優(yōu)化頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測定蜂蜜揮發(fā)性成分的研究

蔡秋萍 陸大鵬

摘 要：為獲得蜂蜜中揮發(fā)性成分的最佳檢測條件，以總峰面積和峰數(shù)量為指標(biāo)，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行檢測，通過設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)對揮發(fā)性成分的提取參數(shù)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取條件為蜂蜜稱樣量8 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取頭，在60 ℃下萃取60 min。

關(guān)鍵詞：蜂蜜;揮發(fā)性成分;頂空固相微萃取

Optimization of Headspace Solid-Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry for the Determination of Volatile Components in Honey

CAI Qiuping， LU Dapeng

（Zhanjiang Food and Drug Inspection Institute， Zhanjiang 524000， China）

Abstract： In order to obtain the best detection conditions for volatile components in honey， the total peak area and the number of peaks were used as indicators to detect the volatile components by headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry. The extraction parameter conditions were optimized. The results showed that the optimal extraction conditions were 8 g honey sample， 65 μm PDMS/DVB extraction tip， and extraction at 60 ℃ for 60 min.

Keywords： honey; volatile components; headspace solid phase microextraction

蜂蜜含有特殊的天然芳香氣味，現(xiàn)大多數(shù)研究均圍繞蜂蜜的非揮發(fā)性成分，如理化性質(zhì)、生物活性成分等，蜂蜜的重要揮發(fā)性成分的鑒定卻鮮少報(bào)道。蜂蜜的整體品質(zhì)是多種性質(zhì)成分組合的結(jié)果，因而有必要對蜂蜜的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定。

已知報(bào)道中，蜂蜜中揮發(fā)性成分主要包括烴類、醇類、醛類、酯類、酮類、醚類、苯及其衍生物、呋喃、吡喃和萜烯類等多類物質(zhì)，這些揮發(fā)性物質(zhì)的含量很低，且對高溫敏感，且之前學(xué)者的前處理方法所選參數(shù)較多，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較復(fù)雜，使用試劑較多，為簡化實(shí)驗(yàn)，探索更加簡易方便，省時(shí)快速的前處理方法，探究合理有效的提取方法提取蜂蜜的揮發(fā)性成分很重要[1-7]。本文對頂空固相微萃取法主要條件進(jìn)行優(yōu)化，盡可能全面地提取蜂蜜的揮發(fā)性成分，并能真實(shí)地反映其組成，為后續(xù)的研究分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蜂蜜：荔枝蜜，來自廣東佛山順德。

1.1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴振蕩器，SHZ-A，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;電子天平，Qumintix 224-1CN，賽多利斯科學(xué)有限公司;手動(dòng)固相微萃取裝置，美國Supelco公司;萃取纖維頭：50/30μm DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）、65 μm PDMS/DVB（聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）、75 μm CAR/PDMS（碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）、100 μm PDMS（聚二甲基硅氧烷），美國Supelco公司;凝膠色譜-氣質(zhì)聯(lián)用儀，GDC/GCMS-QP2010，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

蜂蜜從冷藏冰箱取出后放至室溫，搖勻至樣品呈均勻液體狀態(tài)，備用。

1.2.2 揮發(fā)性成分提取方法

稱取6 g蜂蜜樣品，置于20 mL頂空瓶中密封，頂空瓶置于55 ℃恒溫水浴鍋中，將裝有65 μm PDMS/DVB萃取頭的手動(dòng)固相微萃取裝置插入頂空瓶中（萃取頭使用前需進(jìn)行老化），萃取頭不觸碰樣品，55 ℃頂空吸附50 min，250 ℃解吸，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）分析。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

對1.2.2的揮發(fā)性成分提取方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，對萃取頭、萃取溫度、萃取時(shí)間、稱樣量進(jìn)行研究，確定頂空固相微萃取法的前處理參數(shù)。

（1）萃取頭的選擇。4個(gè)備選萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS。準(zhǔn)確稱量蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，分別用4種萃取頭在水浴中萃取后，進(jìn)行GC-MS分析。

（2）萃取溫度。稱量蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，設(shè)置萃取溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃，分別在上述溫度下萃取，進(jìn)行GC-MS分析。

（3）萃取時(shí)間。稱量蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，設(shè)置萃取時(shí)間為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和70 min，分別按上述時(shí)間進(jìn)行萃取，進(jìn)行GC-MS分析。

（4）萃取樣品量。設(shè)置稱量量為1 g、2 g、4 g、6 g、8 g和12 g，稱取上述重量的蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，在50 ℃萃取50 min，進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.4 分析條件

（1）萃取頭的老化。固相微萃取頭在使用前需在氣相色譜的進(jìn)樣口進(jìn)行老化，溫度為250 ℃，時(shí)間為1 h。

（2）氣相色譜條件。DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）;初始溫度40 ℃，保持1 min，3 ℃/min升到100℃，保持10 min，再以5 ℃/min升到150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣He，流速1.5 mL/min;不分流進(jìn)樣。

（3）質(zhì)譜條件。電離方式：電子轟擊EI;離子源溫度：200 ℃;接口溫度：250 ℃;掃描模式：全掃描;掃描質(zhì)子范圍：35～500 m/z;EI電子能量：

70 eV。各組分經(jīng)過NIST17.0標(biāo)準(zhǔn)普庫檢索匹配。

2 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以總峰面積和數(shù)量作為指標(biāo)參數(shù)，獲得較佳的頂空固相微萃取條件參數(shù)。

2.1 萃取頭的選擇

萃取頭是一根涂有不同色譜固定相或吸附劑的熔融石英纖維，萃取頭是固相微萃取技術(shù)的核心，直接影響著固相微萃取的效果。由表1可以看出，盡管4種萃取頭都適用于揮發(fā)性成分的萃取，但是各自有不同專攻的應(yīng)用范圍，在分析香氣成分以及揮發(fā)性物質(zhì)上有著各自的優(yōu)勢。因此本實(shí)驗(yàn)考察這4種萃取頭在蜂蜜中的應(yīng)用，選取合適的萃取頭。經(jīng)GC-MS分析，結(jié)果如圖1所示。

在相同的萃取條件下，不同萃取頭的萃取效果如圖1（a），萃取蜂蜜中的揮發(fā)性成分總峰面積最大的萃取頭規(guī)格是65 μm PDMS/DVB，萃取總峰面積最小的是50/30 μm DVB/CAR/PDMS規(guī)格的萃取頭，理論上萃取頭吸附材料的填充厚度與吸附容量為正相關(guān)關(guān)系，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸附材料的膜填充量大并不代表萃取的物質(zhì)的量就多，原因在于蜂蜜的揮發(fā)性成分復(fù)雜，而萃取頭的固定相具有選擇性。

結(jié)合表1的萃取頭推薦應(yīng)用描述，可知蜂蜜的揮發(fā)性物質(zhì)中氣體分子和小分子量化合物的比例較小，MW 30～275型萃取頭不足以涵蓋蜂蜜揮發(fā)性成分的范圍，更多的物質(zhì)的量應(yīng)該在MW 275以上。

僅從總峰面積來評價(jià)萃取頭的吸附效果不夠全面，總峰面積能表明萃取頭吸附是否充分，可能情況是對蜂蜜中的揮發(fā)性單一成分或者其中的幾種成分有較充分的吸收，但不能體現(xiàn)吸附的揮發(fā)性成分的種類是否齊全，所以需要評價(jià)峰數(shù)量指標(biāo)。從圖1（b）中可以看出，萃取蜂蜜揮發(fā)性成分峰數(shù)量較多的萃取頭規(guī)格是65 μm PDMS/DVB，峰數(shù)量達(dá)到84個(gè)，其次是50/30 μm DVB/CAR/PDMS，峰數(shù)量達(dá)到60個(gè)，而75 μm CAR/PDMS和100 μm PDMS吸附的峰數(shù)量相對較少，僅為32個(gè)和41個(gè)。峰數(shù)量越多表明吸附的揮發(fā)性成分種類越多，吸附的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量與萃取頭的固定相有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萃取頭含有DVB這種固定相材料更有利于提取蜂蜜中的揮發(fā)性成分。

結(jié)合總峰面積和峰數(shù)量綜合評價(jià)萃取頭，4種萃取頭規(guī)格中適合蜂蜜中揮發(fā)性成分分析的為65 μm PDMS/DVB。

2.2 萃取溫度的優(yōu)化

在本方法中，蜂蜜沒經(jīng)過復(fù)雜的預(yù)處理，或是溶劑萃取，因此溫度對萃取效率的影響尤為重要。選擇合適的溫度是確保最佳萃取速度和靈敏度的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

從圖2（a）的結(jié)果顯示，蜂蜜在同等的萃取條件下，隨著溫度的升高，萃取物質(zhì)的總峰面積整體呈現(xiàn)遞增趨勢，這與隨著溫度的上升有關(guān)，分析物熱運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)，揮發(fā)性成分在頂空空間中分配系數(shù)變大，而且可能產(chǎn)生新的物質(zhì)，所以總峰面積總體是遞增的趨勢。而圖2（b）中萃取溫度對峰數(shù)量的影響是正向的，在50 ℃時(shí)峰數(shù)量達(dá)94個(gè)，50～70 ℃的峰數(shù)量基本一致。綜合評價(jià)總峰面積和峰數(shù)量，需要找到一個(gè)合適的溫度既能真實(shí)充分體現(xiàn)蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)的種類，有足夠的物質(zhì)的量進(jìn)行分析，又盡量不產(chǎn)生新的物質(zhì)，在50～60 ℃選擇，本實(shí)驗(yàn)考慮使用60 ℃為較好的萃取溫度。

2.3 萃取時(shí)間的優(yōu)化

頂空固相微萃取的萃取過程是一個(gè)動(dòng)力學(xué)平衡的過程，選擇合適的時(shí)間十分重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3中是萃取時(shí)間對蜂蜜萃取的影響，可以看到隨著時(shí)間的延長，蜂蜜萃取的總峰面積和峰數(shù)量都呈現(xiàn)著遞增的趨勢，且在40～70 min，總峰面積和峰數(shù)量趨于相同，在60 min達(dá)到總峰面積最高和峰數(shù)量最多?；谠陧斂瘴⑤腿?yōu)化實(shí)驗(yàn)已得到較佳萃取頭、萃取溫度的前提下設(shè)計(jì)了萃取時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，為得到較好的萃取效果，在確保萃取效果的情況下，應(yīng)選擇較短的分析時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)所選擇的萃取時(shí)間為60 min。

2.4 萃取樣品量的優(yōu)化

在頂空固相微萃取中，頂空空間體積直接影響著頂空吸附的效率，頂空空間體積與樣品取樣量及頂空裝置的比例有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著取樣量的遞增，總峰面積和峰數(shù)量的變化規(guī)律是一致的，均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。在較少取樣量時(shí)（1 g、2 g、4 g），總峰面積和峰數(shù)量變化不明顯且均在較低水平，樣品量為6 g和8 g時(shí)，總峰面積和峰數(shù)量均達(dá)到較高水平，之后隨著取樣量遞增（10 g、12 g），萃取效果顯著變差。因此，取樣量8 g時(shí)樣品的頂空空間體積與樣品量的比例較合適，本實(shí)驗(yàn)選擇8 g為蜂蜜的取樣量。

3 結(jié)論

對頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以總峰面積和峰數(shù)量為指標(biāo)進(jìn)行比較，得到頂空固相微萃取的最佳參數(shù)為蜂蜜稱樣量為8 g，使用65 μm PDMS/DVB的萃取頭，在60 ℃下萃取60 min，且本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單、快速、環(huán)保，能真實(shí)有效地反映蜂蜜中的揮發(fā)性成分的含量情況。本研究為蜂蜜揮發(fā)性成分的研究提供一定的理論依據(jù)。

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