新疆哈薩克族食管鱗癌差異表達mRNA的篩選

林怡秀，向 輝，李 陽，邵生輝，張 健，鄭 勇，陳衛(wèi)剛

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，2018年世界衛(wèi)生組織的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球食管癌新增病例57.2萬例，新增死亡病例50.9萬例[1]。我國是食管癌發(fā)病率最高的國家之一[2]，新疆是我國食管癌的高發(fā)區(qū)[3]。食管癌早期無明顯癥狀，其診斷和治療多在晚期，此時癌細胞已轉(zhuǎn)移至全身，治療生存率低，然而其發(fā)生機制并不明確，需要進一步探索。研究顯示[4-5],mRNA的差異表達與腫瘤診斷、發(fā)生、發(fā)展及判斷預(yù)后密切相關(guān)。該研究選取哈薩克族食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者作為研究對象，利用基因芯片對哈薩克族ESCC患者組織中的mRNA進行全面分析，篩選差異表達的mRNA并探討其在ESCC發(fā)生發(fā)展中的作用，進一步完善ESCC基因表達譜，為后續(xù)尋找哈薩克族ESCC更有價值的生物標志物提供可能性。

1 材料與方法

1.1 材料取新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兵團內(nèi)鏡中心經(jīng)內(nèi)鏡及病理診斷確診的哈薩克族ESCC確診患者手術(shù)所得癌組織及癌旁正常組織(距癌組織>5 cm)各5例，其中男2例，女3例，年齡47～85(60.80±11.17)歲。所有患者均未合并其他嚴重疾病，未接受放化療，所有組織都為中分化鱗癌，TNM分期為T2N1M0，均由2名以上高級病理學(xué)家獨立診斷。每個組織樣本均轉(zhuǎn)移到液氮中，24 h后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，微陣列實驗在北京博奧公司完成。另收集新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2009年9月—2019年10月病理科存檔的23例哈薩克族ESCC患者手術(shù)切除的癌組織標本，其中20例患者術(shù)中取得距離癌組織>5 cm的癌旁組織，病理切片證實沒有癌變。男15例，女8例。年齡48～77(62.39 ± 8.16) 歲。本方案由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有標本由患者或家屬授權(quán)。

1.2 方法

1.2.1RNA提取與全基因組mRNA分析 使用Trizol 試劑(Life,USA)按照制造商協(xié)議從組織中提取總RNA。用紫外分光光度計測定總RNA的濃度和純度，制備了OD260/OD280值在1.8～2.0之間的RNA用于微陣列分析。采用甲醛變性凝膠電泳法檢測總RNA的質(zhì)量，當28S ∶18S核糖體RNA≥1 ∶1時，可用于基因芯片分析實驗。采用Agilent人類長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)芯片V4.0(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)檢測樣品中的mRNA,使用晶芯生物芯片通用標記試劑盒(CapitalBio，北京)對所有mRNA進行熒光標記，并進行芯片雜交及數(shù)據(jù)分析。

1.2.2RNA序列數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析 利用Agilent Feature Extraction (v10.7) 軟件對雜交圖片進行分析并提取相關(guān)數(shù)據(jù)。Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析，篩選差異基因[差異倍數(shù)(FC)≥2.0，且P≤0.01]。使用R軟件(3.6.1)對數(shù)據(jù)進行分析和圖形化展示，pheatmap包繪制聚類熱圖，ggpubr、 ggthemes 繪制火山圖。對這些mRNA在metascape網(wǎng)站進行GO分析和KEGG分析。用 Fisher′s 精確檢驗對 GO term 和 KEGG pathway 進行分類，P<0.01表示GO term或KEGG pathway具有統(tǒng)計學(xué)意義。利用STRING網(wǎng)站構(gòu)建篩選的mRNA PPI互作圖，將互作圖導(dǎo)入cytoscape軟件，使用Cytohubba插件尋找其前25位的核心基因。

1.2.3免疫組化驗證芯片結(jié)果 免疫組化檢測PLAUR相關(guān)蛋白。取23例癌組織與20例癌旁組織石蠟標本，5 μm厚度連續(xù)切片，后于60 ℃烤箱烤片(>2 h)，二甲苯中脫蠟3次(5 min/次)，梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗3次。切片放置于塑料染色架。取配置好的EDTA緩沖液于塑料缸中，微波爐高火預(yù)熱3 min至沸騰。切片放入沸騰修復(fù)液，同時將裝入切片修復(fù)盒放入高壓鍋，待噴氣閥開始噴氣計時8 min，結(jié)束排氣。取出切片，將切片在自來水浸洗3次。然后放入3%過氧化氫溶液，37 ℃孵育10 min，自來水浸洗3次，PBS洗3次，每次5 min(后同)，去除PBS后滴加一抗，然后置于4 ℃冰箱過夜；次日取出，在37 ℃下恢復(fù)溫度，PBS沖洗3次后去除PBS，每張切片滴加生物素標記二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次后去除PBS。接下來繼續(xù)顯色操作，滴加DAB顯色試劑，顯微鏡下觀察顯色，3～5 min后(出現(xiàn)棕色本底)終止顯色，自來水沖洗，給予蘇木精復(fù)染1 min，酸酒精5 s后自來水沖洗反藍。最后進行脫水透明并用中性樹膠進行封片。

1.2.4結(jié)果判定 陽性結(jié)果判定陽性結(jié)果，判定參考相關(guān)文獻[6]，胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃褐色顆粒為陽性結(jié)果。PLAUR陽性表達水平根據(jù)染色強度(3分為棕褐色、2分為棕黃色、1分為淡黃色、0 分為無著色)與陽性細胞數(shù)百分比(隨機選取的5個高倍視野下，陽性細胞率<10%為1分， 10%～50%為2分，>50%為3分)共同確定，二者的乘積>3分為陽性表達，所有免疫組化切片均由2名以上高級病理學(xué)家雙盲獨立觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理Agilent GeneSpring軟件對芯片數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析，篩選差異基因[差異倍數(shù)(FC)≥2.0，且P≤0.01]。對篩選mRNA在metascape網(wǎng)站進行GO分析和KEGG分析。Fisher′s 精確檢驗對 GO term 和 KEGG pathway 進行分類，P<0.01表示 GO term 或 KEGG pathway 有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，運用χ2檢驗分析癌組織與癌旁組織PLAUR蛋白表達。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哈薩克族ESCC差異表達mRNA

2.1.1差異表達mRNA火山圖 依據(jù)ESCC組和癌旁正常對照組的信號值作差異表達mRNA火山圖，紅色為上調(diào)mRNA，藍色為下調(diào)mRNA，并標出差異表達倍數(shù)前10位的mRNA (圖1)。圖1橫坐標顯示ESCC與其癌旁正常組織比較下log2轉(zhuǎn)換后的改變值，縱坐標顯示著由t檢驗計算出來的log10轉(zhuǎn)換后的P值。其中垂直線與水平線分別代表差異表達2.0倍上下和P值為0.05。

圖1 ESCC差異表達的mRNA的火山圖

2.1.2差異表達mRNA聚類分析 Pheatmap包分析出癌組織與癌旁正常組織中mRNA不同的表達水平，由聚類分析圖展示。圖2中紅色部分為上調(diào)mRNA，藍色部分為下調(diào)mRNA。圖2A為哈薩克族ESCC差異表達上調(diào)mRNA聚類分析，圖2B為哈薩克族ESCC差異表達下調(diào)mRNA聚類分析。最終篩s選出哈薩克族差異表達的mRNA 1 764個(差異倍數(shù)≥2且P<0.01)。其中上調(diào)的mRNA 378個，下調(diào)的mRNA 1 368個。差異表達倍數(shù)上調(diào)前15位的mRNA列在表1，差異表達倍數(shù)下調(diào)前15位的mRNA列在表2。

圖2 ESCC差異表達mRNA聚類分析

表1 哈薩克ESCC組織中差異表達上調(diào)前15位的mRNA

表2 哈薩克ESCC組織中差異表達下調(diào)前15位的mRNA

2.2 差異表達的哈薩克族mRNA的富集通路分析為了進一步了解不同表達的mRNA相關(guān)功能，本研究利用metascape對最終獲得的哈薩克族差異表達的mRNA進行了GO分析和KEGG分析。GO富集分析結(jié)果表明，差異表達上調(diào)的mRNA(圖3A)與細胞外基質(zhì)組織、超分子纖維組織、細胞黏附調(diào)節(jié)、骨骼系統(tǒng)發(fā)育、細胞連接組織等生物過程相關(guān)，差異表達下調(diào)的mRNA(圖3B)與髓系白細胞介導(dǎo)免疫、蛋白質(zhì)定位于膜、脂質(zhì)生物合成過程、蛋白質(zhì)靶向、體液水平調(diào)節(jié)、肌動蛋白細胞骨架組織、水解酶活性負調(diào)節(jié)、神經(jīng)酰胺代謝過程、去磷酸化、脂質(zhì)定位等生物過程相關(guān)。KEGG結(jié)果表明，差異表達上調(diào)的mRNA(圖4A)與ECM受體相互作用、癌癥中的蛋白多糖、癌癥中的途徑、蛋白質(zhì)消化和吸收、TNF信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)、MAPK信號通路、松弛素信號通路、細胞衰老、癌癥轉(zhuǎn)錄調(diào)控、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性等通路相關(guān)，差異表達下調(diào)的mRNA(圖4B)與黏蛋白型o-聚糖生物合成、內(nèi)吞作用、β-氧化作用、緊密連接、晝夜節(jié)律、PPAR信號通路、黏附分子連接等通路相關(guān)。

圖3 ESCC差異表達mRNA的GO富集通路

圖4 ESCC差異表達的mRNA的KEGG富集通路

2.3 哈薩克ESCC差異表達mRNA的核心基因?qū)⒑Y選的差異mRNA利用STRING網(wǎng)站做出其PPI互作圖，將互作圖導(dǎo)入Cytoscape，利用cytohubba插件找到哈薩克族ESCC中差異表達的mRNAs中排名前25位的核心基因(圖5),這些基因有MMP1、MMP2、PLAUR、PTEN等。

圖5 哈薩克族ESCC差異表達的mRNA的核心基因

2.4 ESCC組織、癌旁組織中PLAUR相關(guān)蛋白表達情況比較挑選核心基因中的PLAUR進行免疫組化驗證。與癌旁組織比較，癌組織中PLAUR蛋白陽性表達率明顯升高(P<0.05)，結(jié)果與芯片分析一致(圖6，表3)。

圖6 食管癌與癌旁組織中PLAUR的表達 SP×100

表3 癌組織、癌旁組織中PLAUR相關(guān)蛋白表達情況比較[n(%)]

3 討論

基因芯片技術(shù)可以一次性對組織中成千上萬個基因的表達進行檢測，基因芯片具有高通量、高靈敏度和自動快速等優(yōu)點[7]，在現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外多種腫瘤及癌前疾病的診療和預(yù)后研究，如胃癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌等[8]。隨著此項技術(shù)的發(fā)展，其在食管癌中的應(yīng)用也對闡明食管癌發(fā)病機制以及對食管癌診療和判斷預(yù)后起到巨大作用[9]。在Liu et al[10]的研究中，發(fā)現(xiàn)ESCA中有145個lncRNA、112個miRNA和2 000個蛋白編碼的mRNA差異表達，它們與細胞周期、凋亡和cGMP-PKG信號通路相關(guān);本課題組前期利用基因芯片發(fā)現(xiàn)在新疆哈薩克族ESCC中有23個microRNA差異表達[11]。

mRNA的差異表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷及判斷預(yù)后密切相關(guān)。在食管癌中，MMP-7、MMP-10和TIMP-1等mRNA表達增加與臨床病理特征相關(guān)[4]。Zhang et al[5]認為VEGF、HER-2、EGFR 在新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族ESCC患者中的表達水平有差異，且與ESCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與病理分期關(guān)系密切。此次，本研究將哈薩克族ESCC與癌旁正常組織差異表達mRNA進行芯片篩選，并對其中的差異表達的mRNA進行了生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)差異表達的mRNA參與了多種通路。相較于其他食管癌基因篩選的研究，本研究針對新疆高發(fā)病率地區(qū)的人群，對其進行全基因譜的篩選，分析更加全面，結(jié)果也更加有針對性。

將mRNA篩選結(jié)果與 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中的其他ESCC與癌旁差異表達的芯片結(jié)果比較，本研究篩選出的差異表達倍數(shù)高的上調(diào)基因中CYP24A1、DNAH17、CCNA1、DNAH17、PI15、PRAME均未見高表達，數(shù)據(jù)庫中其差異表達倍數(shù)均小于兩倍；下調(diào)基因中CRISP3、CRISP2、HPGD、CAPN14、HPGD差異表達倍數(shù)也小于兩倍。其中，PI15暫未見在食管癌中有報道。故認為新疆哈薩克族ESCC差異表達基因存在一定不同，有進一步研究的價值。

本研究進一步分析篩選了mRNA的核心基因，發(fā)現(xiàn)其中的PLAUR暫未見在哈薩克族ESCC中有相關(guān)研究。PLAUR是尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator，uPA) 的受體，識別細胞膜上的纖溶酶,與uPA結(jié)合,從而參與細胞外基質(zhì)降解，影響腫瘤細胞的增殖、遷移[11]。腫瘤細胞分泌uPA促使成纖維細胞轉(zhuǎn)化為ICAF，并通過PLAUR/AKT/NF-κB通路，增加白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的表達和分泌，從而促進食管癌的增殖和遷移[12],在ESCC中，IL-8直接與CXCR1/2結(jié)合促進ESCC的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。 PLAUR增高如何促進IL-8分泌間的關(guān)系仍需進一步研究。對23例哈薩克族ESCC及其20例對應(yīng)癌旁正常組織進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)PLAUR在哈薩克族ESCC組織中高表達。它可能成為一個哈薩克族ESCC診斷、預(yù)后的新的標志物。后續(xù)實驗中，可對PLAUR在哈薩克族ESCC的表達進行進一步研究，進一步了解PLAUR與哈薩克族ESCC發(fā)生機制、臨床表現(xiàn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分期及生存率等的關(guān)系。

本研究仍有并未涉及的方向，如等位基因的研究，一些基因在ESCC發(fā)展機制仍需進一步討論。本研究提示了后續(xù)的試驗方向，如對差異倍數(shù)較大的基因進行進一步生物學(xué)功能鑒定。影響ESCC發(fā)生發(fā)展的因素仍有很多，仍要在今后的研究中不斷探索。

綜上所述，本研究利用基因芯片技術(shù)基于人類全基因譜篩選了新疆哈薩克族ESCC差異表達基因，完善了新疆哈薩克族ESCC基因譜，提示了若干可能在ESCC的診治及判斷預(yù)后方面有價值的生物標志。