結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥分子藥敏結(jié)果與其表型藥敏差異的研究

羅嘉韻，余明均，廖衛(wèi)平

1.佛山市第四人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 佛山 528000；2.佛山市第四人民醫(yī)院.檢驗(yàn)科，廣東 佛山 528000

結(jié)核病是全球公共衛(wèi)生組織重點(diǎn)關(guān)注的慢性傳染性疾病，主要是由結(jié)核分枝桿菌感染所引起。全球感染結(jié)核分枝桿菌人數(shù)已達(dá)到十幾億，每年新發(fā)病例達(dá)千萬，死亡病例達(dá)到百萬，尤其是耐藥菌株的流行，造成疫情日益嚴(yán)重[1-2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)耐多藥/耐利福平初治耐藥率約為6.6%，復(fù)治耐藥率為30%[3]。利福平是一種廣譜抗生素，由利福霉素類半合成，屬一線抗結(jié)核藥物。但利福平耐藥是影響抗結(jié)核效果的主要因素，通常有80%以上對(duì)利福平耐藥性菌株也對(duì)異煙肼產(chǎn)生一定的耐藥性，并逐漸成為結(jié)核病耐藥性的標(biāo)志物[4-5]。因此掌握利福平耐藥機(jī)制，有助于結(jié)核病的早期診斷、準(zhǔn)確控制。既往臨床藥敏試驗(yàn)測(cè)定常用羅氏試驗(yàn)，但耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，菌株分離培養(yǎng)需要3～8周，隨后再耗費(fèi)4 周時(shí)間才能得到藥敏結(jié)果，難以在短時(shí)間內(nèi)取得理想、可靠、準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果。隨著檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，分子檢測(cè)技術(shù)逐漸被用于菌株檢測(cè)，并取得顯著效果。但在臨床實(shí)際工作中，分子技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)存在診斷結(jié)果差異性，給臨床治療帶來困難。本研究就結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥的分子藥敏與其表型藥敏檢測(cè)的差異性進(jìn)行分析，以期為臨床治療提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2018年1月至2020年12月在佛山市第四人民醫(yī)院進(jìn)行Xpert MTB/RIF 檢測(cè)的4620例患者中篩選出480株結(jié)核分枝桿菌。標(biāo)本每人1 份，H37Rv 標(biāo)準(zhǔn)菌株來自中國(guó)藥品生物制品鑒定所。培養(yǎng)菌株標(biāo)本收集患者痰液、肺泡灌洗液進(jìn)行分離獲得，按照實(shí)驗(yàn)規(guī)程操作。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者年齡≥18 歲；②符合結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；③同意納入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者年齡＜18歲；②合并肝腎功能衰竭、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試制 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)儀(Xpert MTB/RIF，美國(guó)Cepheid)，液體培養(yǎng)儀器與配套試劑(Bactec MGIT960，美國(guó)BD)，利福平耐藥試劑盒及干粉(美國(guó)Sigma公司)。

1.3 檢測(cè)方法 所獲得的菌株置入100 L菌液內(nèi)，分別接種在羅氏培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)4周。4周后，用接種環(huán)刮取培養(yǎng)基上的一層菌落，加入已添加生理鹽水的離心管內(nèi)，85℃下滅活20 min。滅活后的菌液離心5 min后丟棄上清液，用生理鹽水清洗，再100℃下金屬浴10 min，超聲15 min，離心后，留取上清液，設(shè)置DNA模板。設(shè)計(jì)rpoB基因引物序列，測(cè)定其基因型。利用Xpert MTB/RIF、Bactec MGIT960測(cè)定對(duì)利福平的耐藥性，獲取耐藥表型數(shù)據(jù)。Xpert MTB/RIF：留取標(biāo)本置入前處理管內(nèi)，添加標(biāo)本體積的SR處理液2 mL，渦旋振蕩，30 s，靜置60 min，取處理藥品2 mL，緩慢添加至反應(yīng)盒內(nèi)，放置檢測(cè)模塊，再自動(dòng)化檢測(cè)，讀取檢測(cè)結(jié)果。Bactec MGIT960：取0.5 mL處理后標(biāo)本，添加培養(yǎng)管，培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本行藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)是根據(jù)分離出的結(jié)核分枝桿菌，觀察其生長(zhǎng)情況，并與未藥物的對(duì)照管做對(duì)比，若菌株在對(duì)照、藥物培養(yǎng)管內(nèi)均存在生長(zhǎng)，則有耐藥，若僅在對(duì)照管內(nèi)生長(zhǎng)，則有敏感性。采用仞天青顯色法檢測(cè)最低抑菌濃度(MIC)。

1.4 觀察指標(biāo) (1)以羅氏培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，比較 Xpert MTB/RIF、Bactec MGIT960 的檢測(cè)效能；(2)觀察基因型與表型特征耐利福平不一致的檢測(cè)結(jié)果；(3)比較表型、基因型利福平耐藥率；(4)分析不同基因突變型菌株的MIC表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，一致性采用Kappa一致性檢驗(yàn)。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)效能 480 株分離的結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥菌株52 株(10.83%)/敏感菌株428 株(89.17%)，Xpert MTB/RIF 檢出耐藥菌株 92.31%(48/52)，敏感度為95.83%，特異度為98.61%；Bactec MGIT960 檢出耐藥菌株96.15%(50/52)，敏感度為98.00%，特異度為99.30%，兩者檢出的靈敏度、特異度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1和表2。

表1 Xpert MTB/RIF檢出效能比較(例)

表2 Bactec MGIT960檢出效能比較(例)

2.2 檢測(cè)藥敏不一致結(jié)果 52 株耐利福平菌株，RRDR區(qū)rpoB 基因突變46 株，6 株無氨基酸突變，Xpert MTB/RIF檢測(cè)耐藥而Bactec MGIT960檢測(cè)敏感有35 株，2 株無氨基酸突變；Xpert MTB/RIF檢測(cè)利福平敏感而Bactec MGIT960 檢測(cè)耐藥的變異菌株8 株，4株無氨基酸突變，一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.795，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 突變位點(diǎn) RRDR 區(qū) rpoB 基因突變 46 株(88.46%)，缺失突變位點(diǎn)分別有 508、509、526、511、533、531、516，其中 508、509 位點(diǎn)突變?nèi)笔Р糠謱貵CA-CA，除去缺失突變，其他突變改變情況，見表3。

表3 46株RRDR區(qū)rpoB基因突變分析

2.4 不同突變型利福平MIC 水平測(cè)定 敏感：His526Asn、His526Gly、Asp516Tyr 突變類型菌株的MIC 水平均低于0.25μg/mL；高水平耐藥：His526Leu突變MIC水平為32μg/mL，低水平耐藥MIC值為0.5～4.0μg/mL；His526Arg突變菌株：低水平耐藥MIC值為1 μg/mL。Leu511Pro 突變：低水平耐藥：MIC 水平為1～2 μg/mL；Leu 533Pro 突變：敏感：MIC 水平 0.25～0.5 μg/mL；508、509 位缺失突變：低水平耐藥：MIC 水平2～4μg/mL，見表4。

表4 不同突變類型菌株MIC水平測(cè)定

3 討論

近年來，結(jié)核病耐藥性逐漸增加，主要是因化療方案應(yīng)用不合理、依從性差等原因?qū)е?。尤其是耐多藥結(jié)核病病例的廣泛增多，使結(jié)核病的疫情傳播、診治方案更加嚴(yán)峻，大大地增加了結(jié)核病防治難度。通常耐藥結(jié)核病是對(duì)利福平或異煙肼等藥物耐藥，而耐多藥在體外證實(shí)對(duì)利福平、異煙肼等藥物存在耐藥性[7]。其中利福平是治療結(jié)核病的一線藥物，由鏈霉素產(chǎn)生的廣譜抗生素，是耐藥結(jié)核病的主要標(biāo)志性藥物。掌握患者耐利福平機(jī)制，有助于早期診斷及控制結(jié)核病的發(fā)生、進(jìn)展，并未臨床治療方案的選擇提供參考。結(jié)核分枝桿菌主要的耐藥機(jī)制較多，譬如靶基因結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞壁的通透性異常改變、失活酶、代謝過程改變等，其中利福平耐藥產(chǎn)生的主要機(jī)制是藥物作用靶基因異常突變所致[8]。通常結(jié)核分枝桿菌的RNA聚合酶參與到細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、RNA 延伸途徑，是菌株存活、生長(zhǎng)的必需產(chǎn)物[9]。利福平的藥理作用機(jī)制是經(jīng)過非共價(jià)鍵，特異性結(jié)合作用于RNA 聚合酶亞基介質(zhì)，該介質(zhì)是菌株DNA 生成的重要因子，通過下調(diào)RNA 聚合酶活性，阻斷細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、RNA 延伸途徑，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成過程，發(fā)揮顯著的抗菌效果[10]。由于RNA聚合酶由5個(gè)亞基單位組成，其基因編碼有rpoA、rpoB、rpoC、rpoZ，在基因編碼異常、基因突變?cè)斐蒖NA聚合酶亞基結(jié)構(gòu)異常改變，以此產(chǎn)生利福平耐藥性[11]。因此在檢測(cè)利福平耐藥時(shí)，可根據(jù)基因分子靶標(biāo)作為利福平耐藥測(cè)定的主要方法。

Xpert MTB/RIF 是檢測(cè)利福平耐藥的主要方法，操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確，受到臨床重點(diǎn)關(guān)注。隨著耐藥分子機(jī)制的深入，利福平耐藥分子技術(shù)得到極大進(jìn)展，其中Bactec MGIT960進(jìn)行分子表型測(cè)定，也在極大程度上提高利福平耐藥性診治水平[12]。本研究中Xpert MTB/RIF檢出耐藥菌株92.31%，Bactec MGIT960則為96.15%，兩者靈敏度、特異度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Xpert MTB/RIF、Bactec MGIT960檢測(cè)一致性檢驗(yàn)的Kappa 值為0.795。據(jù)劉立賓等[13]報(bào)道，將Bactec MGIT960 的藥敏檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF 檢出敏感率為96.21%，且藥敏結(jié)果的一致性為0.794。因此兩種方法對(duì)檢測(cè)利福平耐藥有積極意義。兩者間的檢測(cè)結(jié)果存在不一致性可能是因其他原因造成利福平耐藥，不單單是因基因突變導(dǎo)致藥物耐藥產(chǎn)生。此外，BACTEC MGIT960同Xpert MTB/RIF相比較，其仍然存在耗時(shí)較長(zhǎng)的不足，難以充分滿足臨床診斷的需要。有研究指出，結(jié)核分枝桿菌耐藥產(chǎn)生主要是因rpoB 基因突變導(dǎo)致，基因突變?cè)斐删幋aRNA 聚合酶異常突變，引起氨基酸置換、空間構(gòu)象改變，以此產(chǎn)生利福平耐藥[14]。本研究中52 株耐利福平菌株，RRDR區(qū)rpoB基因突變46株，6株無氨基酸突變，rpoB基因突變、缺失突變位點(diǎn)分別有508、509、526、511、533、531、516。通常531、526、516是常見的基因突變位點(diǎn)，以堿基置換為主要突變類型，而插入、缺失較少。在菌株耐藥性測(cè)定時(shí)，rpoB 基因不同位點(diǎn)突變所產(chǎn)生的利福平耐藥值也不同，本研究對(duì)不同突變型利福平MIC 水平進(jìn)行了測(cè)定，其中His526Asn、His526Gly、Asp516Tyr突變類型菌株的MIC水平均低于0.25 μg/mL，為藥物敏感。其中rpoB 基因508、509位缺失是造成利福平低耐藥的主要原因，而基因His526Asn、His526Gly、Asp516Tyr 突變是唯一致利福平敏感的主要基因編碼，但也會(huì)產(chǎn)生利福平高耐藥。可能是患者感染混合菌株，造成不同基因突變使利福平耐藥也存在差異[15]。因此，由于XpertMTB/RIF 所采用精密設(shè)計(jì)的分子探針可以高效檢測(cè)到rpoB 核心區(qū)基因突變情況，對(duì)鑒定RFP 耐藥菌株具有較大幫助。

綜上所述，不同分子檢測(cè)方法對(duì)利福平耐藥測(cè)定有一定意義，但分子藥敏與表型藥敏檢測(cè)也有一定的差異性，臨床上可根據(jù)具體情況將兩者作為利福平耐藥檢測(cè)的有效選擇，以指導(dǎo)抗結(jié)核藥物的選擇。在結(jié)核分枝桿菌經(jīng)利福平耐藥性測(cè)定，利福平耐藥性較高，rpoB基因突變是其主要改變?cè)?，不同基因突變類型，使利福平耐藥水平也存在差異，但其結(jié)果依然無法肯定藥敏方法的可靠性，需臨床進(jìn)一步研究探討。