索拉非尼對人RKO結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響

劉蒙蒙，倪謙枝，李晶晶，謝 東，陳天偉，高振軍，黃繼英，莊一心

結(jié)腸癌是全球第三大常見腫瘤，隨著居民生活水平的提高及飲食習(xí)慣的改變，其國內(nèi)發(fā)病率排在惡性腫瘤和致死因素的第四位，且正逐步攀升[1]。目前治療結(jié)腸癌的手段主要為手術(shù)切除、放化療、中醫(yī)治療和靶向治療。手術(shù)和放化療對進(jìn)展期的結(jié)腸癌治療效果不理想，而靶向治療逐漸成為治療結(jié)腸癌的熱點(diǎn)[2]。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，其主要通過受體酪氨酸激酶抑制腫瘤生長和血管生成，是晚期肝細(xì)胞癌患者為數(shù)不多的全身治療方案[3-4]。研究[5]表明索拉非尼可通過PI3K/AKT/mTOR信號通，抑制肝癌細(xì)胞的增殖。該研究探究索拉非尼對人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的增殖抑制作用及其可能作用機(jī)制，為將來臨床采用索拉非尼治療結(jié)腸癌提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，DMEM及胎牛血清FBS購自美國Thermo Fisher公司，凋亡檢測試劑盒購自美國BD Pharmingen公司，caspase-3、caspase-8、PARP和GADPH一抗抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，索拉非尼片購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1MTT增殖檢測 將人腸癌RKO細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)后消化、傳代，96孔板中每孔中加入1×104個/ml人腸癌RKO細(xì)胞懸濁液200 μl。貼壁后，更換完全培養(yǎng)基，添加不同濃度(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L)索拉非尼，對照組為二甲基亞砜處理。培養(yǎng)48 h 后，MTT法測定490 nm吸光度值。取索拉非尼的半數(shù)抑制濃度(the half inhibition of concentration，IC50)組為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2細(xì)胞克隆形成 針對上述對照組及實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞，于6孔板中每孔中加入1 500個人腸癌RKO細(xì)胞，培養(yǎng)10 d后，棄去上清液，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色15 min。

1.2.3流式檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期 針對實(shí)驗(yàn)組及對照組，用胰蛋白酶法收獲細(xì)胞。在FITC-Annexin V和碘化丙啶雙重染色后，使用FITC-Annexin V凋亡檢測試劑盒，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。使用cycle TEST PLUS DNA試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行碘化丙啶染色后，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，并通過FACScan軟件進(jìn)行分析。

1.2.4Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8和PARP表達(dá) 使用含有蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，BCA蛋白分析試劑盒對提取的總蛋白濃度進(jìn)行定量，10% SDS-PAGE凝膠分離等量的總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后，將膜與對應(yīng)的一抗抗體(caspase-3、caspase-8和PARP)在4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶結(jié)合山羊抗兔二抗在室溫下以1 ∶5 000的稀釋度作用1 h，并且使用Pierce ECL Western印跡底物檢測蛋白質(zhì)信號。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度索拉非尼對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖的影響MTT檢測RKO細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示索拉非尼對RKO細(xì)胞具有抑制作用，并呈濃度依賴的關(guān)系(圖1A)。索拉非尼對RKO細(xì)胞株作用的IC50為10.0 μmol/L。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，索拉非尼(10.0 μmol/L)對細(xì)胞增殖具有抑制作用(P<0.001，圖1B)。

圖1 不同濃度索拉非尼對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖的影響

2.2 索拉非尼對結(jié)腸癌細(xì)胞RKO凋亡的影響通過Annexin V-FITC/PI 法測定兩組凋亡率，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為(32.53±6.64)%，對照組凋亡率為(4.47±2.09)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖2 索拉非尼對結(jié)腸癌細(xì)胞RKO凋亡的影響

2.3 索拉非尼對結(jié)腸癌細(xì)胞RKO周期的影響PI法檢測兩組細(xì)胞周期，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組RKO細(xì)胞處于G1期的比例為(56.92±2.25)%，G2期比例為(14.94±5.01)%，S期比例為(28.14±3.04)%；對照組處于G1期細(xì)胞的比例為(24.53±1.70)%，G2期比例為(31.70±2.88)%，S期比例為(43.77±1.19)%；RKO的三個細(xì)胞時期比例均有變化(P<0.01，圖3)。

圖3 索拉非尼對結(jié)腸癌細(xì)胞RKO周期的影響

2.4 索拉非尼對結(jié)腸癌細(xì)胞RKO凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組凋亡關(guān)鍵蛋白酶caspase-3和caspase-8表達(dá)水平高于對照組，并且caspase-3激活指示蛋白PARP的表達(dá)水平同樣高于對照組(P<0.05，圖4)。

圖4 索拉非尼對結(jié)腸癌細(xì)胞RKO凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

結(jié)腸癌是病死率最高的三大消化系統(tǒng)腫瘤之一，確診病例中約50%～60%的腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后很差[6-7]?；煴徽J(rèn)為是結(jié)腸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但化療的局限性不容忽視，如選擇性低、在腫瘤組織中濃度不足、全身毒性等[8]。所以挖掘腫瘤有效治療靶標(biāo)具有重要的臨床指導(dǎo)價值。

索拉非尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，是美國食品藥品監(jiān)督管理局于2007年批準(zhǔn)的首個治療肝癌的一線全身治療藥物。索拉非尼具有多種作用部位，抑制VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、PDGFR-β、RAF家族激酶[9]。在具有里程碑意義的臨床Ⅲ期試驗(yàn)中，針對602例肝癌患者，與安慰劑比較，索拉非尼提高了中位總生存期(10.7個月vs7.9個月，P<0.001)[10]。作為一種多功能抑制劑，索拉非尼具有抑制腫瘤生長、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、血管生成和下調(diào)機(jī)制的潛力，可保護(hù)腫瘤不受凋亡的影響。

Liu et al[11]證實(shí)索拉非尼通過ATP-AMPK-mTOR-SREBP1信號通路阻斷SCD1介導(dǎo)的單不飽和脂肪酸的合成，從而殺死肝癌細(xì)胞。Gounder et al[12]針對87例進(jìn)行性、癥狀性或復(fù)發(fā)性硬纖維瘤患者，接受索拉非尼(400 mg/片，每天一次)或安慰劑，在平均27.2個月的隨訪中，索拉非尼組2年無進(jìn)展生存率為81%(95%CI為69%～96%)，安慰劑組為36%(95%CI為22%～57%)(進(jìn)展或死亡危險比為0.13，95%CI為0.05～0.31，P<0.001)，研究表明在進(jìn)行性、復(fù)發(fā)性或有癥狀的硬纖維瘤患者中，索拉非尼延長無進(jìn)展生存期并誘導(dǎo)持久反應(yīng)。Corrado et al[13]證實(shí)索拉非尼在體內(nèi)外對甲狀腺癌細(xì)胞具有抗增殖和抗血管生成作用。所以，本研究嘗試探索索拉非尼對人RKO腸癌細(xì)胞的抑制作用及其可能機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，索拉非尼對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞有增殖抑制和促凋亡作用，而且隨著索拉非尼濃度增加，對RKO細(xì)胞的抑制效果越明顯。同時發(fā)現(xiàn)，索拉非尼主要是通過增加caspase-8、caspase-3以及PARP的表達(dá)來促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。在腫瘤中，常見調(diào)節(jié)細(xì)胞周期機(jī)制和頻率元件的錯亂反映出異常的細(xì)胞周期對腫瘤惡性增殖表型的重要性[14]。長期以來，靶向細(xì)胞周期被視為一個潛在的治療的靶點(diǎn)，但由于早期細(xì)胞周期抑制劑特異性較低，限制了這種靶向抑制的發(fā)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼對腸癌細(xì)胞RKO的細(xì)胞周期有影響，索拉非尼處理之后，G1期細(xì)胞增多，而S期和G2期細(xì)胞減少，說明索拉非尼可以將RKO細(xì)胞阻斷在DNA合成前期，從而抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖有抑制作用，而且和使用的濃度呈正相關(guān)。索拉非尼通過促進(jìn)RKO細(xì)胞的凋亡來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)索拉非尼會影響RKO細(xì)胞的細(xì)胞周期。這為將來用索拉非尼治療結(jié)腸癌提供一定的參考價值。