FASTKD4在骨肉瘤組織中表達(dá)及對骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張香路，王 震，常 俊，馬廣文，黃 斐

骨肉瘤是惡性程度最高的腫瘤之一，好發(fā)于兒童和青少年，目前以手術(shù)治療和化學(xué)治療為主，復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后往往不佳[1-3]。過去三十年來，骨肉瘤患者的預(yù)后并未改變，凸顯了臨床對新研究、新方法的需求[4]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)基因、多個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控異常，尋找有效的靶基因治療骨肉瘤可能會(huì)有效的改善其預(yù)后[5-6]。

Fas活化激酶結(jié)構(gòu)域蛋白4 (fast kinase domain-containing protein4,FASTKD4)也被稱為細(xì)胞周期進(jìn)程修復(fù)蛋白2(cell cycle progression restoration protein 2,CPR2)和轉(zhuǎn)化生長因子β調(diào)節(jié)蛋白4(transforming growth factor beta regulator 4 ,TBRG4)，是一種線粒體蛋白，廣泛分布在整個(gè)線粒體基質(zhì)中,能夠調(diào)節(jié)線粒體中RNA的表達(dá)[7]。FASTKD4在之前的研究報(bào)道中較少，2014年Wolf et al[8]首次通過MitoString測試發(fā)現(xiàn)FASKTD4是一種新的線粒體蛋白。隨后2017年Boehm et al[7]證實(shí)FASKTD4對線粒體能量代謝有著重要的調(diào)節(jié)作用，這也是首次證實(shí)FASTKD4可以通過影響線粒體，從而進(jìn)一步干預(yù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是FASTKD4對骨肉瘤是否有影響，目前尚無研究。為了明確FASTKD4在骨肉瘤中的作用，該研究擬檢測FASTKD4在骨肉瘤組織和骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，并通過小干擾RNA沉默骨肉瘤細(xì)胞中的FASTKD4，觀察其對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的采集收集2017—2019年安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院30例骨肉瘤患者的股骨遠(yuǎn)端骨肉瘤標(biāo)本。通過免疫組化和qPCR檢測骨肉瘤組織和癌旁組織中FASTKD4的表達(dá)。

1.2 細(xì)胞系骨腫瘤細(xì)胞系Saos-2、HOS和成骨細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。使用含10%胎牛血清、100 U/ml 青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，并在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 免疫組化將骨肉瘤組織和癌旁組織切片進(jìn)行福爾馬林固定和石蠟包埋后，切片(5 μm)進(jìn)行免疫組化。用抗FASTKD4的一抗(兔抗，濃度1 ∶1 000,CST)4 ℃孵育過夜，重復(fù)洗滌后再用二抗孵育30 min。最后切片用DAPI染色，并用蘇木精復(fù)染。

1.4 shFASTKD4慢病毒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染為了有效阻止FASTKD4的表達(dá)，本研究構(gòu)建了靶向干擾FASTKD4的小干擾RNA small interfering RNA (shRNA) 慢病毒載體。方法如下：靶向干擾FASTKD4的shRNA的干擾序列為GTTCTTCAGCCTGGTACAT。被用于對照組的，加擾(scrambled) shRNA(shCtrl)的干擾序列為TTCTCCGAACGTGTCACGT。相關(guān)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA oligo (oligonucleotides ) 被合成，并被植入pGV115-GFP慢病毒載體(上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)。通過這個(gè)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)來構(gòu)建shFASTKD4和scrambled shRNA。為了進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，用6孔板培養(yǎng)Saos-2細(xì)胞，并根據(jù)MOI加入shFASTKD4和shCtrl慢病毒。轉(zhuǎn)染后 72 h左右，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染120 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行qPCR和Western blot檢測敲減效率。

1.4.1RNA提取和qPCR檢測 按照說明書的方法，使用Trizol 裂解腫瘤組織、癌旁組織和腫瘤細(xì)胞并收集RNA。每個(gè)樣本取2.0 μg RNA在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和oligo dT作用下合成cDNA。使用SYBR Green Premix Ex Taq試劑進(jìn)行qPCP實(shí)驗(yàn)，并在ABI 7500 QPCR儀進(jìn)行檢測。使用GAPDH做為內(nèi)參。FASTKD4的正向引物為5′- CAGCTCACCTGGTAAAGCGAT-3′，反向引物為5′-GGGAGTAGATGCTCGTTCCTTC-3′ (194 bp)；GAPDH的正向引物為 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，反向引物為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′(121 bp)， 參考GAPDH的表達(dá)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化FASTKD4的表達(dá)結(jié)果。用 DNA 相對拷貝數(shù)和相對表達(dá)量(2-ΔΔCt) 表示FASTKD4基因的相對表達(dá)量。

1.4.2Western blot檢測 為了檢測Saos-2細(xì)胞中FASTKD4的敲減效率，采用Western blot的方法檢測細(xì)胞中FASTKD4蛋白的表達(dá)水平。Saos-2細(xì)胞被轉(zhuǎn)染shFASTKD4和shCtrl慢病毒后培養(yǎng)72 h，然后用PBS洗滌，并用預(yù)冷的lysis buffer進(jìn)行裂解。細(xì)胞裂解液在4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，并用BCA試劑盒檢測蛋白水平。40 mg的蛋白被8%～12%的SDS-PAGE溶解后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，然后用TBTS配制的5%的脫脂牛奶封閉PDVF膜1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBTS液洗滌3次后，二抗孵育室溫孵育1 h，使用ECL法顯影。

1.4.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 通過高內(nèi)涵篩選的方法檢測shFASTKD4和shCtrl慢病毒轉(zhuǎn)染的Saos-2細(xì)胞的增殖。將處于對數(shù)生長期并轉(zhuǎn)染shFASTKD4和shCtrl慢病毒的Saos-2細(xì)胞按2×103個(gè)/孔種植到96孔板中。在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 d，且每天用高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀CellomicsArrayScan VTI (Thermo) 檢測讀板一次并定量細(xì)胞數(shù)量,連續(xù)檢測讀板4 d，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

除了高內(nèi)涵篩選的方法，本研究還采用CCK-8試劑盒來檢測shFASTKD4和shCtrl慢病毒轉(zhuǎn)染的Saos-2細(xì)胞的增殖。按2×103個(gè)/孔將細(xì)胞種植到96孔板中，連續(xù)培養(yǎng)4 d。每天在每孔加入10 μl CCK-8溶液37 ℃孵育4 h，酶標(biāo)儀ELx800 Absorbance Microplate Reader (BioTek Instruments,Winooski,VT,USA) 選擇490 nm檢測OD值，連續(xù)檢測4 d。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將處于對數(shù)生長期的shFASTKD4和shCtrl慢病毒轉(zhuǎn)染的Saos-2細(xì)胞與基質(zhì)膠混勻后，1×103個(gè)/孔將細(xì)胞種植到24孔板中，使用含有20 ng/ml EGF、10 ng/ml b-FGF、5 μg/ml胰島素和0.4% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)12 d，并在1、6、12 d時(shí)進(jìn)行熒光拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。并用熒光圖像分析軟件(PhenoRipper)測量克隆球直徑。

1.4.5細(xì)胞凋亡檢測 采用Annexin V-APC 凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。將shFASTKD4和shCtrl慢病毒轉(zhuǎn)染的Saos-2細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，并用PBS洗滌，用細(xì)胞染色液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，每100 μl細(xì)胞懸液加入 10 μl Annexin V-APC 染色，室溫避光 15 min。使用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 FASTKD4在骨肉瘤組織和骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)分析采用免疫組化和qPCR的方法檢測FASTKD4在骨腫瘤組織中的表達(dá)情況，結(jié)果見圖1A、B，F(xiàn)ASTKD4在骨肉瘤組織中呈高表達(dá)，而在癌旁組織中呈低表達(dá)，qPCR的結(jié)果也表明FASTKD4 mRNA在骨肉瘤組織中表達(dá)水平要高于癌旁組織，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C，t=10.86，P<0.05)。同時(shí)FASTKD4 mRNA在骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2中表達(dá)最高，與HOS及成骨細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1D，t=19.72，P<0.05)。因此選擇Saos-2骨肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 FASTKD4在骨肉瘤及癌旁組織中的表達(dá)

2.2 慢病毒介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染骨腫瘤細(xì)胞抑制FASTKD4的表達(dá)為了評估慢病毒的敲減效率，Saos-2細(xì)胞被分別轉(zhuǎn)染shFASTKD4和shCtrl慢病毒載體。如圖2A～D所示，轉(zhuǎn)染72 h后，shFASTKD4和shCtrl組中超過80%的細(xì)胞GFP表達(dá)陽性。隨后，本研究用qPCR和Western blot的方法驗(yàn)證FASTKD4的表達(dá)情況。如圖2E所示，與shCtrl組比較,shFASTKD4組中FASTKD4 mRNA的表達(dá)下降61%，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.45,P<0.05)。Western blot結(jié)果(圖2F)與qPCR一致，同樣顯示shFASTKD4組FASTKD4的蛋白表達(dá)水平低于shCtrl組。因此慢病毒介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染有效的抑制了FASTKD4 mRNA和蛋白的表達(dá)。

圖2 FASTKD4轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中表達(dá)水平

2.3 FASTKD4敲除抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖增殖是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特性，本研究通過高內(nèi)涵篩選和CCK-8實(shí)驗(yàn)分析了FASTKD4敲除后對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響。在高內(nèi)涵檢測實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染shFASTKD4和shCtrl的Saos-2細(xì)胞，被培養(yǎng)在96孔板中，并且通過CellomicsArrayScan VTI 連續(xù)觀察細(xì)胞4 d生長情況(圖3A)。如圖3B所示，與shCtrl組比較，shFASTKD4組中細(xì)胞增殖能力受到抑制。培養(yǎng)到第4天時(shí)，shCtrl組細(xì)胞增殖3.05倍，而shFASTKD4組中細(xì)胞增殖1.73倍，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.68,P<0.05)。課題組同時(shí)還用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測了FASTKD4敲除對骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響。如圖3C所示，CCK8結(jié)果同樣顯示了shFASTKD4組中細(xì)胞增殖能力低于shCtrl組,兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.72,P<0.05)。

圖3 FASTKD4沉默后骨肉瘤細(xì)胞增殖能力檢測

2.4 FASTKD4敲除抑制骨肉瘤細(xì)胞克隆能力本研究通過基質(zhì)膠成球?qū)嶒?yàn)測定模擬體內(nèi)三維情況下腫瘤細(xì)胞的克隆和成瘤能力。腫瘤細(xì)胞被接種在24孔板中，并在1、6、12 d時(shí)進(jìn)行熒光拍照(圖4A)。如圖4B所示，在培養(yǎng)12 d shFASTKD4組中腫瘤細(xì)胞形成的克隆球直徑小于shCtrl組，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.87,P<0.05)，表明FASTKD4敲除后抑制了腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力。

圖4 FASTKD4沉默后骨肉瘤細(xì)胞克隆形成能力檢測

2.5 FASTKD4敲除誘導(dǎo)骨腫瘤細(xì)胞凋亡為了分析FASTKD4敲除對骨腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-APC 單染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡(圖5A)。檢測結(jié)果顯示shCtrl組和shFASTKD4組細(xì)胞凋亡百分比分別為(2.36±0.11)%和(8.41±1.31)%(圖5B)，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.97,P<0.05)。這表明FASTKD4敲除可以誘導(dǎo)骨腫瘤細(xì)胞的凋亡。

圖5 FASTKD4沉默后骨肉瘤細(xì)胞凋亡檢測

2.6 FASTKD4的敲除使骨肉瘤細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路失活為了進(jìn)一步探討FASTKD4在骨肉瘤中發(fā)生的分子機(jī)制，本課題組研究了PI3K/AKT信號通路，這是骨肉瘤中最常見的異常信號通路之一。通過Western blot檢測FASTKD4敲低對Saos-2細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT表達(dá)的影響。如圖6A、B所示，與shCtrl組比較，敲除FASTKD4下調(diào)了shFASTKD4組中p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.42、24.98,均P<0.05)，但在總的PI3K和AKT水平上未觀察到明顯差異。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明，敲除FASTKD4使PI3K/AKT信號通路失活。

圖6 Western blot檢測Saos-2細(xì)胞中FASTKD4沉默對PI3K/AKT信號通路的影響

3 討論

隨著分子靶向治療技術(shù)的發(fā)展以及對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究的深入，目前骨肉瘤的分子靶向治療是臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)[9]。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的快速增殖和凋亡有關(guān)。作為與代謝和凋亡兩大癌癥標(biāo)志相關(guān)的細(xì)胞器，線粒體正受到越來越多的關(guān)注。研究[7]表明腫瘤中抑癌基因的突變和癌基因的表達(dá)是通過作用線粒體來執(zhí)行逃避凋亡和改變細(xì)胞代謝，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長。FASTKD4是線粒體基因中的一種，被認(rèn)為是細(xì)胞周期相關(guān)基因，受到IL-2和JAK3的負(fù)調(diào)控。雖然FASKTD4與骨肉瘤之間的直接關(guān)系，目前尚無報(bào)道，但FASKTD4也已經(jīng)被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，有研究[10]表明FASKTD4在肺癌組織中高表達(dá)，敲除FASKTD4后可以下調(diào)CAV1和RRM2,上調(diào)DDIT3來抑制肺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡。還有研究[11]發(fā)現(xiàn)FASKTD4在鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮著重要作用，下調(diào)FASKTD4后，可以下調(diào)CAV-1并引起氧自由基的蓄積，同時(shí)抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。這也證實(shí)FASKTD4可以通過影響線粒體，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。因此本課題組推測FASTKD4可能也參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究的結(jié)果表明在FASTKD4在骨腫瘤組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選擇了FASTKD4在骨腫瘤細(xì)胞中表達(dá)最高的Saos-2作為研究對象，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA沉默F(xiàn)ASTKD4的表達(dá)，qPCR和Western blot的結(jié)果證實(shí)了小干擾RNA沉默F(xiàn)ASTKD4的有效性。FASTKD4沉默后的Saos-2細(xì)胞增殖的數(shù)量和克隆球直徑均小于對照組，而凋亡細(xì)胞的百分比高于對照組。這些結(jié)果表明FASTKD4沉默可以有效的抑制Saos-2細(xì)胞的增殖和克隆能力的形成，并促進(jìn)Saos-2細(xì)胞的凋亡。本研究認(rèn)為FASTKD4促進(jìn)Saos-2細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致細(xì)胞增殖受限的一個(gè)重要原因，這也與之前FASTKD4在其他腫瘤研究中的報(bào)道一致。

本研究評估了敲除FASTKD4對骨肉瘤細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路的影響。結(jié)果顯示，敲除FASTKD4可抑制p-PI3K和p-AKT的表達(dá)水平，但在總的PI3K和AKT水平上未觀察到明顯差異，因此本研究推測FASTKD4基因表達(dá)下調(diào)是通過PI3K-AKT信號通路抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制FASTKD4表達(dá)，這可能成為改善骨肉瘤預(yù)后的一個(gè)可行方法。然而，F(xiàn)ASTKD4在骨肉瘤進(jìn)展中的潛在抑瘤機(jī)制涉及多個(gè)分子水平，需要進(jìn)一步研究。下一步本課題組將進(jìn)一步研究FASTKD4在骨肉瘤其他細(xì)胞中作用的分子機(jī)制，為臨床治療提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。