不同微生物菌劑對草莓炭疽病防控和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

王明湖， 連瑛， 李雅穎， 謝媛， 徐力斌， 汪國文， 吳愉萍*

(1.寧波市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綠色發(fā)展中心，浙江 寧波 315012； 2.浙江省城市環(huán)境過程與污染控制重點實驗室中國科學(xué)院寧波城市環(huán)境觀測研究站，浙江 寧波 315830； 3.杭州彌奧科技有限公司，浙江 杭州 310007； 4.奉化區(qū)大堰鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村辦公室，浙江 寧波 315509； 5.余姚市銀農(nóng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料商店，浙江 寧波 315400)

草莓在全球經(jīng)濟作物中具有非常重要的地位，近年來，我國草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位[1]，草莓已經(jīng)成為最受老百姓歡迎的季節(jié)性水果之一，草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展也是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要保障內(nèi)容。炭疽病是一種高溫、高濕型真菌性病害，為草莓最主要的病害之一，通常南方地區(qū)發(fā)生較為普遍，主要發(fā)生在草莓生產(chǎn)初期，常造成25%～30%減產(chǎn)，嚴重影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。在炭疽病防治過程中農(nóng)民大量使用化學(xué)藥劑，使草莓成為安全風(fēng)險等級較高的農(nóng)產(chǎn)品[3-4]。

微生物菌劑是一種防控草莓炭疽病的新的綠色防控技術(shù)手段，可以有效減少化學(xué)藥劑的使用，增加土壤微生物含量[5]，提高土壤養(yǎng)分有效性[6]，促進草莓植株健康生長[7]，符合國家倡導(dǎo)的綠色發(fā)展理念。本文以5種不同的微生物菌劑為研究對象，在大棚草莓種植中參照綠色食品標(biāo)準(zhǔn)施用農(nóng)藥和肥料，研究在減少化肥和農(nóng)藥使用的前提下，不同微生物菌劑對草莓炭疽病的抑制作用，進而為草莓炭疽病的綠色防控提供對策。

1 材料與方法

1.1 材料

供試草莓品種為紅顏(紅頰)，屬高感炭疽病品種[8]。

試驗地為浙江省寧波市北侖區(qū)一大棚草莓種植基地，地理坐標(biāo)為121°46′23.49″E，29°51′41.00″N。

土壤pH 4.46，有機質(zhì)含量為31.0 g·kg-1，水解性氮含量為234 mg·kg-1,有效磷含量為134 mg·kg-1,速效鉀含量為453 mg·kg-1。

供試的5種微生物菌劑由杭州彌奧科技有限公司研制，其中4種為純菌株，代號分別為F2(枯草芽孢桿菌，Bacillussubtilis)、F8(多黏芽孢桿菌，Bacilluspolymyxa)、F11(解淀粉芽孢桿菌，Bacillusamyloliquefaciens)、F12(貝萊斯芽孢桿菌，Bacillusbelais)；1種為復(fù)合菌劑，由上述4種菌株混合而成。

1.2 處理設(shè)計

試驗設(shè)置CK(不施微生物菌劑)、F2、F8、F11、F12和F(由F2、F8、F11、F12菌株組成的復(fù)合菌劑)6個處理。菌劑用量：曬干發(fā)酵羊糞+6.7%液體菌劑拌勻作基肥使用，每小區(qū)施用羊糞15 kg，菌液1 L；移栽時每小區(qū)0.5 L菌液稀釋30倍澆根；CK組用自來水代替菌液。每個處理重復(fù)3次，采用隨機區(qū)組設(shè)計。每個小區(qū)面積為16 m2。所有小區(qū)施肥、用藥均相同，施肥按照NY/T 394—2013《綠色食品 肥料使用準(zhǔn)則》，用藥按照NY/T 393—2013《綠色食品 農(nóng)藥使用準(zhǔn)則》。

7月6日施入菜籽餅和石灰氮，翻耕后灌水，覆蓋地膜開始高溫悶棚。8月16日施入其他基肥后開溝整地，整好地后，按照試驗設(shè)計，條施經(jīng)過微生物菌劑或自來水(CK)處理的羊糞。9月11日草莓移栽定植。9月12日按試驗設(shè)計方案澆施不同菌液或自來水(CK)。10月9日第二次澆施菌液。11月1日草莓覆蓋地膜。11月7日蓋大棚膜。11月15日蜜蜂進棚，草莓進入始果期。12月29日第一批草莓成熟。次年4月3日草莓采摘結(jié)束。草莓達到上市標(biāo)準(zhǔn)后采摘，并記錄每次產(chǎn)量。

1.3 測定參數(shù)與方法

密切關(guān)注移栽后草莓炭疽病的發(fā)病和致死情況，統(tǒng)計各處理草莓病死植株數(shù)量。

采集處理前(8月15日)、第二次施用菌液后第3天(10月12日)和掛果后期(次年3月14日)各處理土壤樣品，提取土壤菌群DNA，采取高通量測序的手段，進行真菌和細菌群落結(jié)構(gòu)的分析。分別于處理前(8月15日)、始果期(11月13日)、掛果初期(12月5日)、盛果期(次年1月22日)和掛果后期(次年3月14日)采集微生物菌劑處理土壤混合樣品和CK處理樣品，測定pH值、有機質(zhì)、水解性氮、有效磷和速效鉀含量。

按照操作說明書進行土壤菌群DNA的提取，使用Power Soil DNA提取試劑盒(美國MoBio)從0.1 g的土壤樣品(冷凍干燥)中提取DNA。所得的DNA最后用100 μL的無菌水洗脫到2 mL離心管中，后保存于-20 ℃以備后續(xù)分析。MiSeq高通量測序，細菌16S rRNA與真菌ITS分別用515F和907R、ITS1F和ITS2進行擴增，并在Illumina MiSeq平臺(300×2)上測序。測序數(shù)據(jù)已提交在BioProject PRJNA 558591的NCBI序列數(shù)據(jù)庫(SRA)中。pH參照NY/T 1377-2007《土壤pH的測定》方法測定；速效鉀含量參照LY/T 1234—2015《森林土壤鉀的測定》方法測定；水解性氮含量參照LY/T 1228—2015《森林土壤氮的測定》方法測定；有效磷含量參照NY/T 1121.7—2014《土壤檢測 第7部分：土壤有效磷的測定》方法測定；有機質(zhì)含量參照NY/T 1121.6—2006《土壤檢測 第6部分：土壤有機質(zhì)的測定》方法檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用DPS V 9.01軟件進行整理并繪制表格，使用SigmaPlot 10.0繪制圖形。高通量測序的原始雙端數(shù)據(jù)采用Fastq進行數(shù)據(jù)質(zhì)控查看、過濾掉低質(zhì)量的測序結(jié)果；再用Usearch進行拼接、修剪到預(yù)期的片段大小(300～385 bp)，然后使用USEARCH v6.1.544刪除嵌合體。使用QIIME 1.9.1和UNITE數(shù)據(jù)庫(12.11)以及BLAST方法，在97%的相似性下，按照Open reference方法來提取操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)。利用R語言v 3.6.0(R Core Team，2019)中“vegan”程序包對細菌和真菌群落進行主坐標(biāo)分析(PCoA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微生物菌劑對炭疽病的防治效果

由圖1可知，不同微生物菌劑處理下草莓炭疽病致死情況顯著不同。與CK相比，F(xiàn)2、F8和F11處理組草莓因炭疽病死亡數(shù)顯著增加。F12處理與CK處理草莓死亡數(shù)無顯著差異。F處理草莓死亡棵數(shù)比CK處理顯著減少，死亡率降低。復(fù)合菌劑的使用能夠有效抵抗草莓炭疽病的發(fā)生，進而增加草莓產(chǎn)量，獲取相對較高的經(jīng)濟收益。單一菌劑對草莓炭疽病沒有防治效果，但復(fù)合菌劑可以顯著降低草莓炭疽病的發(fā)病致死現(xiàn)象，這可能和復(fù)合菌劑的協(xié)同作用有關(guān)。該復(fù)合菌劑中的微生物可能在環(huán)境中發(fā)揮了正向作用，改善了土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，提高了土壤養(yǎng)分的有效性，進而增強了作物的抵抗力?；蛘邚?fù)合菌劑的微生物在環(huán)境中占有絕對優(yōu)勢，有效抑制了炭疽病菌的生長。具體是哪一種機制產(chǎn)生作用，還有待進一步研究。

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 不同處理下草莓炭疽病死亡數(shù)及死亡降低率

2.2 不同處理對土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)的影響

不同處理土壤DNA提取含量在60.97～88.53 ng·μL-1(圖2)。無論是10月12日還是次年3月14日，不同處理間土壤DNA提取含量均無顯著差異。土壤DNA含量可以表征土壤微生物生物量[9]，在本試驗中，不同微生物菌劑處理后，土壤微生物生物量無顯著差異。

細菌主要以變形菌門(相對豐度29.7%)、擬桿菌門(相對豐度11.8%)和綠彎菌門(相對豐度11.0%)為主，微生物菌劑處理后能顯著增加厚壁菌門的相對豐度(圖3)，這與微生物菌劑為厚壁菌門一致。主坐標(biāo)分析表明，微生物菌劑處理能顯著改變土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，使用微生物菌劑后土壤細菌群落明顯改變，但是同一采樣時間不同微生物菌劑處理之間差異不顯著(圖4)。真菌主要以球囊菌門(相對豐度36.7%)和子囊菌門(相對豐度17.4%)為主(圖3)。主坐標(biāo)分析表明，不同處理之間及不同采樣時期之間土壤真菌群落差異不明顯(圖4)。微生物菌劑的添加能對土壤的細菌群落產(chǎn)生顯著影響，但是對真菌的作用不明顯。

P為供試地塊微生物菌劑處理前(2018年8月15日)采集的土壤樣品，圖3、4同。圖2 不同處理土壤DNA提取含量

1st為10月12日采集的土壤樣品；2nd為3月14日采集的土壤樣品。圖3 不同處理細菌和真菌的群落組成

菌劑處理前樣品采集為8月15日；第一次樣品采集為10月12日；第二次樣品采集為3月14日。圖4 不同處理細菌和真菌的主坐標(biāo)分析圖

2.3 微生物菌劑對土壤養(yǎng)分含量的影響

整個草莓生長周期，無論是CK組還是微生物菌劑處理組，土壤中養(yǎng)分含量豐富，整體變化趨勢基本一致(表1)。微生物菌劑處理后的土壤pH、水解性氮、有效磷和有機質(zhì)4個指標(biāo)均略高于CK組。速效鉀含量則呈負效應(yīng)，微生物菌劑處理后的土壤較CK組明顯降低，可能與土壤本身速效鉀含量過高，屬于富鉀狀態(tài)有關(guān)，菌劑處理后調(diào)節(jié)土壤中鉀含量，向更有利于植物和微生物利用方向轉(zhuǎn)變有關(guān)。

表1 微生物菌劑對土壤營養(yǎng)成分的影響

3 小結(jié)

本研究中，由F2、F8、F11、F12菌株混合而成的復(fù)合微生物菌劑顯著降低了草莓炭疽病發(fā)病植株死亡率。不同微生物菌劑處理對土壤微生物生物量和真菌的群落結(jié)構(gòu)影響不大，但顯著影響了土壤細菌的菌落結(jié)構(gòu)，增加了厚壁菌門的相對豐度。選擇適宜的微生物菌劑可以作為草莓綠色防控的一種手段，進而減少農(nóng)藥用量。