建立高效液相色譜法指紋圖譜分析方法評價五味子藥材質(zhì)量

王艷紅，張任男，王纓，歷娜，沈振鐸

1.山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264210；2.山東博安生物技術(shù)有限公司，山東 煙臺 264670

五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實。習(xí)稱“北五味子”。研究表明，五味子中木脂素類成分為主要的活性成分［1-3］，起到保肝、抗氧化等藥理作用。五味子為臨床常用中藥，收錄于《中國藥典》（2020 年版）一部［4］。目前五味子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚存在諸多不足，特別是指標(biāo)成分較為單一。中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性和多樣性是其發(fā)揮療效的基礎(chǔ)，亦是評價藥材質(zhì)量的重點和難點［5］。中藥材色譜指紋圖譜可以從整體上反應(yīng)藥材全貌和主要化學(xué)成分的特征；可評價中藥材間的質(zhì)量差異，用于綜合判斷中藥材質(zhì)量。目前，五味子指紋圖譜多采用高效液相色譜法（HPLC）、超高效液相色譜法（UPLC）［6-11］等，但當(dāng)前的色譜方法對主要成分的分離效果參差不齊，且對藥材評價手段未達成共識。因此，本研究建立了五味子藥材的HPLC 指紋圖譜及多指標(biāo)成分指認(rèn)，通過聚類分析建立相似度模型，綜合判斷五味子藥材質(zhì)量，為五味子中藥材質(zhì)量控制提供支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀；CPA225D 電子天平（賽多利斯公司）；XSE205 十萬分之一天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；HH-6 電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海拓赫機電科技有限公司）。

1.2 試藥

標(biāo)準(zhǔn)化合物五味子醇甲、戈米辛-D、戈米辛-J、五味子醇乙、前戈米辛、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子酯甲、巴豆酰戈米辛-P、戈米辛-E、五味子甲素、戈米辛-N、五味子乙素和五味子丙素均由沈陽藥科大學(xué)藥物分析實驗室從五味子中分離得到，并用TLC、HPLC 方法確認(rèn)其性質(zhì)和純度，純度均在95%以上。甲醇（色譜純，Merk）、乙腈（色譜純，Merk）；超純水自制。本研究共自采了14 批不同產(chǎn)地五味子藥材，見表1，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院孫啟時教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill 的干燥成熟果實，藥材粉碎后過 40 目篩，粉末置干燥器中于陰涼處密閉儲存。

表1 五味子藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～20 min，55%A →35%A；20～26 min，35%A；26～50 min，35%A →25%A，柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測波長：220 nm；進樣量：5 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制 分別取木脂素類對照品五味子醇甲（Schi）、戈米辛-D（GD）、戈米辛-J（GJ）、五味子醇乙（Aom）、前戈米辛（Pre-G）、當(dāng)歸酰戈米辛H（Ange）、五味子酯甲（Schi-A）、巴豆酰戈米辛-P（Tig）、戈米辛-E（GE）、五味子甲素（Deoschi）、戈米辛-N（GN）、五味子乙素（γ-schi）和五味子丙素（Schi-C）對照品適量，精密稱定，置10 mL 容量瓶，加入適量甲醇溶解，并繼續(xù)用甲醇定容即得，使Schi、GD、GJ、Aom、Pre-G、Ange、Schi-A、Tig、GE、Deo-schi、GN、γ-schi 和Schi-C各成分濃度依次為2.0，1.0，1.0，2.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0 和1.0 mg/mL，2～8 ℃于藥品儲存柜保存。

2.2.2 供試品溶液的配制 取藥材粉末500 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加入色譜甲醇約20.0 mL，超聲波提取20 min，甲醇定容至刻度，混勻，0.45 μm 濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液分析。

2.3 精密度試驗

取藥材（5）粉末約500 mg，精密稱定，按“2.2.2供試品溶液的配制”項下操作，按“2.1 色譜條件”項下連續(xù)進樣6 次。結(jié)果顯示，主要成分色譜峰的相對保留時間（RRT）的RSD 小于0.2%，相對峰面積（RA）的RSD 小于0.6%，精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗

取藥材（5）粉末約500 mg，精密稱定，按“2.2.2供試品溶液的配制”項下操作，平行制備5 份供試品溶液，按“2.1 色譜條件”檢測分析。結(jié)果顯示，主要成分色譜峰的RRT 的RSD 小于0.9%，RA 的RSD小于4.2%，方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取五味子藥材（5）約500 mg，精密稱定，按“2.2.2供試品溶液的配制”項下操作，分別在0、2、4、8、12 和24 h 時間點檢測分析，結(jié)果顯示，主要成分色譜峰的RRT 的RSD 小于0.9%，RA 的RSD 小于3.4%，說明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 五味子HPLC 色譜指紋圖譜共有模式的建立

內(nèi)參比峰選擇：選擇位于保留時間中間位置的Tig（8 號峰）為內(nèi)參比峰。14 批五味子共確定了13 個共有峰，并且對13 個共有峰進行了指認(rèn)。圖譜見圖1。

圖1 五味子HPLC指紋圖譜：A.對照品；B.樣品

2.7 五味子藥材色譜指紋圖譜

測定了14 批樣品，以各色譜峰的RRT 定性，按下式計算各色譜峰面積相對其稱樣量的比值，數(shù)據(jù)見表2。HPLC 指紋圖譜見圖2。

圖2 14批五味子HPLC指紋圖譜

表2 14批五味子指紋圖譜中13個指認(rèn)成分的相對峰面積

注：Xn表示第n個樣品的某個組分的峰面積與稱樣量的比值，若某一樣品在指定位置未檢測到色譜峰，則Xn為零；An表示第n個樣品相應(yīng)組分的峰面積；Wn表示第n個樣品的稱樣量。

2.8 五味子HPLC 指紋圖譜質(zhì)量鑒定

2.8.1 基于SPSS 的聚類分析 將表2 數(shù)據(jù)代入SPSS 軟件對其進行聚類分析，采用組間（between groups）鏈鎖法，以歐氏距離（euclidean distance）為測度。結(jié)果顯示，14 批五味子樣品被劃分為兩類，結(jié)合外觀形態(tài)，可判定第I 類為推薦品，第Ⅱ類為一般品。聚類譜系圖見圖3。聚類分析結(jié)果：1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14 號樣品為第I 類，9 號樣品為第Ⅱ類。

圖3 五味子聚類譜系圖

2.8.2 共有模式建立 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”處理軟件，選取第I類13 批推薦品建立共有模式。

2.8.3 五味子樣品相似度計算 以建立的共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，計算各批藥材與共有模式間的相似度，結(jié)果見表3。

表3 14批五味子相似度分析結(jié)果

若樣品與共有模式間的相似度在0.90 以上，則為推薦藥材。若樣品與共有模式間的相似度在0.90以下則為非推薦藥材。實驗結(jié)果表明，9 號產(chǎn)地五味子為非推薦藥材，其他產(chǎn)地五味子均為推薦藥材。

3 討論

3.1 色譜柱選擇

本文對三種不同的色譜柱（Luna C18、Elite-Hpersil ODS、Diamonsil C18）進行了研究，Luna C18 色譜柱分離效果最佳。

3.2 檢測波長選擇

考察了218、220、240、254 和280 nm 波長下的色譜圖。結(jié)果表明，在木脂素最大吸收波長220 nm處色譜響應(yīng)最佳。

3.3 流動相選擇

分別考察甲醇-水、乙腈-水流動相系統(tǒng)。結(jié)果顯示，乙腈-水組成的體系能將所有組分基線分離。

3.4 提取條件選擇

本研究對提取方法、提取溶劑、提取時間和溶劑量對提取效果的影響進行了研究。比較回流提取和超聲提取兩種方法，結(jié)果表明，超聲提取具有提取效率高、方便、耗時短等優(yōu)點，因此，選擇了超聲提取方式?？疾煲哉和椤⒙确?、無水乙醇、乙醇-水（75∶25）、乙醇-水（95∶5）和甲醇為提取溶劑，其中乙醇-水（75∶25）、乙醇-水（95∶5）和甲醇的提取效率較高。為了方便起見，選擇甲醇為提取溶劑?？疾焯崛r間：10、20、30、40、50 和60 min。考察溶劑倍量：20、30、40、60 和80 倍。結(jié)果表明，在其他條件不變的情況下，提取時間大于20 min 或溶劑倍量大于30 的組分變化不顯著。因此，提取時間選擇20 min，提取溶劑倍量大于30。

3.5 小結(jié)

本研究采用HPLC 法建立五味子藥材的指紋圖譜。選擇13 個響應(yīng)較高且分離度較好的木脂素類成分作為共有特征峰，建立共有模式，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”處理軟件評價藥材質(zhì)量，結(jié)果顯示，除9 號產(chǎn)地藥材外均為推薦品，本研究思路為五味子中藥材的質(zhì)量控制提供了方法學(xué)上的參考，可用于判斷和鑒別五味子藥材的質(zhì)量。