circFAT1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲力的影響

徐至珺，王 炯，解明然，顏 宇，張 倩，周文勤

肺癌已成為我國(guó)發(fā)病率和死亡率位居首位的惡性腫瘤，其中，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是其主要病理學(xué)類型，約占80%以上[1]，由于該腫瘤早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，患者總體預(yù)后較差[2]。近年來(lái)，隨著靶向藥物治療技術(shù)的推廣應(yīng)用，為攻克肺癌提供了新的契機(jī)[3]。因此，積極尋找NSCLC發(fā)生、進(jìn)展中相關(guān)敏感基因，對(duì)NSCLC治療意義重大。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)作為廣泛存在于真核生物體內(nèi)的一類帶有封閉共價(jià)環(huán)的非編碼RNA，可穩(wěn)定的存在于生物體，不易被RNA酶降解，且具有組織表達(dá)相對(duì)特異的特點(diǎn)，在調(diào)控機(jī)體發(fā)育、代謝及多種疾病發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[4]，近來(lái)發(fā)現(xiàn)，circRNA參與了惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及多藥耐藥等過(guò)程[5]。circFAT1作為一種circRNA，已被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中呈高表達(dá)[6]，參與了骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程[7]。但其與NSCLC相關(guān)性鮮有報(bào)道。該研究分析NSCLC組織中circFAT1表達(dá)，并利用小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)沉默人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中circFAT1表達(dá)，評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一般資料 選取2018年3月—2020年9月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除治療的NSCLC患者107例，其中，男65例，女42例，年齡35～74(55.85±11.37)歲；病理學(xué)類型：鱗狀細(xì)胞癌38例，腺癌69例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期50例；分化程度：低分化43例，中高分化64例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。術(shù)中留取NSCLC組織及距離腫瘤邊緣>5 cm的正常癌旁組織，迅速置于液氮中，-70 ℃保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 術(shù)前未行任何治療；② 術(shù)后病理學(xué)檢查確診為NSCLC。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 肺部嚴(yán)重感染者；② 繼發(fā)性肺癌及其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；③ 心肝腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；④ 臨床資料不全者。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均行知情同意。

1.1.2主要試劑與設(shè)備 Trizol總RNA提取試劑和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，circFAT1及內(nèi)參引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，UV1800紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海奧析科學(xué)儀器有限公司，人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青-鏈霉素和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，CCK-8試劑購(gòu)自天津邁基生物科技有限公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Coring公司，基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，Q5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1RT-qPCR檢測(cè)NSCLC和癌旁組織中circFAT1表達(dá) 取NSCLC和癌旁組織，剪碎、超聲勻漿，用Trizol總RNA提取試劑提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用Q5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀按擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明對(duì)引物擴(kuò)增，序列：circFAT1：上游5′-AACAGAAGAGAACTGGGGCG-3′，下游5′-GATCAGGGTGCCAATGGTGA-3′；GAPDH：上游5′-GATCAGGGTGCCAATGGTGA-3′，下游5′-TTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，連續(xù)38個(gè)循環(huán)，使用2-ΔΔCt法獲得circFAT1相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含1%青-鏈霉素)對(duì)A549細(xì)胞培養(yǎng)，條件：5% CO2、37 ℃。待細(xì)胞密度在70%以上時(shí)，胰酶消化，接種于6孔板，每孔2.5×106個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞融合度在80%以上時(shí)，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-circFAT1(si-circFAT1組)、無(wú)關(guān)序列(si-control組)，另外設(shè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白組(blank組)。各組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3RT-qPCR術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中circFAT1表達(dá)量 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，滴加細(xì)胞裂解液，其余步驟同“1.2.1”項(xiàng)下方法。

1.2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 各組在轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞，接種在96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中分別于培養(yǎng)0、24、48、72和96 h時(shí)，向各孔加入CCK-8試劑10 μl，恒溫培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀取450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度(optical density,OD)值。

1.2.5Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲情況 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，胰酶消化，用無(wú)血清培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞重懸，密度調(diào)整為2.5×105個(gè)/ml，取細(xì)胞懸液200 μl加到Transwell小室上室，下室則加入正常培養(yǎng)液600 μl，用培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄上室培養(yǎng)液，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，PBS再次沖洗，0.5%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)染色細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)作為遷移細(xì)胞數(shù)。在檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況時(shí)，將基質(zhì)膠用培養(yǎng)液稀釋后對(duì)Transwell小室進(jìn)行包被，過(guò)夜風(fēng)干，其余步驟同檢測(cè)細(xì)胞遷移。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC和癌旁組織中circFAT1表達(dá)量NSCLC組織中circFAT1相對(duì)表達(dá)量為(2.47±0.27)，高于癌旁組織(1.02±0.15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=48.959，P<0.001)。

2.2 circFAT1在不同病理指標(biāo)NSCLC組織中表達(dá)比較circFAT1在不同性別、年齡、病理學(xué)類型和腫瘤直徑的NSCLC組織中相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中circFAT1相對(duì)表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 circFAT1在不同病理指標(biāo)NSCLC組織中表達(dá)比較

2.3 細(xì)胞中circFAT1表達(dá)量與si-control組和blank組比較，si-circFAT1組細(xì)胞中circFAT1相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=138.245，P<0.001)，見圖1。

圖1 三組細(xì)胞中circFAT1的相對(duì)表達(dá)量

2.4 沉默A549細(xì)胞中circFAT1表達(dá)對(duì)增殖活性的影響與si-control組和blank組比較，si-circFAT1組細(xì)胞24、48、72和96 h時(shí)OD值均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示沉默circFAT1表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖活性。見圖2。

圖2 沉默A549細(xì)胞中circFAT1表達(dá)對(duì)增殖活性的影響

2.5 沉默A549細(xì)胞中circFAT1表達(dá)對(duì)遷移和侵襲能力的影響與si-control組和blank組比較，si-circFAT1組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示沉默circFAT1表達(dá)可抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲能力。見表2，圖3、4。

表2 三組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)，

圖3 Transwell法檢測(cè)沉默A549細(xì)胞中circFAT1表達(dá)對(duì)遷移能力的影響 結(jié)晶紫染色×100

圖4 Transwell法檢測(cè)沉默A549細(xì)胞中circFAT1表達(dá)對(duì)侵襲能力的影響 結(jié)晶紫染色×100

3 討論

研究[8]發(fā)現(xiàn)，高侵襲性和易轉(zhuǎn)移是NSCLC細(xì)胞的主要特征，且是導(dǎo)致患者死亡的重要因素。因此，有必要針對(duì)NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制開展研究，以指導(dǎo)臨床診療。circRNA是一類具有圓形結(jié)構(gòu)且可穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)的非編碼RNA，參與調(diào)控了小RNA的吸附、轉(zhuǎn)錄和剪切，同時(shí)在核糖體RNA處理及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用中發(fā)揮重要作用[9]。目前，其在惡性腫瘤中的作用開始受到重視。circFAT1作為一種circRNA，研究[10]發(fā)現(xiàn)，其可作為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。陳靖 等[11]報(bào)道，結(jié)直腸癌組織中circFAT1高表達(dá)且參與了癌細(xì)胞遷移和侵襲。亦有研究[12]發(fā)現(xiàn)，circFAT1促進(jìn)了原發(fā)性肝癌進(jìn)展。本研究顯示，NSCLC組織中circFAT1相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，提示circFAT1可能參與了腫瘤發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中circFAT1相對(duì)表達(dá)量較TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯升高，進(jìn)一步說(shuō)明隨著NSCLC進(jìn)展，circFAT1表達(dá)水平升高，提示circFAT1可能發(fā)揮癌基因功能參與了該腫瘤進(jìn)展。

為進(jìn)一步觀察circFAT1在NSCLC發(fā)生、進(jìn)展中的作用，本研究采用siRNA技術(shù)沉默A549細(xì)胞中circFAT1基因表達(dá)，結(jié)果顯示，與si-control組和blank組比較，si-circFAT1組細(xì)胞中circFAT1相對(duì)表達(dá)量明顯降低，表明成功構(gòu)建circFAT1低表達(dá)的細(xì)胞。有研究[6]報(bào)道，circFAT1可影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和糖酵解。Liu et al[13]報(bào)道，circFAT1參與了骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。亦有研究[14]指出，circFAT1可通過(guò)miR-873/ZEB1軸促進(jìn)甲狀腺癌增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，與si-control組和blank組比較，si-circFAT1組細(xì)胞24、48、72和96 h時(shí)OD值均降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少，表明沉默circFAT1可抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，提示circFAT1可能參與了A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過(guò)程，