咖啡酸對(duì)阿霉素心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

唐 煒，葉鵬林，劉 坤，朱楊杰，高惡斌

阿霉素(adriamycin，ADM)是一種蒽環(huán)類(lèi)抗生素，抗癌效果顯著，是目前最常用最重要的抗癌藥物之一[1]。然而，長(zhǎng)期給藥會(huì)對(duì)心臟、骨髓、腎臟造成不可逆毒性作用，嚴(yán)重阻礙其臨床應(yīng)用[2]。ADM可在體內(nèi)形成多種氧自由基，導(dǎo)致心肌細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，破壞細(xì)胞膜引起鈣超載，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞凋亡。因此，深入探討ADM誘導(dǎo)心肌毒性的內(nèi)在機(jī)制，并探究有效的心肌保護(hù)劑，對(duì)解決ADM誘導(dǎo)致毒問(wèn)題十分必要。咖啡酸(caffeic acid，CA)是酚酸類(lèi)化合物，廣泛存在于植物體內(nèi)，具有抗炎、抗菌、抗病毒等藥理作用。最近有研究[3]表明，CA對(duì)心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化等具有保護(hù)作用。但其對(duì)ADM心肌損傷的保護(hù)作用及具體機(jī)制尚不清楚。因此，該研究通過(guò)建立ADM誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷模型，探討CA對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為大鼠H9c2細(xì)胞系，江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃含5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.1.2藥品與試劑 CA(純度≥99%)購(gòu)自美國(guó)Acros Organics公司，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，ADM、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性檢測(cè)試劑盒和活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，NF-κB和β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 用DMEM+10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)H92c心肌細(xì)胞，細(xì)胞密度至80%左右時(shí)吸取多余培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，0.25%胰酶消化3 min后加入培養(yǎng)基中和，輕輕吹打至細(xì)胞脫落，按照1 ∶3傳代數(shù)次至細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H92c心肌細(xì)胞，按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組平行設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，分別加入相關(guān)藥物干預(yù)。首先進(jìn)行ADM濃度的篩選。H9c2心肌細(xì)胞分別加入0(對(duì)照組)、1.0、2.0、3.0、4.0 μmol/L ADM(使DMSO 最終濃度<0.1%)作用12 h，選擇接近其半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值的濃度進(jìn)行后續(xù)研究。其次進(jìn)行給藥模型的建立。在最適ADM濃度處理心肌細(xì)胞后，分別用0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L CA處理24 h，置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。設(shè)置ADM處理組為模型組(ADM組)、不同濃度CA干預(yù)組為治療組(ADM+CA組)及空白對(duì)照組(Control組)。

在處理后，每孔加入終濃度為5 mg/ml的MTT 10 μl，培養(yǎng)4 h后添加100 μl DMSO溶液，在450 nm處測(cè)定吸光值，每組重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率和IC50。

1.2.2細(xì)胞內(nèi)LDH水平檢測(cè) 收集Control組、ADM組和ADM+CA組培養(yǎng)24 h后的H9c2細(xì)胞，按照LDH活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清LDH含量，并根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算LDH活力變化。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè) 分組同上所述，收集各組細(xì)胞，加入10 μmol/L DCF-DA，孵育20 min后用熒光顯微鏡觀察ROS熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度的高低反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

1.2.4線粒體膜電位檢測(cè) 分組同上所述，在各組樣本中加入JC-1使其達(dá)到所需終濃度，避光，37 ℃孵育15 min，再用PBS洗去多余的染料后測(cè)定。

1.2.5線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性檢測(cè) 分組同上所述，收集各組細(xì)胞后用PBS懸浮細(xì)胞并破碎，離心取上清液，測(cè)定吸光度。操作步驟嚴(yán)格按照線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。

1.2.6Western blot法檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)情況 分組同上所述，提取各組細(xì)胞總蛋白。取50 μg蛋白樣本進(jìn)行Western blot檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參，用Multi-analyst image成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，并用Image J軟件定量。

2 結(jié)果

2.1 ADM誘導(dǎo)H9c2心肌損傷模型的建立與Control組比較，1.0、2.0、3.0和4.0 μmol/L ADM處理都會(huì)引起H9c2心肌細(xì)胞存活率的顯著下降，并且隨處理劑量增加細(xì)胞活力顯著降低，具有劑量依賴效應(yīng)。其中1.0 、2.0 μmol/L ADM處理與Control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3.0、4.0 μmol/L ADM處理與Control組比較差異更顯著(P<0.01)。ADM對(duì)心肌細(xì)胞的損傷與濃度呈正相關(guān)，當(dāng)ADM濃度為2.0 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷量約在50%，為藥物IC50，因此選擇2.0 μmol/L ADM處理作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度ADM處理細(xì)胞后的MTT細(xì)胞活力統(tǒng)計(jì)圖

2.2 CA對(duì)大鼠心肌組織損傷的保護(hù)作用不同濃度的CA對(duì)ADM誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用，0.5 μmol/L CA即對(duì)ADM誘導(dǎo)的心肌損傷呈現(xiàn)保護(hù)效應(yīng)(P<0.05),并且心肌細(xì)胞的存活率隨CA濃度增加顯著提高，具有劑量依賴性。當(dāng)CA濃度為4.0 μmol/L時(shí)對(duì)H9c2保護(hù)效果最佳。因此，取2.0 μmol/L ADM和4.0 μmol/L CA作為治療組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度CA保護(hù)損傷細(xì)胞后的MTT細(xì)胞活力統(tǒng)計(jì)圖

HE染色結(jié)果顯示，Control組心肌細(xì)胞排列整齊致密、細(xì)胞形態(tài)正常。與Control組比較，ADM組心肌呈片狀壞死、空泡性變性、心肌纖維增多、心肌細(xì)胞片狀溶解，心肌松散，細(xì)胞間隙增寬。而，ADM+CA組中心肌纖維化、變性等較輕，肌纖維變性減少。見(jiàn)圖3。

圖3 CA對(duì)H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3 CA對(duì)ADM損傷的心肌細(xì)胞內(nèi)LDH水平的影響與Control組比較，ADM組中的LDH水平顯著提高；而加入CA后治療組中LDH水平明顯降低，表明CA可以抑制細(xì)胞內(nèi)LDH在損傷后的顯著提高。見(jiàn)圖4。

圖4 各組心肌細(xì)胞上清的LDH活力水平統(tǒng)計(jì)圖

2.4 CA對(duì)ADM損傷的心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，通過(guò)熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱反映ROS水平的高低。Control組內(nèi)平均熒光強(qiáng)度為(63.110±2.223)，而ADM組中的平均熒光強(qiáng)度為(132.098±7.117)，與Con-trol組比較明顯升高。而ADM+CA組細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度為(103.582±4.992)，較ADM組顯著下降；利用單因子方差分析結(jié)果顯示，各組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1，F(xiàn)=223.9)。結(jié)果表明，CA可以抑制ADM誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中ROS激增過(guò)程。見(jiàn)圖5。

圖5 激光共聚焦顯微鏡下各組心肌細(xì)胞ROS水平 ×400

2.5 CA對(duì)ADM損傷的心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響同樣利用熒光強(qiáng)弱反映線粒體膜電位的水平。與Control組比較，ADM組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度明顯下降，由(207.876±5.072)降為(90.918±4.649)；而ADM+CA組中紅色熒光強(qiáng)度為(105.200±3.501)。one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，各組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)=1 025)。結(jié)果表明，ADM能夠引發(fā)心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降，而加入CA則可以改善該過(guò)程。見(jiàn)圖6。

圖6 熒光顯微鏡下各組細(xì)胞線粒體膜電位水平 ×200

2.6 CA對(duì)ADM損傷的心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的影響與Control組比較，ADM組心肌細(xì)胞H9c2中線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05)；而與ADM組比較，ADM+CA組線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性則有了明顯升高(P<0.05)。表明ADM造成了心肌細(xì)胞中線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的降低，而加入CA則能改善這種損傷。見(jiàn)圖7。

圖7 各組心肌細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性水平

2.7 CA對(duì)ADM損傷的心肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路影響Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，ADM組p65蛋白的表達(dá)水平明顯增高，而加入CA的治療組中，p65蛋白的表達(dá)量則有所降低。見(jiàn)圖8。

圖8 Western blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中NF-κB p65蛋白表達(dá)量

3 討論

ADM是一種高效的蒽醌類(lèi)抗腫瘤藥物，可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制過(guò)程起到抗腫瘤作用。然而長(zhǎng)期使用ADM會(huì)造成心肌細(xì)胞不可逆損傷[4]，這嚴(yán)重限制了ADM抗腫瘤的臨床應(yīng)用。目前，ADM導(dǎo)致心臟毒性的機(jī)制尚不明確[5]，因此探尋ADM對(duì)心肌細(xì)胞的損傷機(jī)制，并開(kāi)發(fā)相應(yīng)的保護(hù)藥物具有重要的臨床意義。

研究表明[6]，ADM會(huì)誘發(fā)心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，本研究中，ADM誘導(dǎo)的損傷ADM組中ROS水平高于Control組，與前人研究結(jié)果吻合[7]。此外，心肌細(xì)胞含有較多的線粒體，線粒體內(nèi)膜含有大量的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶，以維持電位穩(wěn)定，釋放細(xì)胞正常生命活動(dòng)所需要的能量。有報(bào)道稱ADM對(duì)線粒體膜具有很強(qiáng)的親和性，可能是通過(guò)還原性輔酶Ⅱ或內(nèi)皮型一氧化氮合酶轉(zhuǎn)化為半醌ADM，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為C7自由基，破壞細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷[8-9]。本研究結(jié)果顯示，ADM會(huì)引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高、心肌細(xì)胞線粒體膜電位和線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性降低，表明ADM是通過(guò)改變膜電位、影響線粒體膜的穩(wěn)定性損傷心肌細(xì)胞。

NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，與免疫和炎癥相關(guān)。當(dāng)機(jī)體受到損傷及ROS增多時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與特異性位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控靶基因表達(dá)。NF-κB參與了ADM誘導(dǎo)心肌損傷的過(guò)程，能引起NF-κB p65蛋白表達(dá)增多[10-11]。因此NF-κB p65很有可能是ADM造成心肌損傷通路中的重要環(huán)節(jié)。本研究中檢測(cè)了ADM組、Control組與ADM+CA組細(xì)胞中NF-κB p65的表達(dá)量，結(jié)果表明CA能夠抑制ADM引發(fā)的NF-κB p65蛋白表達(dá)量增高過(guò)程，CA可能通過(guò)NF-κB p65通路發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。然而本研究缺少對(duì)NF-κB 通路中其他蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，尚未進(jìn)一步深入闡明CA在NF-κB通路中的保護(hù)機(jī)制。

CA是一類(lèi)天然酚類(lèi)化合物，具有強(qiáng)抗氧化性。CA有多種藥理作用，如抗菌、抗毒、抗炎、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗HIV、抗氧化等[3]。研究[12-13]表明，CA對(duì)淋巴細(xì)胞、腦、腎、肝等組織的氧化損傷也有一定的保護(hù)作用。本研究中，CA治療組中心肌細(xì)胞中ROS水平較ADM組顯著降低，表明CA可能通過(guò)清除H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS發(fā)揮了保護(hù)作用。此外，本研究顯示，CA可以提高ADM誘導(dǎo)心肌損傷后線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性，能夠穩(wěn)定線粒體膜電位，這表明除清除ROS之外，CA還有可能通過(guò)保護(hù)線粒體膜穩(wěn)定性發(fā)揮其保護(hù)作用。這與CA能降低心肌細(xì)胞線粒體脂質(zhì)的濃度，保護(hù)線粒體，在異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞梗死模型中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制相似[14]。