大鼠Sesn2/AMPK信號(hào)介導(dǎo)肝臟的自噬在間歇低氧和復(fù)氧致糖代謝異常中的作用

陳新潔，劉宏飛，田稼薈，靳歡歡，呂云輝，韓 芳，魏翠英

2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)患者中阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)的患病率高達(dá)23.8%～53.0% ，它們之間存在明顯關(guān)聯(lián)[1]。OSAHS的主要特征是慢性間歇低氧，這會(huì)激活氧化應(yīng)激，釋放炎癥因子，影響糖脂代謝，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。上述均依賴于單磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的活化，AMPK在調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)和代謝應(yīng)激方面有重要價(jià)值[2]，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是AMPK下游蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖， AMPK-mTOR信號(hào)通路是重要的信號(hào)調(diào)節(jié)途徑，在自噬中起重要作用[3]。Sesn2是調(diào)控通路的關(guān)鍵因素，通過激活A(yù)MPK來抑制細(xì)胞內(nèi)mTOR的激活，從而改善糖代謝疾病，如葡萄糖耐量減低、胰島素抵抗[4]。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道Sesn2在間歇低氧中的調(diào)控機(jī)制。因此研究Sesn2/AMPK信號(hào)對(duì)間歇低氧致胰島素抵抗的相關(guān)機(jī)制是非常有意義的。該研究擬建立間歇低氧大鼠模型，對(duì)照觀察間歇低氧和復(fù)氧下，Sesn2、AMPK、p-AMPK、mTOR、LC3在肝臟組織中的表達(dá)水平，探討Sesn2/AMPK信號(hào)介導(dǎo)的自噬在間歇低氧和復(fù)氧致糖代謝異常中的作用，為OSAHS引起糖代謝紊亂的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料5周齡雄性清潔SD大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g，由包頭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠胰島素ELISA試劑盒購自華美生物工程有限公司，抗AMPK、p-AMPK、Sesn2抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體購自美國Affinity公司，HyPure TMMolecular Biology Grade Water購自美國HyClone公司，Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit，2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)，RNA提取液均購于武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組 按隨機(jī)數(shù)字表法分組：即對(duì)照組(NC)、慢性間歇低氧組(CIH)。① 基線階段：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)選取兩組8只大鼠并取樣，即A組(基線NC組)、B組(基線 CIH 組)，剩余大鼠進(jìn)入間歇低氧階段。② 間歇低氧階段：CIH組大鼠除了在低氧艙內(nèi)不予飲食，其余時(shí)間均正常飲食，而NC組大鼠置于常氧下正常飼養(yǎng)，共持續(xù)8周。每組隨機(jī)選取8只大鼠并取樣，即C組(NC組常氧8周末)、D組(CIH組間歇低氧8周末)。③ 復(fù)氧階段：CIH組剩余大鼠進(jìn)行復(fù)氧干預(yù)處理，NC組繼續(xù)常氧下正常飼養(yǎng)，持續(xù)4周后取樣，即E組(NC 組常氧12周末)、F組 (CIH組復(fù)氧4周末)。

1.2.2OSAHS模型的建立 自制全自動(dòng)間歇低氧艙，制備間歇低氧大鼠模型。氧艙分兩部分，上部為操作平臺(tái)，下部為間歇低氧艙，采用封閉式抽屜設(shè)計(jì)，以便于抓取實(shí)驗(yàn)大鼠及更換墊料。實(shí)驗(yàn)溫度維持在22～23 ℃，濕度調(diào)節(jié)至42%～45%。以120 s為1個(gè)循環(huán)，通入氮?dú)?5 s，使艙內(nèi)氧濃度由21%降至7%～8%，維持10 s，通入氧氣55 s，氧濃度逐漸上升至21%，維持30 s，使大鼠發(fā)生間歇低氧事件為30次/h，模擬人類重度OSAHS事件。艙內(nèi)氧濃度由便攜式測(cè)氧儀實(shí)時(shí)監(jiān)控，艙底鋪有干燥墊料及生石灰來吸收水分及CO2。在間歇低氧艙內(nèi)部氧濃度達(dá)到最低點(diǎn)及恢復(fù)至最高點(diǎn)時(shí)抽取SD大鼠頸動(dòng)脈血，進(jìn)行血?dú)夥治觯瑱z測(cè)最低點(diǎn)、最高點(diǎn)時(shí)的動(dòng)脈血氧飽和度(arterial oxygen saturation，SaO2)。驗(yàn)證造模成功后，CIH組大鼠放入間歇低氧艙內(nèi)，暴露時(shí)間為每日9:00—17:00(共8 h)，共8周。

1.3 取材大鼠處死前禁食12 h，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，內(nèi)眥靜脈法取血，留取肝臟組織備用。

1.4 生化檢測(cè)迅速用毛細(xì)玻璃管吸取微量血液滴于血糖儀試紙上測(cè)定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)；采用ELISA法檢測(cè)空腹胰島素(fasting insulin,FINS)水平；采用血清穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model insulin resistance index,HOMA-IR)=(FBG×FINS)/22.5。

1.5 Western blot法檢測(cè)Sesn2、AMPK、p-AMPK蛋白的表達(dá)水平從-80 ℃冰箱中取肝組織，冰浴下制成10%肝勻漿液。提取總蛋白，BCA測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取相同量蛋白用于10% SDS-PAGE凝膠分離、濃縮蛋白，并轉(zhuǎn)移至NC膜，BSA室溫封閉60 min。TBST溶液洗滌后分別加入稀釋度為1 ∶1 000的一抗，4 ℃搖床孵育過夜，然后再次洗膜，加入二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育1 h，然后進(jìn)行清洗、顯色和圖片采集。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)LC3、mTOR mRNA的表達(dá)用RNA抽提試劑盒提取肝臟組織總RNA，經(jīng)過RNA純度、完整性鑒定后，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，LC3、mTOR，以GAPDH作為內(nèi)部參照。GAPDH上游和下游引物分別是5′-CTGGAGAAACCTGCCAAG TATG-3′和5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′；LC3上游和下游引物分別是5′-ATCAACATTCTGACGG AGCGG-3′和5′-ATCTGCCTGCTTGTCCTGGTT-3′；mTOR的上游和下游引物分別為5′-GGGTGAC GAGCTCTTTGTCA-3′和5′-AGGAGCCCTAACACTCG GAT-3′。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性10 min，隨后95 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài)NC組大鼠精神狀態(tài)良好、呼吸平穩(wěn)、皮毛光亮、活動(dòng)自如、反應(yīng)靈敏；CIH組大鼠在進(jìn)入間歇低氧艙后首先出現(xiàn)煩躁不安、四處竄動(dòng)，10 min后出現(xiàn)活動(dòng)遲緩、呼吸急促、口唇及四肢發(fā)紺等缺氧現(xiàn)象，隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行逐漸表現(xiàn)為皮毛灰暗、精神萎靡等。

2.2 間歇低氧引起FBG、FINS、HOMA-IR水平升高基線時(shí)，A、B組的FBG、FINS、HOMA-IR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；間歇低氧8周后，與C組比較，D組FBG、FINS、HOMA-IR升高(t=-2.32、-5.64、-5.51,均P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；復(fù)氧干預(yù)4周后，E、F組的上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR水平比較

2.3 Sesn2、AMPK、p-AMPK蛋白水平的表達(dá)基線時(shí)，A、B組Sesn2、p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；間歇低氧8周時(shí)，與C組比較，D組Sesn2、p-AMPK/AMPK表達(dá)水平降低[(0.55±0.16)vs(0.89±0.07)、(0.42±0.11)vs(0.85±0.24)，均P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；復(fù)氧干預(yù)4周后，與E組比較，F(xiàn)組Sesn2、p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與D組比較，F(xiàn)組Sesn2、p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)水平增加[(0.83±0.09)vs(0.55±0.16)、(0.78±0.12)vs(0.42±0.11),均P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、2。

圖1 各組肝臟Sesn2/β-actin比值

圖2 各組肝臟p-AMPK/AMPK比值

2.4 自噬蛋白LC3、mTOR的mRNA水平基線時(shí)，A組和B組LC3、mTOR mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；間歇低氧8周時(shí)，與C組比較，D組LC3 mRNA表達(dá)水平下降(t=9.77,P<0.05)，mTOR mRNA表達(dá)水平升高(t=-21.87,P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；復(fù)氧干預(yù)4周后，與E組比較，F(xiàn)組LC3、 mTOR mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與D組比較，F(xiàn)組LC3 mRNA表達(dá)水平升高(t=6.66,P<0.05)，mTOR mRNA表達(dá)水平下降(t=6.03,P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組大鼠LC3、mTOR mRNA水平比較

3 討論

臨床上常見OSAHS與T2DM的并存現(xiàn)象，導(dǎo)致患者心腦卒中、猝死風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。胰島素抵抗是T2DM的主要發(fā)病機(jī)制之一，它貫穿T2DM演變的全過程。研究[5]報(bào)道OSAHS及其相關(guān)的全身性間歇低氧是代謝異常(如胰島素抵抗和糖耐量降低)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，具體的作用機(jī)制日益受到人們的重視。由于臨床上無法確定OSAHS與T2DM的因果關(guān)系，因此本研究擬構(gòu)建大鼠間歇低氧模型，模擬人類重度OSAHS事件，深入探討間歇低氧與糖代謝的關(guān)系及可能的機(jī)制。

大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]，間歇低氧可導(dǎo)致血糖和胰島素水平的增高，但很少有研究報(bào)道復(fù)氧是否能夠逆轉(zhuǎn)變這種改變。本研究結(jié)果顯示：在間歇低氧8周后，大鼠FBG、FINS和HOMA-IR水平升高，復(fù)氧干預(yù)4周FBG和FINS水平逐漸下降，恢復(fù)至基線水平。提示：間歇低氧可以導(dǎo)致胰島素抵抗，血糖增高，而復(fù)氧干預(yù)后可以完全逆轉(zhuǎn)這種改變，證明間歇低氧是糖代謝異常的直接原因。

研究[9]表明間歇低氧可通過全身性作用(包括交感神經(jīng)興奮，炎癥或氧化應(yīng)激)以及對(duì)脂肪、肝臟和胰腺組織的直接作用來影響葡萄糖代謝。AMPK是能量感受器，參與細(xì)胞新陳代謝的調(diào)節(jié)，控制凋亡、自噬等生理機(jī)制，mTOR通過合成代謝調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和繁殖，AMPK/mTOR信號(hào)通路不僅是細(xì)胞內(nèi)能量代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中的重要節(jié)點(diǎn)，而且是調(diào)節(jié)自噬的重要上游信號(hào)通路[10]。

目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)探究肝臟中AMPK/mTOR信號(hào)通路在間歇低氧和復(fù)氧的調(diào)控機(jī)制。本研究與Thomas et al[6-7]結(jié)果一致，間歇低氧下大鼠肝臟組織的AMPK蛋白表達(dá)顯著降低，mTOR持續(xù)激活，影響了肝臟的糖代謝，引起FINS、FBG增高，從而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。

Sesns是一種應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，在哺乳類動(dòng)物的表達(dá)有3種(Sesn1～3)，其生物學(xué)功能是mTOR的抑制劑，可促進(jìn)自噬的發(fā)生。Sesn2被認(rèn)為可以減輕各種與年齡相關(guān)的代謝紊亂，包括胰島素抵抗、葡萄糖耐量異常[11]。因此Sesn2是調(diào)控AMPK/mTOR通路的關(guān)鍵因素，可能成為治療糖尿病的新靶點(diǎn)[12]。

本研究表明Sesn2在應(yīng)對(duì)間歇低氧環(huán)境時(shí)，出現(xiàn)低水平表達(dá)，正如Sun et al[11]證明，Sesn2的缺乏會(huì)增加胰島素抵抗和糖尿病的進(jìn)展。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)自噬因子LC3 mRNA表達(dá)顯著下降，正如研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，肝臟的自噬作用可通過mTOR的持續(xù)激活而受到抑制，進(jìn)而使胰島素信號(hào)減弱，誘發(fā)胰島素抵抗。Li et al[15]揭示了Sesn2誘導(dǎo)的自噬通過激活A(yù)MPK信號(hào)來恢復(fù)受損的胰島素信號(hào)，改善胰島素抵抗。同樣，本研究證實(shí)了間歇低氧下調(diào)Sesn2的表達(dá)，通過抑制AMPK通路及下游自噬調(diào)節(jié)，影響機(jī)體能量代謝，引起糖代謝紊亂，導(dǎo)致胰島素抵抗。復(fù)氧干預(yù)后，Sesn2、AMPK蛋白、LC3 mRNA回升，mTOR蛋白回落，再次驗(yàn)證Sesn2/AMPK信號(hào)誘導(dǎo)自噬參與了間歇低氧致胰島素抵抗的機(jī)制。文獻(xiàn)證實(shí)[6，8]，間歇低氧引起大鼠各種組織AMPK的表達(dá)下降或升高。間歇低氧下，AMPK的表達(dá)是否存在組織特異性？未來有條件，進(jìn)一步探索在間歇低氧下，Sesn2/AMPK信號(hào)在胰島素的其他靶器官的表達(dá)情況。

綜上所述，間歇低氧可能通過抑制Sesn2/AMPK信號(hào)及自噬的發(fā)生，導(dǎo)致大鼠FBG、FINS增高，從而介導(dǎo)胰島素抵抗。