)露、護發(fā)素等的膏霜類產(chǎn)品,以及精華液、育發(fā)液、育發(fā)劑等溶液型產(chǎn)品。分別稱取兩種類型的化妝品樣品0.2 g于10 mL具塞離心管中,加入5 mL甲醇,充分渦旋分散,加入甲醇至近刻度,超聲提取10 min,靜置至室溫,用甲醇定容至刻度,以10 000 r/min離心5 min。移取上清液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾待測。注入UPLC-Q-TOF-MS,在MSE模式下,采集每一份樣品的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)。在UNIFI軟件中導(dǎo)入77批樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù),利用建立的數(shù)據(jù)庫和分析方法對樣品中的19種化合物進行定性篩查和確證。確證后的目標(biāo)物采用母離子通過外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件優(yōu)化

以洗發(fā)水類化妝品基質(zhì)中加標(biāo)的19種化合物為對象,考察了甲醇和乙腈兩種常用有機試劑作為溶劑的提取效果。結(jié)果顯示,在兩種基質(zhì)中,如圖1所示,采用甲醇作為提取溶劑,19種化合物的回收率普遍高于乙腈,且絕大部分化合物的回收率均能達到80%以上。因此,最終采用甲醇作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對19種化合物加標(biāo)回收率的影響Fig.1 Effect of extract solvent on the recoveries of the 19 compoundsThe extracted solution was prepared from 0.2 g of the sample spiked with the mixed standard solution of 19 compounds at 20 μg/L.

隨后,為進一步優(yōu)化提取效率,探討了提取溶劑中甲醇的含量對回收率的影響。配制甲醇體積分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液,分別以其為提取溶劑考察對回收率的影響。結(jié)果(見圖2)表明,對非那雄胺、氟康唑、氫化可的松、甲睪酮、米諾地爾、螺內(nèi)酯、睪酮、曲安奈德和曲安奈德醋酸酯9種化合物,提取溶劑中甲醇的體積分?jǐn)?shù)對回收率的影響不大。對于其他10種化合物,采用純水作為提取溶劑,回收率很低,但是隨著甲醇比例的提高,回收率顯著增大。因此,為兼顧所有化合物的提取效率,采用純甲醇作為提取試劑,使絕大部分化合物的回收率均能達到滿意結(jié)果。該結(jié)論與文獻及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中采用的提取溶劑一致[14]。

圖2 提取溶劑中甲醇的體積分?jǐn)?shù)對19種化合物回收率的影響Fig.2 Effect of methanol volume percentage in extraction solution on the recoveries of the 19 compoundsThe experiment conditions are the same as those shown in Fig.1.

2.2 色譜條件優(yōu)化

根據(jù)19種化合物的結(jié)構(gòu)特點,采用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過實驗比較了ACQUITY UPLC HSS T3柱和ACQUITY UPLC BEH C18兩種常用類型色譜柱的影響。結(jié)果(見圖3)表明,采用HSS T3色譜柱時,保留較弱的米諾地爾和氟康唑兩個化合物的峰形較差,而采用BEH C18柱時,19種化合物能夠獲得更好的峰形。進一步比較了50 mm和100 mm兩種長度的色譜柱的分離效果。結(jié)果表明,采用100 mm的色譜柱時各化合物的分離度更好。

圖3 采用HSS T3色譜柱時部分化合物的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of some components with UPLC HSS T3 column The mass concentration of mixed standard solution is 20 μg/L.

實驗發(fā)現(xiàn),由于該方法中的化合物種類較多,性質(zhì)差異大,流動相添加劑對19種化合物分離的影響顯著。結(jié)果表明,采用乙腈-水流動相體系,向水相中加入2 mmol/L甲酸銨和0.05%甲酸時,能顯著改善米諾地爾和氟康唑兩種化合物的峰形,且19種化合物均能獲得較好的峰形和分離效果。這可能是由于甲酸銨可以改善含堿性基團化合物的峰形,而甲酸提供的H+不但能夠提高化合物的離子化效率,與甲酸銨組成的緩沖體系使各化合物在流動相中的電離狀態(tài)保持一致,有利于獲得穩(wěn)定的保留時間。因此,最終采用含0.05%甲酸的2 mmol/L甲酸銨-水溶液和乙腈分別作為流動相,以使19種化合物均獲得較好的分離效果和靈敏度。實驗結(jié)果表明,該液相色譜方法不但適用于正離子模式的化合物,對負(fù)離子模式的化合物同樣適用。且方法具有可擴展性,能夠根據(jù)需要不斷添加所需要檢測的藥物,擴充所建立的數(shù)據(jù)庫。

進樣溶劑與初始流動相中有機相比例相差較大會引起溶劑效應(yīng),造成峰形變差。通過實驗嘗試調(diào)整進樣溶劑組成以減小溶劑效應(yīng),分別采用甲醇體積分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%和100%的甲醇水溶液對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行等比例稀釋后進樣。結(jié)果表明進樣溶劑中甲醇和水的比例對19種化合物的保留時間和峰面積沒有顯著影響,且米諾地爾和氟康唑的色譜峰峰形得到改善;但當(dāng)進樣溶劑中含有水相時,氫化可的松、酮康唑、克霉唑以及益康唑、依立雄胺等幾種化合物的峰頂均出現(xiàn)明顯的分叉現(xiàn)象,如圖4所示。因此,最終沒有采用水相對進樣溶液進行調(diào)整。采用更小體積的進樣量是能夠降低溶劑效應(yīng)的手段之一。結(jié)果顯示,當(dāng)進樣溶劑為甲醇、進樣體積為3 μL時,各化合物均能獲得相對較好的峰形,因此本方法中進樣體積為3 μL。

圖4 進樣溶劑為60%甲醇-水時部分化合物的提取離子色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatograms of some components with methanol-water (60∶40,v/v)solvent as injection solution The mass concentration of the mixed standard solution is 20 μg/L.The column is UPLC BEH C18.

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

首先,以各個目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度為50 μg/L的單標(biāo)溶液為測定對象,以UPLC-Q-TOF-MS的MSE采集模式進行掃描,通過優(yōu)化錐孔電壓來確定各化合物的母離子,推斷一級母離子的加合形式。其中,克霉唑的母離子為其分子脫去一個咪唑基團形成的正離子峰,一級母離子的理論精確質(zhì)量數(shù)為m/z277.077 7。螺內(nèi)酯比較容易脫去乙?；蚧鵞15],生成m/z為341.211 2的母離子。其他化合物的母離子均為[M+H]+峰的形式。隨后在低碰撞能量為4 eV,高碰撞能量為15～50 eV條件下,進行二級碎片離子的質(zhì)譜掃描,獲得各組分的一級母離子和二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)及豐度比。分別收集19種化合物的保留時間、母離子精確相對分子質(zhì)量、各碎片離子精確相對分子質(zhì)量、豐度比等信息,結(jié)合各化合物名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式等信息,在UNIFI軟件中建立19種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜篩查譜庫。圖5a為最佳實驗條件下19種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖,圖5b為各化合物的提取離子色譜圖。從圖中可以看出,在最優(yōu)實驗條件下,19種化合物均能夠獲得較好的分離度和靈敏度,這有利于獲得各化合物的準(zhǔn)確質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

圖5 19種化合物的(a)總離子流圖和(b)提取離子色譜圖Fig.5 (a)Total ion chromatogram and (b)extract ion chromatogram of the 19 components Experimental conditions:mass concentration of mixed standard solution,20 μg/L;separation column,UPLC BEH C18 (100 mm×2.1 mm,1.7 μm);mobile phase,2 mmol/L ammonium formate solution containing 0.05% formic acid and acetonitrile;flow rate,0.35 mL/min;injection volume,3 μL;column temperature,40 ℃;capillary voltage,1 kV;source temperature,120 ℃;sampling cone,20 V;desolvation temperature,550 ℃;desolvation gas flow,1000 L/h. Peak identification:1.minoxidil;2.fluconazole;3.hydrocortisone;4.triamcinolone acetonide;5.ketoconazole;6.naftifine;7.griseofulvin;8.testosterone;9.clotrimazole;10.finasteride;11.methyltestosterone;12.bifonazole;13.spironolactone;14.triamcinolone acetonide acetate;15.econazole;16.miconazole,17.progesterone;18.epristeride;19.dutasteride.

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1基質(zhì)效應(yīng)考察

由于化妝品基質(zhì)復(fù)雜,與目標(biāo)化合物共流出組分可能會影響電噴霧效率,對目標(biāo)化合物的信號產(chǎn)生干擾,因此,基質(zhì)效應(yīng)在化妝品質(zhì)譜分析中普遍存在。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線,以兩者斜率之比考察了方法的基質(zhì)效應(yīng)。即ME=100%×基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。ME=100%,說明不存在基質(zhì)效應(yīng),ME<100%,表示基質(zhì)對分析物存在抑制作用。如圖6所示,19種化合物在洗發(fā)水等膏霜類基質(zhì)和育發(fā)液等溶液型基質(zhì)中的ME位于50%附近且上下波動,說明兩種基質(zhì)中均存在不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)。為克服基質(zhì)效應(yīng),常用的方法有采用同位素內(nèi)標(biāo)、改進色譜分離、采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]進行校正等。本實驗中分別選用膏霜狀的洗發(fā)水和溶液狀的育發(fā)劑作為代表性基質(zhì),采用基質(zhì)加標(biāo)法定量,以消除基質(zhì)效應(yīng)。

圖6 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果Fig.6 Investigation results of matrix effect

2.4.2線性關(guān)系、檢出限、定量限與精密度

分別采用膏霜狀的防脫發(fā)洗發(fā)水和溶液狀的育發(fā)劑樣品為空白基質(zhì),配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明,聯(lián)苯芐唑的線性范圍為5～50 μg/L,克霉唑、益康唑、度他雄胺、依立雄胺、非那雄胺、氫化可的松、甲睪酮7種化合物的線性范圍為2～50 μg/L,其他11種化合物的線性范圍為2～100 μg/L,19種化合物在兩種基質(zhì)中的線性范圍相一致,且相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.995(見表2)。依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)理化檢驗方法總則[4]要求,將一定量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白基質(zhì)樣品中,根據(jù)樣品檢驗操作方法進行處理,以信噪比分別為3、10時樣品的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),其中聯(lián)苯芐唑的檢出限和定量限分別為1.0 μg/L和3.0 μg/L,氟康唑、米諾地爾和螺內(nèi)酯的檢出限和定量限分別為0.7 μg/L和2.0 μg/L,其他15種化合物的檢出限和定量限分別為0.5 μg/L和1.5 μg/L。當(dāng)方法取樣量為0.2 g時,19種化合物的LOD和LOQ分別列于表2中。從表中數(shù)據(jù)可知,各化合物的檢出限較低,能夠用于膏霜和乳液類化妝品中19種化合物的靈敏測定。該方法中各化合物的檢出限與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)中相應(yīng)的檢出限相當(dāng)甚至更低。因此,本方法具有更高的靈敏度。

采用空白樣品進行基質(zhì)加標(biāo)(質(zhì)量濃度為20 μg/L),在相同條件下平行處理6份進行測定,根據(jù)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)計算方法的精密度(見表2)。表中結(jié)果顯示,該方法的精密度小于8.2%,說明方法的精密度良好。

表2 兩種基質(zhì)中19種化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和精密度Table 2 Linear ranges,correlation coefficients (R2),LODs,LOQs,and precisions of the 19 compounds in two matrices

表3 (續(xù))Table 3 (Continued)

2.4.3回收率

為驗證方法準(zhǔn)確度,在膏霜和溶液兩種空白樣品中進行19種化合物的加標(biāo)回收率實驗,每個濃度水平平行6份,計算平均回收率和RSD。從表3中可知,19種化合物在溶液型育發(fā)劑基質(zhì)中的回收率為71.9%～118.8%,RSD為0.3%～9.3%,在膏霜類洗發(fā)水基質(zhì)中的回收率為68.6%～117.4%,RSD為0.3%～10.3%。證明該方法靈敏、準(zhǔn)確、有效,能夠用于常見防脫發(fā)化妝品中19種非法添加化學(xué)組分的準(zhǔn)確測定。

2.5 實際樣品的分析

在流通環(huán)節(jié)采購防脫發(fā)化妝品共77批,其中包括35批精華液、育發(fā)液、育發(fā)劑等溶液型化妝品,以及42批洗發(fā)水、洗發(fā)露、護發(fā)素等膏霜類化妝品。經(jīng)UPLC-Q-TOF-HRMS在MSE采集模式下進行全掃描,用UNIFI軟件對樣品中的母離子、碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)及保留時間與譜庫進行匹配。歐盟2002/657/EC準(zhǔn)則要求禁用物質(zhì)的確證必須達到4個識別點;在高分辨質(zhì)譜中,每個母離子的識別點規(guī)定為2.0,子離子的識別點為2.5[17]。因此,利用四極桿-飛行時間高分辨質(zhì)譜,只需一個母離子和一個子離子即可完成對目標(biāo)物質(zhì)的確證。設(shè)置保留時間偏差為±0.2 min,母離子精確質(zhì)量數(shù)偏差為5×10-6(5 ppm)以內(nèi)以及其他必要匹配參數(shù)后,如圖7所示,其中一款育發(fā)劑產(chǎn)品的提取離子色譜圖中分子離子峰的保留時間為2.63 min,低能量通道中存在m/z210.135 8,對應(yīng)米諾地爾的[M+H]+峰,且與譜庫中的信息一致,同時,該產(chǎn)品在保留時間為7.22 min處的低能量通道中存在m/z373.285 2,對應(yīng)非那雄胺的[M+H]+峰。初步判斷其為陽性樣品。

圖7 陽性樣品中米諾地爾和非那雄胺的提取離子色譜圖和低能量質(zhì)譜圖Fig.7 Extracted ion chromatograms and mass spectra in low-energy scan for minoxidil and finasteride in positive sample

將該款育發(fā)劑產(chǎn)品中檢出的母離子和碎片離子與譜庫中米諾地爾和非那雄胺標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果進行比對,結(jié)果分別列于圖8中。

圖8 米諾地爾和非那雄胺的標(biāo)準(zhǔn)品及陽性樣品的二級質(zhì)譜圖Fig.8 MS/MS spectra for minoxidil and finasteride from their standard and positive sample

通過與米諾地爾標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖進行對比,高能量通道中既存在米諾地爾的分子離子峰,又存在碎片離子m/z164.093 3和m/z193.132 7,能夠確證該產(chǎn)品中含有米諾地爾。通過與非那雄胺的二級質(zhì)譜圖對比,高能量通道檢出碎片離子m/z305.260 5和m/z317.223 5,質(zhì)量數(shù)偏差小于5×10-6。通過保留時間和母離子、碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)能夠確證該樣品中同時含有米諾地爾和非那雄胺。同樣的方法能夠確證另一款育發(fā)劑產(chǎn)品中也同時含有米諾地爾和非那雄胺兩種非法添加化學(xué)成分。

以米諾地爾為例,推測其裂解途徑如圖9所示。米諾地爾的分子式為C9H15N5O,在正離子模式下獲得質(zhì)子,形成準(zhǔn)分子離子,精確質(zhì)量數(shù)為210.135 8。經(jīng)碰撞誘導(dǎo),發(fā)生兩種途徑的裂解。一種途徑是脫去一個氨基和哌啶環(huán),形成C4H4N3O特征碎片離子(精確質(zhì)量數(shù)為110.035 4)。另一種途徑是準(zhǔn)分子離子脫去一個羥基,且哌啶環(huán)開環(huán),形成C9H15N5(精確質(zhì)量數(shù)為193.132 7)的碎片離子,該碎片逐步脫去兩個亞甲基,形成C7H10N5(精確質(zhì)量數(shù)為164.093 3)的碎片離子。該碎片離子進一步裂解,形成其他碎片離子,但相對豐度較小。因此,米諾地爾的二級碎片中相對豐度較高的碎片分別為m/z164.093 3(100%)、m/z193.132 7(84.7%)、m/z110.035 4(21.8%)。米諾地爾質(zhì)譜裂解途徑的解析,能夠為其他類型化妝品樣品中非法添加米諾地爾的快速分析和鑒定提供參考依據(jù)。

圖9 ESI模式下米諾地爾裂解途徑推測Fig.9 Proposed ESI fragmentation pathways of product ions from minoxidil

結(jié)合該方法的定量功能,對兩批陽性樣品中檢出的米諾地爾和非那雄胺進行定量分析。兩款產(chǎn)品中米諾地爾和非那雄胺的含量均很高,因此,對育發(fā)劑產(chǎn)品分別稀釋250 000倍和5 000倍后進行測定。結(jié)果表明,兩款育發(fā)劑產(chǎn)品中米諾地爾的含量分別高達60 mg/g和18 mg/g,非那雄胺的含量也分別為0.31 mg/g和0.19 mg/g。

以上定性和定量結(jié)果說明,防脫發(fā)化妝品中不但存在多種化學(xué)藥物同時添加的情況,且添加的藥物含量非常高。作為溶液型的育發(fā)劑,兩款產(chǎn)品均注明需要在洗發(fā)后涂抹至頭皮處至完全吸收,如此大劑量的化學(xué)藥物在不知情的情況下被大量使用,可能會給使用者造成嚴(yán)重的副作用,嚴(yán)重危害消費者的身體健康[18]。

3 結(jié)論

建立了同時測定防脫發(fā)化妝品中19種非法添加化學(xué)組分的UPLC-Q-TOF-MS法,結(jié)合各化合物的質(zhì)譜信息,構(gòu)建了防脫發(fā)化妝品中非法添加化學(xué)組分的篩查數(shù)據(jù)庫。該方法可用于防脫發(fā)化妝品中非法添加化學(xué)組分的篩查確證和定量分析,并最終在兩批育發(fā)劑產(chǎn)品中檢出了法規(guī)明確規(guī)定禁用的米諾地爾和法規(guī)外的化學(xué)藥物非那雄胺。該方法前處理方式簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好,分析流程高效,篩查結(jié)果準(zhǔn)確,能夠有效覆蓋現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法,大大提高了防脫發(fā)化妝品中非法添加的檢測效率?？蔀榛瘖y品安全監(jiān)管提供高效解決方案,能夠在各類非法添加突發(fā)事件和稽查應(yīng)急檢驗中發(fā)揮優(yōu)勢作用。