EMT在結(jié)腸癌干細(xì)胞“干性”獲得與維持中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

康毅，周晏因 綜述 朱蓉 審校

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563000

結(jié)腸癌是全世界第三大常見的癌癥，由于近年來早期診斷與治療手段的進(jìn)步，雖然結(jié)腸癌死亡率逐漸降低，但其五年生存率也僅為65%[1]。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移不可缺少的條件包括結(jié)腸癌干細(xì)胞(colon cancer stem cells，CCSCs)的維持、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)、結(jié)腸癌細(xì)胞的血管生成等。其中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化不僅可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移和耐藥，還給予結(jié)腸癌干細(xì)胞一定特性、促進(jìn)結(jié)腸癌干細(xì)胞的出現(xiàn)，CCSCs也可通過相關(guān)通路完成向EMT的轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步探討CCSCs與EMT的相互關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制，有助于理解CCSCs 可塑性，進(jìn)而促進(jìn)二者的理論融合以及為結(jié)腸癌的診斷、治療提供新的方向。

1 CCSCs

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)是指具有自我更新能力并且可以通過自我更新和無限增殖維持腫瘤細(xì)胞群的生命力的細(xì)胞[2]；CSCs 理論認(rèn)為CSCs是腫瘤的種子和源泉，是腫瘤存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的“起點(diǎn)細(xì)胞”或“動力細(xì)胞”，在整個腫瘤的產(chǎn)生與生長過程中起著不可替代的作用。CCSCs 是結(jié)腸惡性腫瘤中一小部分擁有自我更新與無限增殖能力，而且可以形成異質(zhì)性結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞亞群，并受基因組、表觀遺傳因素和腫瘤微環(huán)境等影響[3]，雖然其在腫瘤總體細(xì)胞中的占比很小(0.1%～0.25%)，卻與結(jié)腸癌的產(chǎn)生、增殖、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有著相當(dāng)密切的聯(lián)系。早期結(jié)腸癌組織內(nèi)干細(xì)胞特性的激活能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲[4]，在SCHWITALLA等[5]的研究中證實(shí)，核因子(NF)-κB能夠通過活化的Wnt 信號通路，在炎性腫瘤微環(huán)境中可以誘導(dǎo)非干細(xì)胞去分化，使組織獲得致瘤性，并且腸上皮細(xì)胞NF-κB 的功能亞基RelA/p65 的敲除可以阻止腸腺窩干細(xì)胞的擴(kuò)增，這表明炎癥信號對CCSCs 的產(chǎn)生及去分化產(chǎn)生重要影響。此外，來自YANG 等[6]研究表明，在正常和輻射環(huán)境下，CCSCs和非CCSCs之間具有一定的轉(zhuǎn)換和動態(tài)平衡能力，在此過程中，TGF-β 或許通過激活EMT從而在平衡中起重要作用。

2 EMT

在人體的組織中有各種細(xì)胞，而間充質(zhì)細(xì)胞和上皮質(zhì)細(xì)胞是不可或缺的兩種，它們在細(xì)胞表型和細(xì)胞功能上具有明顯差異。上皮細(xì)胞顯示出顯著的極性，它們面向體表或有腔器官的腔面的一面稱為游離面，面向深層結(jié)締組織的一面稱為基底面，兩者在結(jié)構(gòu)和功能上存在明顯的不同，上皮細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上有清晰的邊界，分層排列，細(xì)胞間存在著中間連接、閉鎖連接、通訊連接和橋粒等，從而細(xì)胞彼此之間連接十分緊密，使得單個上皮細(xì)胞缺乏活動性，它的移動由整層細(xì)胞形狀變化所引起。然而，間質(zhì)細(xì)胞沒有顯著的極性，細(xì)胞間的黏附作用相比上皮細(xì)胞較弱，缺乏局部特異性和可塑性，它可以通過在細(xì)胞外基質(zhì)的游走，據(jù)此實(shí)現(xiàn)單個細(xì)胞的移動[7]。EMT是指通過一定程序?qū)⑸掀ぜ?xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程[8]，具體而言，是指除去部分上皮細(xì)胞已分化的表型，從而獲得了部分間充質(zhì)細(xì)胞的表型[9]。因而EMT 及其逆轉(zhuǎn)過程MET在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移等過程扮演著十分重要的角色[10]。EMT的發(fā)生受轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)、Wnt/β-catein、Notch、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)等信號通路調(diào)控，其中關(guān)鍵環(huán)節(jié)是這些轉(zhuǎn)錄因子或信號通路抑制上皮組織中的細(xì)胞黏附分子鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白(ZO-1)、細(xì)胞角蛋白(CK)等的表達(dá)，誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(FSP1)和骨橋蛋白(Osteopontin)等表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附力減弱，并且結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力提高。

3 EMT是CCSCs形成的關(guān)鍵

2007 年，O'BRIEN等[11]分離出CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞，其后發(fā)現(xiàn)的主要結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物包括CD133、Lgr5、CD44、CD166、EpCAM、ALDH1、CD24、CD26、ITGB1、Oct4、Sox2、Nanog 等，這些CCSCs標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，不僅利于結(jié)腸癌的診療，而且還有助于探索新的結(jié)腸癌靶向治療方法。發(fā)生EMT時，上皮細(xì)胞在某些特定的情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，此轉(zhuǎn)化過程會導(dǎo)致上皮細(xì)胞的極性的喪失，此時細(xì)胞間的緊密連接和中間連接等重要連接丟失，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的接觸減少，而細(xì)胞遷移、侵襲、增殖等能力得以增強(qiáng)[12]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT 伴隨著上皮表型分子(E-cadherin、α-catenin、β-catenin、細(xì)胞角蛋白、黏蛋白、橋粒蛋白)的下調(diào)和間充質(zhì)表型分子(Vimentin、纖連蛋白、神經(jīng)型鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP-2、MMP-3、MMP-9)的上調(diào)，它增強(qiáng)了細(xì)胞遷移和侵襲的能力，并且在腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥性中也扮演者重要的角色。新近研究表明，EMT和CCSCs之間或許存在著密切的關(guān)系，EMT可以刺激腫瘤干性的產(chǎn)生。

EMT 誘導(dǎo)的CCSCs 和致瘤性的機(jī)制，包括相關(guān)基因和各種通路被證實(shí)參與其中。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EMT 的腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞樣的特征[13]，目前參與CCSCs 生長的信號通路主要有 Wnt、Notch 和 mTOR等信號通路。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(TGM2)在CCSCs中的有一定作用，TGM2 在致瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平比非致瘤細(xì)胞高25 倍，通過特異性RNA 干擾敲除TGM2 可以顯著抑制細(xì)胞生長并引起干性標(biāo)記CD133、SOX2和β-catenin 的下調(diào)，敲低TGM2 可以通過下調(diào)N-cadherin和Vimentin以及上調(diào)E-cadherin來抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。人結(jié)腸直腸癌中TGM2表達(dá)顯著增加，而下調(diào)TGM2 可作為結(jié)直腸癌患者的治療方法。這表明TGM2 通過調(diào)節(jié)EMT 和干性相關(guān)蛋白影響CCSCs 的轉(zhuǎn)移潛力和干性，CSCs 的轉(zhuǎn)移潛力來自高表達(dá)的TGM2[14]。R-spondin(RSPO)家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的由4種分泌型蛋白組成的蛋白家族，其中RSPO2 是經(jīng)典Wnt/β-catenin 途徑的激動劑，是腸道干細(xì)胞(ISCs)的生長因子，被認(rèn)為在CCSCs中起著重要的作用。但是，尚不清楚RSPO2在CCSCs 中的具體功能，有研究表明，RSPO2可通過增強(qiáng)EMT 促進(jìn)HCT116 球狀細(xì)胞的侵襲，RSPO2是CCSCs 的潛在生長因子，通過無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基(SFM)培養(yǎng)有助于豐富CCSCs，并且在結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用[15]。此外，有研究表明，PRDX2可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程，并可促進(jìn)MET發(fā)生，使結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移得到抑制[16]。

腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)一直是腫瘤治療所面臨的一項(xiàng)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，有證據(jù)顯示，CSCs 和EMT 是腫瘤形成、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Bmi-1 被小干擾 RNA(siRNA)沉默時，CD133+/CD44+HCT116 細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著降低，RT-qPCR 和蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果表明Bmi-1 對E-cadherin 的表達(dá)有負(fù)面影響，Bmi-1 或許經(jīng)過誘導(dǎo) EMT 下調(diào) E-cadherin 促進(jìn)CCSCs 的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]，使得Bmi-1 有望成為結(jié)腸癌治療的新型治療靶標(biāo)[18]。盡管較早的研究表明CCSCs與EMT 在腫瘤發(fā)展中有一定聯(lián)系，但關(guān)于CCSCs 與EMT之間的關(guān)系仍存在爭議。研究發(fā)現(xiàn)，球形細(xì)胞顯示出較低的同型/異型黏附力，但具有更高的體外遷移/侵襲能力，以及更高的體內(nèi)致瘤和轉(zhuǎn)移潛能。球狀細(xì)胞還顯示出 E-cadherin 下調(diào)，α-SMA 和 Vimentin 表達(dá)上調(diào)，這也證明了EMT的發(fā)生。它表明球狀細(xì)胞具有CCSCs的特征，EMT則可能解釋了它們的干性和惡性，而Wnt/β-catenin途徑的持續(xù)激活可能在CCSCs的EMT中起重要作用[19]。

藥物作用及腫瘤微環(huán)境因素也是EMT向CCSCs發(fā)生發(fā)展的重要因素。非甾體類抗炎藥阿司匹林通過上調(diào)E-cadherin 表達(dá)，下調(diào)N-cadherin、Vimentin、Snail1表達(dá)從而抑制HT-29細(xì)胞EMT；非甾體抗炎藥可通過EMT減弱人結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[20]。腫瘤微環(huán)境包括炎癥、酸性、低氧等，它們與結(jié)腸癌細(xì)胞的發(fā)生、生長等關(guān)系密切[21]。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中，肝細(xì)胞生長因子(HGF)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的EMT，此過程還伴隨著腫瘤細(xì)胞中Wnt信號通路的激活[22]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以在化療中分泌多種生長因子，如IGF-1、VEGF 和 HGF 等；還有趨化因子SDF-1/CXCR4 以及炎癥細(xì)胞因子IL-6 和TNF-α等，這些生長因子通過STAT3、PI3K/AKT和Wnt等信號通路的作用，使得腫瘤細(xì)胞避免被化療藥物所損傷，并觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的EMT 與干細(xì)胞特征[23]。

4 CCSCs對EMT的影響

微小RNA(miRNA)于1993年首次發(fā)現(xiàn)，是一大家族的小分子非編碼18-25 nt 單鏈寡核糖核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后起作用，負(fù)調(diào)控信使RNA(mRNA)的翻譯。近期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Ascl2 通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)miRNA-200家族，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌HT-29 和LS174T 細(xì)胞株的EMT，從而影響結(jié)腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移[24]。微小RNA是腫瘤發(fā)生EMT與轉(zhuǎn)移的調(diào)控因子，并且miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141與miR-429)和miR-205家族可以激活EMT過程，其作用機(jī)制與上皮細(xì)胞的E-cadherin 的表達(dá)降低有關(guān)[25]。MSCs 在體外可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的轉(zhuǎn)移，這一作用可能與SW480 細(xì)胞的EMT 受到抑制有關(guān)，而其作用機(jī)制可能與Wnt/β-catentin信號通路有關(guān)。

在結(jié)腸癌中，化療和/或放療會導(dǎo)致耐藥細(xì)胞的形成，這些耐藥細(xì)胞會通過EMT轉(zhuǎn)移，EMT介導(dǎo)原發(fā)腫瘤中癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移特性，使其失去細(xì)胞黏附能力，從而增加細(xì)胞間的分離，Polycomb 組蛋白(例如BMI1、SUZ12 和 EZH2)也存在失調(diào)，并且 microRNA-200 (miR-200)家族的表達(dá)也發(fā)生了變化。一項(xiàng)研究表明，DLD-1結(jié)腸癌細(xì)胞暴露于梯度濃度的奧沙利鉑(一種用于結(jié)腸癌的化學(xué)療法藥物)中產(chǎn)生一種化學(xué)抗性結(jié)腸癌細(xì)胞系(DLD-1-OxR)，測試其EMT 特性，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出EMT 特征，SUZ12 在DLD-1-OxR中上調(diào)，以SUZ12 為標(biāo)靶的miRNA-200 家族成員被下調(diào)[26]。

癌的進(jìn)展是一系列復(fù)雜的事件的結(jié)果，被認(rèn)為包括了EMT的可逆發(fā)展過程，在體外，microRNA-200家族通過轉(zhuǎn)錄后抑制E-cadherin 阻遏物ZEB1 和ZEB2來維持上皮表型，EMT 參與轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)，并表明miR-200 在基質(zhì)浸潤的初始階段被下調(diào)，但在轉(zhuǎn)移部位得以恢復(fù)[27]。在EMT 期間，轉(zhuǎn)錄因子(如ZEB1、SIP1、Snail1 和 Slug)的增加會強(qiáng)烈抑制 E-cadherin 基因的轉(zhuǎn)錄，使上皮細(xì)胞間特有的強(qiáng)相互作用減弱。E-cadherin 抑制物可分為兩類[28-31]：一類為直接抑制物，如Snail1、Slug、ZEB1、ZEB2(SIP1)和E47，能夠直接抑制E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄，另一類為間接抑制物，如Twist、Goosecoid、FOXC1 和 FOXC2 間接地下調(diào) E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是EMT的有效誘導(dǎo)物，miR-200 家族的過表達(dá)阻止了TGF-β誘導(dǎo)的EMT，暗示miR-200 家族是EMT 的調(diào)控者。也有資料顯示，miR-200 家族可以通過抑制ZEB1 和SIP1的翻譯來調(diào)控EMT[32]。研究表明，對結(jié)腸癌干細(xì)胞實(shí)行基因芯片分析曾發(fā)現(xiàn)：CCSCs除了可以高表達(dá)CD44 和CD166 以及其他干細(xì)胞標(biāo)記分子外，調(diào)控EMT 的Snail 也可以同步高表達(dá)[33]。綜合以上研究證據(jù)，可以證明CCSCs和EMT之間存在密切聯(lián)系。

5 EMT和CCSCs的共同影響因素

結(jié)腸癌上皮細(xì)胞的EMT 是雙向、不完全的過程，EMT 與CCSCs 會受多種因素的調(diào)節(jié)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生 EMT 時，許多 EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(ZEB1、ZEB2、SNAIL、TWIST)的蛋白活性或基因表達(dá)快速地變化，從而調(diào)控其下游相關(guān)基因簇的表達(dá)，達(dá)到影響患者的預(yù)后的目的[34]。EMT在增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力的同時，其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子SNAIL 可促使結(jié)腸癌細(xì)胞獲得CSCs 的特性，從而獲得放化療抵抗能力[35-36]，SNAIL 是 EMT 的激活劑，在結(jié)腸癌分離出的結(jié)腸球中以高水平表達(dá)，SNAIL在結(jié)腸癌細(xì)胞中的過表達(dá)誘導(dǎo)了結(jié)腸球的大多數(shù)特性，包括細(xì)胞去分化。SNAIL 調(diào)節(jié)IL-8 和其他基因的表達(dá)以誘導(dǎo)CCSCs的活動[33]。TWIST是一種具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，TWIST 包括TWIST1 和TWIST2兩種亞型，有研究發(fā)現(xiàn)，TWIST1 是一種癌基因，也是EMT 的主要基因[37]。TWIST 也可通過上調(diào)胚胎基因的表達(dá)，從而介導(dǎo)胚胎的發(fā)育[38]，新近研究證實(shí)，TWIST可使腫瘤細(xì)胞一部分基因簇再編程，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT活動[39]。也有研究發(fā)現(xiàn)，TWIST在結(jié)腸癌組織中比癌旁組織的表達(dá)高，可驅(qū)動CSCs 相關(guān)基因表達(dá)，從而促使腫瘤細(xì)胞獲得干性[40]。TWIST1可使結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞發(fā)生EMT表型轉(zhuǎn)化，降低上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)，并提高間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 Vimentin 和 N-cadherin 表達(dá)，誘發(fā) EMT 過程并促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[41]，從而獲得干細(xì)胞特性，并進(jìn)一步通過ABCB1/P-gp途徑增強(qiáng)結(jié)腸癌自身耐藥性[42]。

6 展望

CCSCs 是結(jié)腸癌產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及產(chǎn)生耐藥性的根源，是結(jié)腸癌治療失敗的重要因素，EMT 也是結(jié)腸癌侵襲的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。EMT 不僅增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力，而且反饋性促進(jìn)CCSCs 形成，CCSCs也參與了EMT 的維持及啟動，它們并不是絕對的因果關(guān)系，而是相互調(diào)控，并且受多種藥物和環(huán)境因素等的影響。尋找具有高度特異性的治療標(biāo)靶是防治結(jié)腸癌的重要方式，探索EMT 和CCSCs 之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系、深入研究該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，有望為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的靶向治療開辟新思路，也必將成為核心發(fā)展方向。EMT 對CCSCs 的調(diào)控及分子機(jī)制目前不甚明了，在后續(xù)探索中，需進(jìn)一步研究EMT 與CCSCs的雙向調(diào)控機(jī)制、處于不同分化階段的CCSCs與EMT的關(guān)系以及EMT和CCSCs靶向治療的安全性等，如若阻斷EMT 或可能將CCSCs 轉(zhuǎn)化為其終末細(xì)胞抑制增殖，將CCSCs轉(zhuǎn)化為具有較高分化程度的結(jié)腸癌細(xì)胞，為結(jié)腸癌的治療發(fā)掘更有效的手段。