大豆籽粒低聚糖及其組分含量鑒定與特異種質(zhì)篩選

李俊茹，秦 寧，李文龍，杜 匯，李喜煥，張彩英

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) / 華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001)

0 引 言

【研究意義】大豆低聚糖是其可溶性糖含量總稱(chēng)，一般包括蔗糖、棉籽糖、水蘇糖等，分別占其籽粒干基含量5%、1%和4%(合計(jì)約占8%～10%)[1-6]。大豆低聚糖具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功能[7-11]。低聚糖還可作為一種低甜度、低熱量的甜味劑替代食品加工中的蔗糖。低聚糖所具有的抗淀粉氧化功能還可用于延長(zhǎng)食品貯藏期限。【前人研究進(jìn)展】宋志峰等[12]利用高效液相色譜方法，測(cè)定來(lái)自吉林省的500份大豆品種資源低聚糖含量，結(jié)果表明，籽粒低聚糖含量分布在7.73%～13.46%，其中超過(guò)12%的品種有49個(gè)，蔗糖含量分布在3.42%～8.27%，棉籽糖含量分布在0.41%～1.37%，水蘇糖含量為3.23%～4.87%。王曉巖等[13]通過(guò)分析大豆近等基因系材料在不同生態(tài)環(huán)境條件下的低聚糖及其組分含量，發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境條件下的供試大豆材料籽粒低聚糖含量存在一定差異，其中在2種環(huán)境條件下均表現(xiàn)較優(yōu)的材料有10個(gè)。王曙明等[14]分析吉林省181份大豆資源低聚糖含量發(fā)現(xiàn)，低聚糖、棉籽糖和水蘇糖含量變異范圍為2.6%～6.7%、0.3%～1.8%和2.1%～5.1%；Yoshikawa等[15]研究15個(gè)納豆品種(包括3個(gè)優(yōu)質(zhì)、9個(gè)中等、3個(gè)劣質(zhì)品種)籽粒低聚糖含量發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)納豆資源的低聚糖含量顯著高于其它品種；王躍強(qiáng)等[16]利用美國(guó)大豆V97-3000與V99-5089構(gòu)建的分離群體，經(jīng)測(cè)定其籽粒低聚糖含量發(fā)現(xiàn)，供試材料間存在較大差異。Kerr和Neus[17-18]通過(guò)測(cè)定美國(guó)大豆種質(zhì)資源低聚糖含量，篩選出2份高蔗糖、低水蘇糖特異種質(zhì)，其蔗糖含量分別可達(dá)9.4%和11.2%，而水蘇糖含量為0.64%和0.14%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管目前有少數(shù)關(guān)于吉林及國(guó)外大豆籽粒低聚糖含量測(cè)定及優(yōu)異資源篩選研究報(bào)道，但篩選出的種質(zhì)資源遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足育種和生產(chǎn)需求。需研究大豆低聚糖及組分含量遺傳變異及其相關(guān)關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用336份來(lái)自于不同省份及不同類(lèi)型的大豆品種資源，采用高效液相色譜技術(shù)鑒定其籽粒低聚糖及其組分含量，研究其遺傳變異及其相關(guān)關(guān)系，并遴選低聚糖及其組分含量特異種質(zhì)，為大豆低聚糖含量遺傳改良奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以336份東北生態(tài)區(qū)大豆資源為材料，包括農(nóng)家品種和育成品種(系)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試材料于2019年種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物育種中心(河北保定)，行長(zhǎng)1.5 m，行距0.5 m，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2次重復(fù)。

1.2.2 低聚糖組分標(biāo)準(zhǔn)樣品配制及其線(xiàn)性方程

準(zhǔn)確稱(chēng)取蔗糖、棉籽糖和水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品各250 mg，10 mL超純水溶解，并用乙腈定容至25 mL，配制成10 g/L標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液[19]；分別從儲(chǔ)備液中精確移取一定數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶，定容后形成標(biāo)樣；制備標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行低聚糖及其組分含量測(cè)定，制作線(xiàn)性方程，計(jì)算其決定系數(shù)，用于供試資源低聚糖含量測(cè)定。表1

表1 低聚糖組分線(xiàn)性回歸方程及其決定系數(shù)Table 1 Linear regression equation and correlation coefficient of oligosaccharides

1.2.3 大豆樣品的制備

大豆低聚糖含量測(cè)定方法基本流程如下[20-24]：利用研磨機(jī)將供試大豆品種資源籽粒研磨粉碎，過(guò)60目篩；稱(chēng)取0.1 g上述豆粉(精確到0.000 1 g)，加入1.5 mL乙醇(75%色譜純)溶解振蕩15 s，超聲浸提1 h(40 Hz，60℃)；于超聲浸提后4 000 r/min離心10 min，吸取上清，過(guò)0.22 μm微孔濾膜；將濾液置于樣品瓶，經(jīng)液相色譜方法測(cè)定其蔗糖、棉籽糖、水蘇糖及其低聚糖含量。

選擇65∶35、70∶30、75∶25 3種組合進(jìn)行單因子試驗(yàn)，在其它條件一定的情況下，比較不同比例流動(dòng)相條件，大豆籽粒中蔗糖、棉籽糖、水蘇糖的出峰時(shí)間及理論塔板數(shù)。

1.2.4 低聚糖測(cè)定高效液相色譜基本條件

色譜柱：島津Inertsil氨基柱(規(guī)格為4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：超純水30%：乙腈70%(流動(dòng)相超聲脫氣30 min)；流速：1 mL/min；檢測(cè)器：RID示差折光檢測(cè)器；色譜柱溫度：35℃；檢測(cè)器溫度：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)描述統(tǒng)計(jì)、方差分析與聚類(lèi)分析等采用SPSS21.0和Excel 2010軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆低聚糖及組分含量測(cè)定方法建立

2.1.1 流動(dòng)相的確定

研究表明，隨著流動(dòng)相中乙腈比例的增加，大豆低聚糖3種組分的出峰時(shí)間延長(zhǎng)。流動(dòng)相比例在75∶25和70∶30之間都有良好的柱效(理論塔板數(shù)大于6 000)，選擇70∶30為流動(dòng)相。表2

低聚糖3種組分能夠很好的分離，且峰形較好，標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間與樣品一致，提取樣品中的成分分別是蔗糖、棉籽糖、水蘇糖。在保留時(shí)間夠短，柱效較高的情況下，選用30∶70的流動(dòng)相配比。圖1，圖2

2.1.2 低聚糖檢測(cè)方法的可靠性檢驗(yàn)

研究表明，同一大豆樣品連續(xù)6次技術(shù)重復(fù)測(cè)定結(jié)果之間相差較小，數(shù)值接近，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.53%(蔗糖)、1.72%(棉籽糖)和1.04%(水蘇糖)，均未超出2%允許誤差；重復(fù)間的數(shù)值非常接近，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.76%(蔗糖)、1.24%(棉籽糖)和0.98%(水蘇糖)，也小于2%誤差標(biāo)準(zhǔn)。表3，表4

表2 流動(dòng)相比例Table 2 Results of different ratio of mobile phase’s experiment

圖1 低聚糖組分標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.1 The oligosaccharide chromatogram of standard samples

圖2 低聚糖組分大豆樣品液相色譜圖Fig.2 The oligosaccharide chromatogram of soybean samples

表3 大豆低聚糖組分含量測(cè)定方法的技術(shù)重復(fù)精密度Table 3 The precision analysis of soybean oligosaccharides methods on technical duplication

表4 大豆低聚糖組分含量測(cè)定方法的生物學(xué)重復(fù)精密度Table 4 The precision analysis of soybean oligosaccharides methods on biological duplication

2.2 大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量總體評(píng)價(jià)

研究表明，其籽粒蔗糖、棉籽糖、水蘇糖、低聚糖平均含量分別為4.01%、1.16%、2.60%和7.77%，3種組分以蔗糖含量最高；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，其變化范圍分別為2.13%～6.26%、0.30%～2.00%、0.95%～3.87%及5.63%～11.13%，變異系數(shù)分別為15.21%、25.51%、19.16%與9.04%，以棉籽糖含量變異系數(shù)最大。有64.88%品種蔗糖含量分布在3.37%～4.47%，65.77%品種棉籽糖含量分布在0.81%～1.37%，57.44%品種水蘇糖含量分布在2.22%～3.00%，77.68%品種低聚糖含量分布在6.91%～8.38%。表5，表6

表5 供試大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量遺傳變異Table 5 The genetic variation of oligosaccharide and its component contents in soybean varieties

表6 供試大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量分布Table 6 The distribution of oligosaccharide and its component contents in soybean varieties

2.3 大豆籽粒低聚糖及組分間的相關(guān)性

研究表明，低聚糖含量與蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量間存在極顯著相關(guān)，并以低聚糖與蔗糖間的相關(guān)系數(shù)最高(0.721)，低聚糖與棉籽糖含量間的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.513，蔗糖與棉籽糖間的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.351，均達(dá)到極顯著水平，而水蘇糖與蔗糖、棉籽糖間則呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.415；r=-0.298)，協(xié)調(diào)水蘇糖與其它組分間關(guān)系是實(shí)現(xiàn)大豆低聚糖含量改良的關(guān)鍵。表7

表7 供試大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量相關(guān)性Table 7 The correlation analysis of oligosaccharide and its component contents in soybean

2.4 大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量聚類(lèi)

研究表明，在歐氏距離為15時(shí)，可將其劃分為3類(lèi)，其中第Ⅰ類(lèi)屬于低聚糖及其組分含量較高類(lèi)型，包括吉林3號(hào)、大粒黃、青雜豆、黑河9號(hào)、合豐29、黑河1號(hào)、寶豐8號(hào)、疆豐23-3412和呼交282共9個(gè)品種，該類(lèi)品種低聚糖含量平均可達(dá)10.08%，其中以呼交282低聚糖含量最高(11.13%)；第Ⅱ類(lèi)包括323個(gè)品種，屬于中間類(lèi)型，其低聚糖含量平均為7.72%；第Ⅲ類(lèi)屬于低聚糖及其組分含量較低品種，包括黑秣食豆、黑秣豆、吉育105和哈12-4547共4個(gè)品種，其低聚糖含量平均為6.54%。表8

表8 供試大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量聚類(lèi)Table 8 The cluster analysis of oligosaccharide and its component contents in soybean

2.5 大豆籽粒低聚糖及組分含量特異種質(zhì)遴選

研究表明，篩選出不同類(lèi)型高、低含量特異種質(zhì)各5份，包括低聚糖高含量特異種質(zhì)合豐29、疆豐23-3412、青雜豆、大粒黃和呼交282，其含量均在10%以上；蔗糖高含量特異種質(zhì)吉林3號(hào)、呼交282、寶豐8號(hào)、大粒黃、青雜豆，其含量均在5.59%以上；棉籽糖高含量特異種質(zhì)疆豐23-3412、毛豆、合豐44等，其含量均高于1.86%；水蘇糖高含量種質(zhì)黑秣豆(3.77%)和哈14-2146(3.87%)等。

篩選出低聚糖低含量特異種質(zhì)賓縣黑豆、哈12-4547、綏農(nóng)1號(hào)等，其含量均在6.29%以下；蔗糖低含量特異種質(zhì)哈12-4547、吉育105、黑秣豆等，其含量均在2.85%以下；棉籽糖低含量特異種質(zhì)黑秣食豆、吉育105等，其含量均低于0.56%；水蘇糖低含量特異種質(zhì)綏無(wú)腥豆3號(hào)(0.95%)和合農(nóng)69(1.08%)等。表9

3 討 論

研究利用高效液相色譜方法對(duì)供試336份大豆品種資源籽粒低聚糖及其組分含量進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蔗糖、棉籽糖、水蘇糖及低聚糖含量均值為4.01%、1.16%、2.60%和7.77%，與王曉巖[25]所測(cè)上述4種含量(4.56%、0.90%、3.39%、8.86%)、宋志峰等[12]所測(cè)4種含量(5.86%、1.01%、3.97%、10.84%)以及王曉巖等[13]所測(cè)Harosoy近等基因系在北京(4種含量4.493%、0.824%、3.243%、8.560%)和內(nèi)蒙(4種含量5.663%、0.861%、3.398%、9.922%)兩地結(jié)果相比，低聚糖含量均值稍低，而棉籽糖含量稍高，這與供試品種資源以及光周期等環(huán)境因素有一定關(guān)系。

表9 遴選出的大豆籽粒低聚糖及組分含量特異種質(zhì)Table 9 The selected soybean germplasms of oligosaccharide and its component contents

基于供試336份大豆品種資源低聚糖及其組分含量具體表現(xiàn)，研究篩選出各種類(lèi)型特異種質(zhì)共40個(gè)，其中包括高含量種質(zhì)20個(gè)、低含量種質(zhì)20個(gè)，其中低聚糖含量最高的品種為呼交282，其低聚糖總含量達(dá)到11.13%(一般品種低聚糖含量在8%左右)，且蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量也較高，可用于大豆籽粒低聚糖含量常規(guī)及分子遺傳改良。通過(guò)分析供試大豆品種資源籽粒低聚糖及其組分間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低聚糖與3種組分間均存在極顯著正相關(guān)，蔗糖與棉籽糖之間也存在顯著相關(guān)，這與王曉巖[25]研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

在流動(dòng)相比例70∶30(乙腈：水)的情況下，能達(dá)到高效穩(wěn)定的分離目的；供試東北生態(tài)區(qū)大豆種質(zhì)低聚糖及其含量存在豐富的遺傳變異，具有較大的選擇潛力；供試群體低聚糖、蔗糖、棉籽糖、水蘇糖之間相關(guān)系數(shù)達(dá)到顯著或極顯著水平；東北生態(tài)區(qū)種質(zhì)篩選出低聚糖含量各種類(lèi)型特異種質(zhì)共40個(gè)，其中包括高含量種質(zhì)20個(gè)、低含量種質(zhì)20個(gè)。