天臺(tái)鐵線蓮花色變異的轉(zhuǎn)錄組分析

葉友菊， 胡青荻， 鄭堅(jiān)， 馬曉華， 張旭樂(lè)， 錢(qián)仁卷

(浙江省亞熱帶作物研究所 溫州市資源植物創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325005)

毛茛科鐵線蓮屬(Clematis)植物，因花朵艷麗被譽(yù)為園林中的“藤本皇后”[1-2]，廣泛應(yīng)用于盆栽花卉等[3]。我國(guó)鐵線蓮屬植物種類(lèi)繁多，其中天臺(tái)鐵線蓮為浙江特有瀕危種，是浙江省重點(diǎn)保護(hù)野生植物[4]。天臺(tái)鐵線蓮為平展型大花，花期一般在5—6月，花萼通常為白色[5]，花量大、花色變異豐富，極具觀賞價(jià)值，且兼?zhèn)渌幱脙r(jià)值，是不可多得的鐵線蓮育種親本[6]。

花色素的存在及其變化是植物花色表現(xiàn)的化學(xué)機(jī)制，絕大多數(shù)植物累積特定的花色素種類(lèi)，從而呈現(xiàn)出一定的花色表型，與花色的深淺程度密切相關(guān)[7]。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，植物育種研究也有了新的思路和手段，基于組學(xué)分析植物花色素苷的合成與調(diào)控已成為植物花色素苷新的研究方向[8-9]。鄧嬌等[10]基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示雙色花蓮大灑錦花色形成機(jī)理；潘新怡[11]基于組學(xué)對(duì)紫花苜?；ㄉ嚓P(guān)基因進(jìn)行了挖掘與鑒定；趙君等[12]通過(guò)代謝組學(xué)對(duì)向日葵不同花色物質(zhì)組成進(jìn)行分析。不難發(fā)現(xiàn)，組學(xué)已經(jīng)成為目前植物花色研究的熱門(mén)方向。

本課題組在天臺(tái)鐵線蓮引種馴化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了花萼呈現(xiàn)白色和紫色相間以及花萼全部為藍(lán)紫色的多個(gè)變異植株，且在連續(xù)3個(gè)開(kāi)花周期的觀察下都呈現(xiàn)穩(wěn)定的花色性狀，該發(fā)現(xiàn)不僅為鐵線蓮增加了重要的花色種質(zhì)資源，也為研究鐵線蓮花色變異形成機(jī)制提供了理想的材料。為了進(jìn)一步探究影響花色素形成的機(jī)制，我們利用天臺(tái)鐵線蓮的白色原種和花色變異材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)GO和KEGG富集及功能注釋?zhuān)诰蚩赡軈⑴c花色變異的差異表達(dá)基因，為闡明天臺(tái)鐵線蓮的花色變異機(jī)制提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)對(duì)于了解其余種類(lèi)鐵線蓮花色的形成以及培育也具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用試驗(yàn)材料為浙江省溫州市的浙江省亞熱帶作物研究所國(guó)家鐵線蓮種質(zhì)資源庫(kù)保存的天臺(tái)鐵線蓮，選取花色為白色(TTCB)的原種、花萼呈現(xiàn)淡紫色相間(TTJD)、紫色相間(TTJ)、藍(lán)紫色相間(TTJZ)以及花萼全部為藍(lán)紫色(TTSZ)的變異植株為試驗(yàn)材料(圖1)。所選植株為同一生長(zhǎng)環(huán)境下同一物種的不同變異，無(wú)病蟲(chóng)害。采樣時(shí)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，新鮮采集的花朵立即用液氮速凍處理，然后儲(chǔ)存在-80 ℃用作RNA提取。

圖1 不同花色的天臺(tái)鐵線蓮材料

1.2 方法

1.2.1 文庫(kù)構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

天臺(tái)鐵線蓮花萼研磨在液氮條件下完成，選用植物RNA提取試劑盒(Tiangen，Beijing)進(jìn)行RNA提取。RNA濃度和純度(D260/D280≈2.1，D260/D230>1.8)的檢測(cè)通過(guò)NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo，USA)完成，之后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析RNA的完整性。樣品檢測(cè)合格后，利用RNA文庫(kù)試劑盒進(jìn)行mRNA純化及文庫(kù)構(gòu)建(NEB，USA)，樣品的測(cè)序由美吉生物科技有限公司Illumina HiseqTM4000完成。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理及分析

Raw reads進(jìn)行過(guò)濾處理后得到Clean reads。由于天臺(tái)鐵線蓮沒(méi)有相應(yīng)的參考基因組序列，本研究采用de novo組裝方法，使用Trinity軟件對(duì)Clean reads進(jìn)行組裝，之后利用Tgicl對(duì)轉(zhuǎn)錄本聚類(lèi)去冗余，得到unigene作為后續(xù)分析的參考序列。采用fold change≥2.00、adjustedP≤0.05的方式篩選差異基因，差異基因的表達(dá)豐度用FPKM值表示。采用Blast2GO軟件對(duì)篩選到的DEGs進(jìn)行GO富集分析并進(jìn)行GO功能統(tǒng)計(jì)[13]?；贙EGG注釋結(jié)果，利用KOBAS 3.0對(duì)檢測(cè)到的差異基因進(jìn)行pathway富集分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

天臺(tái)鐵線蓮白花和深紫花各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共構(gòu)建15個(gè)cDNA文庫(kù)，基于Illumina HiseqTM4000測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)濾篩選后共獲得了136.03 Gb的clean data，每個(gè)樣品獲得6 Gb左右的clean data，其中Q30的占比超過(guò)92%，GC含量均在45%以上(表1)。

表1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)

2.2 樣品主成分分析

為了進(jìn)一步了解多個(gè)花色變異品種的關(guān)系，我們對(duì)樣品進(jìn)行了主成分分析。結(jié)果表明，淡紫色相間(TTJD)以及紫色相間(TTJ)的花與原種白色(TTCB)的花差異較小，而在花色呈現(xiàn)藍(lán)紫色之后，與白色(TTCB)的花差異則明顯增大(圖2)。這一現(xiàn)象也與天臺(tái)鐵線蓮花色性狀一致。

圖2 樣品主成分分析

2.3 差異表達(dá)基因分析

為進(jìn)一步探究天臺(tái)鐵線蓮花色變異機(jī)制，我們構(gòu)建了韋恩圖，結(jié)果表明，17 550個(gè)基因在所有花色中都表達(dá)(圖3)。對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)白色花(TTCB)和藍(lán)紫色花(TTSZ)之間存在最多的差異基因，數(shù)量高達(dá)24 016個(gè)，其中11 543個(gè)基因發(fā)生上調(diào)，12 473個(gè)基因發(fā)生下調(diào)，其次是淡紫色相間的花(TTJD)和藍(lán)紫色花(TTSZ)、紫色相間的花(TTJ)和藍(lán)紫色花(TTSZ)以及藍(lán)紫色相間的花(TTSZ)和藍(lán)紫色花(TTSZ)之間的差異基因。

2.4 差異表達(dá)基因GO分類(lèi)

差異表達(dá)基因GO分類(lèi)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，天臺(tái)鐵線蓮花色變異的DEGs主要富集在生物過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)(圖4)，這些結(jié)果對(duì)于花色的形成和變異具有重要的指導(dǎo)意義。在TTCB 與 TTJ的富集結(jié)果中，DEGs主要富集在生物合成和代謝過(guò)程方面，而在TTCB與TTJD、TTCB與TTJZ和TTCB與TTSZ的富集結(jié)果中，DEGs主要富集在代謝過(guò)程方面。在TTCB 與 TTSZ的富集結(jié)果中，BP中的不飽和脂肪酸代謝過(guò)程(GO:0033559和GO:0006636)、一元羧酸代謝過(guò)程(GO:0072330)顯著富集，MF中的萜烯合成途徑(GO:0016835)和檸檬烯合成途徑(GO:0010333)顯著富集，說(shuō)明這些都參與到花色變異的機(jī)制中。

圖3 不同花色的差異表達(dá)基因分析

圖4 差異表達(dá)基因的GO富集

2.5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

進(jìn)一步通過(guò)KEGG富集分析表明，在TTCB與TTJ的富集結(jié)果中，DEGs主要富集在生物合成和代謝過(guò)程方面，而在TTCB與TTJD、TTCB與TTJZ和TTCB與TTSZ的富集結(jié)果中，DEGs主要富集在代謝過(guò)程方面。不難發(fā)現(xiàn)大多數(shù)DEGs顯著富集在萜類(lèi)生物合成、氮代謝、吲哚生物堿生物合成、生物素代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等代謝途徑(圖5)。此外，對(duì)天臺(tái)鐵線蓮花色影響最為重要的花青素合成途徑，在TTCB與TTSZ中達(dá)到最多的差異基因數(shù)量(17個(gè))，而在TTCB與TTJD、TTCB與TTJ和TTJ與TTSZ中分別是6、10和16個(gè)，表明隨著花色差異增大參與花青素合成的差異基因越多。

圖5 差異表達(dá)基因的KEGG富集

3 討論

花色是觀賞植物重要的性狀指標(biāo)，鐵線蓮作為我國(guó)重要的觀賞類(lèi)植物，如何培育花色豐富的鐵線蓮新品種是鐵線蓮育種者一直以來(lái)追求的目標(biāo)，因而了解鐵線蓮花色形成及變異的分子機(jī)理顯得尤為重要[15-17]。影響植物花色的因素有很多，包括光照、水分和溫度等外部環(huán)境因素，但是最主要的還是由基因決定其呈色[18-19]。從分子層面對(duì)不同性狀之間基因差異進(jìn)行分析成為主要研究方向之一[20-21]。隨著近年來(lái)高通量測(cè)序技術(shù)高速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在植物分子研究中得到廣泛的應(yīng)用。

本研究以天臺(tái)鐵線蓮的白花為對(duì)照組，多個(gè)花色變異品種為試驗(yàn)組，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并獲得136.03 Gb的clean data。差異基因統(tǒng)計(jì)分析表明，天臺(tái)鐵線蓮的白色花和藍(lán)紫色花存在最多的差異基因，高達(dá)24 016個(gè)，且這些差異基因主要富集到代謝過(guò)程中。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因KEGG通路富集結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TTCB與TTSZ在花青素合成途徑中富集到最多的差異基因(17個(gè))，TTCB與TTJZ存在16個(gè)差異基因，而TTCB與TTJD和TTCB與TTJ中分別僅有6和10個(gè)。結(jié)合PCA分析，可以發(fā)現(xiàn)隨著藍(lán)紫色物質(zhì)的積累，與白色花的差異越來(lái)越大，而這些差異基因可能也是造成天臺(tái)鐵線蓮花色存在差異的重要原因(圖2)。徐建等[22]通過(guò)對(duì)矮牽牛基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析及F3′5′H基因的功能鑒定，發(fā)現(xiàn)F3′5′H基因促使轉(zhuǎn)基因后代的矮牽?；ò瓿尸F(xiàn)紫色；洪燕紅等[23]發(fā)現(xiàn)，在紅花草莓中FaMYB82、FaMYB6、FaMYB90可能通過(guò)調(diào)節(jié)FaPAL、Fa4CL、FaDFR和Fa3GT的表達(dá)來(lái)調(diào)控花瓣色澤的形成。在本研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)白色和藍(lán)紫色花之間存在著較多的差異基因，其花青素合成途徑中也存在著較大的差異，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究[24]。