膜上G蛋白偶聯(lián)受體在運動影響骨代謝中的作用*

陳祥和 劉 波 陸鵬程 仇 嘯 周香香 曾炘瑜

（揚州大學體育學院，揚州225127）

G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein couple receptors，GPCRs）的7次跨膜特征和晶體結構由2012年諾貝爾化學獎得主Robert J.Lefkowitz 和Brian K.Kobilka 發(fā)現(xiàn)［1］。GPCRs 是含有7 個跨膜α 螺旋的膜上受體，其跨過胞膜磷脂雙分子層并響應胞外信號刺激，進而以G蛋白解離α亞基作為傳導物觸發(fā)細胞內(nèi)部反應，介導正常或紊亂的生理反應［2］。G蛋白是膜內(nèi)胞漿面的外周蛋白，與鳥嘌呤核苷酸結合并具有GTP酶（GTPase）活性，可將GTP水解，生成與膜受體偶聯(lián)的異源三聚體——GDP［3］。細胞膜上GPCRs 可特異地與G 蛋白GTPase 區(qū)域結合，并形成GPCRs、G 蛋白及下游級聯(lián)信號途徑（包括腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C、Ca2+通道、K+通道等）構成的信號轉(zhuǎn)導途徑［4］，進而參與調(diào)控骨代謝、視覺傳輸、心率失常、癌變等。

骨中成骨細胞（osteoblast，OB）和破骨細胞（osteoclast，OC）相互影響、調(diào)控，分別主導骨形成代謝（以下簡稱骨形成）和骨吸收代謝（以下簡稱骨吸收），而GPCRs 可通過影響調(diào)控OB 和/或OC的信號途徑、細胞因子等進而影響骨代謝［3，5］。敲除膜上G 蛋白偶聯(lián)受體48 （G protein couple receptor 48，GPR48）、GPR54 后，小鼠骨中環(huán)磷酸 腺 苷 （cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋 白 激 酶A （protein kinase A，PKA）/Atf4、JNK/AP-1 等信號通路被抑制，導致分化產(chǎn)生的OB 減少但OC 卻增多［6］；而敲除另一受體亞型GPR40 后，OB 分化及骨形成增強且OC 分化被抑制，小鼠骨密度（bone mineral density，BMD）增加［7］。上述研究結果提示，GPCRs 在調(diào)控骨形成和/或骨吸收上扮演重要角色。甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）調(diào)控骨形成的分子機制與膜上G 蛋白及GPCRs 激活密切相關［8］。G 蛋白轉(zhuǎn)導PTH 刺激進而激活靶蛋白β-arrestin/下游多囊蛋白1（polycystin-1，PC-1）/PDZ結合基序轉(zhuǎn)錄共激活因子（transcriptional co-activator with PDZ binding motif，TAZ）途徑，以及Wnt3和Wnt7b信號刺激等來促進骨形成并抑制骨吸收［9-10］。后續(xù)研究關注小G蛋白在骨代謝中的調(diào)控作用，但因有研究發(fā)現(xiàn)G蛋白介導骨代謝是通過其異源三聚體而非小G 蛋白，所以有關其骨代謝調(diào)控作用尚存爭議［3］。這可能與對小G蛋白研究尚不深入且相關研究集中于OB 和OC 分化有關。受限于G 蛋白分子結構單一及亞型數(shù)量少，其調(diào)控骨代謝關注度不高，研究較少。

運動是影響骨代謝的重要手段，而GPCRs（如GPR48等）作為力學刺激敏感蛋白在此過程中具有關鍵調(diào)控作用。目前，生命醫(yī)學領域內(nèi)有關GPCRs 調(diào)控骨代謝的研究較多，但運動通過調(diào)控GPCRs 進而影響骨代謝的研究較少，其作用機制及調(diào)控網(wǎng)絡尚待揭示?；诖?，本文將對GPCRs調(diào)控骨代謝及運動通過影響膜上GPCRs 進而影響骨代謝的相關研究進行綜述并予以展望，以期為骨質(zhì)疏松癥等骨代謝疾病診療提供參考，并為運動醫(yī)學領域內(nèi)骨代謝研究提供一定的理論基礎和新研究靶點。

1 GPCRs在骨代謝中的調(diào)控作用

1.1 GPCRs在骨形成中的調(diào)控作用

GPCRs 可與G 蛋白結合并調(diào)節(jié)其活性，介導cAMP、磷脂酰肌醇等信號途徑［11］。其以單體、異源二聚體或寡聚體形式存在，刺激轉(zhuǎn)導配體單一激活受體、寡聚復合物中相鄰的其他受體來介導下游級聯(lián)反應［12-13］，調(diào)控阿爾茨海默病、高血壓、心血管疾病、帕金森病等，亦可調(diào)控骨代謝［14-15］。OB膜上GPCRs 大量表達，且其信號支架蛋白GPCRs酶相互作用蛋白2 （GPCRs enzyme interaction protein 2，GⅠT2）可將外部刺激傳入胞內(nèi)調(diào)控骨形成代謝［6，16］。GPCRs 種類多，以下將詳細闡述其對骨形成的介導調(diào)控。

1.1.1 GPR40

GPR40 屬于7 次跨膜α 螺旋結構G 蛋白偶聯(lián)孤兒受體，亦稱游離脂肪酸受體1（free fatty acid receptor 1，F(xiàn)FAR1）［17］，由碳鏈長度大于6 的中長鏈飽和及多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）活化［18］。GPR40 不僅分布于胰腺細胞和神經(jīng)細胞，也在OB膜上大量表達［4］。敲除GPR40后，Wnt途徑關鍵因子β連環(huán)素（β-catenin）磷酸化被抑制，進而下調(diào)Runt 相關轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）表達并作用于Sp7的PST序列區(qū)域，調(diào)節(jié)Fgfr2和Fgfr3來抑制OB 分化及骨形成［8］。OB 和脂肪細胞均由骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分化產(chǎn)生，而關鍵因子過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptor γ，PPARγ）受GPR40 調(diào)控，當GPR40 被敲除后會激活PPARγ 表達進而促進BMSCs 向 脂 肪 細 胞 分 化 并 抑 制OB 分 化［19］。GPR40 不僅調(diào)控脂質(zhì)代謝，亦介導機體糖代謝。AMP依賴的蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK），作為介導糖代謝的關鍵蛋白，當抑制GPR40 后其表達下調(diào)，AMP/ATP 比率下降導致其對細胞能量代謝脫敏，內(nèi)皮型一氧化氮合酶-一氧化氮（endothelial nitric oxide synthesis-nitric oxide，eNOS-NO）途徑被抑制后Runx2 和鋅指結構轉(zhuǎn)錄因子（osterix，Osx）去磷酸化不能與骨鈣蛋白啟動子區(qū)的成骨細胞特異性順式作用元件2（osteoblast-specific cisacting element 2，OSE2）結合，抑制骨鈣蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白（cyclindependent kinase inhibitor，CKⅠ） 調(diào) 控 的OB 分化［20］。并且，GPR40 敲除后胰島素分泌下降，胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor 1，ⅠGF-1）B功能區(qū)N端16個氨基酸區(qū)與膜上胰島素樣生長因子1 受 體（insulin-like growth factor 1 receptor，ⅠGF-1R）結合，通過ⅠGF結合蛋白酪氨酸發(fā)出信號激酶受體，抑制Norrin及其調(diào)節(jié)的骨祖細胞增殖和向OB分化［21］。在探究羅格列酮對顱骨OB增殖及分化的影響時，發(fā)現(xiàn)GPR40 活化后磷酸化酪氨酸蛋白磷酸酶（Src-homology domain-2 phosphatase1，SHP-1） 并 抑 制 糖 原 合 成 酶 激 酶3β （glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β），磷酸化SHP-1 促進激活經(jīng)典Wnt 途徑靶基因β-catenin；GSK-3β 被抑制后激活β-catenin，提高其在核內(nèi)水平，促進前成骨細胞向OB分化［22］。調(diào)控OB分化及骨形成的信號途徑呈網(wǎng)狀結構分布，而GPR40作為膜上受體，是眾多信號途徑的“發(fā)起點”，除可介導眾多信號途徑外，對很多關鍵因子如血清骨鈣素N端中分子片段（N-terminal middle molecular fragment of osteocalcin，N-MⅠD）、Ⅰ型膠原羧基端肽β 特殊序列（β-C-terminal telopeptide of type Ⅰcollagen，β-CTx）、T-Ⅰ型膠原氨基端前肽（T-procollagen type ⅠN-terminal propeptide，T-PⅠNP）、Dickkopf相關蛋白1（Dickkopf-related protein-1，DKK-1）和硬化蛋白（selerostin，SOST）等也具有重要調(diào)節(jié)作用，鑒于目前相關研究較少，其詳細調(diào)控機制尚待揭示（圖1，表1）。

1.1.2 GPR48

GPR48（亦稱LGR4）屬于A 家族糖蛋白激素受體，亦稱富含亮氨酸的GPCRs［23］。以往研究中，GPR48 是未發(fā)現(xiàn)其配體的孤兒受體，而近來發(fā)現(xiàn)Rspondins（Rspo）家族蛋白中的Rspo1 與GPR48可通過LGRs家族胞外N端作用并開啟經(jīng)典Wnt信號通路，調(diào)控OB分化及骨形成［24］，但對cAMP及Ca2+途徑不顯著。提示，GPR48可能存在其他配體來激活G 蛋白途徑。研究顯示，RANKL-/-小鼠表型與GPR48-/-小鼠類似，那么GPR48與RANKL可能存在一定關系。后續(xù)研究證實，除核因子κB 受體活化因子（receptor activator for nuclear factorκB，RANK）外，GPR48（LGR4）是核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）的另一膜上受體，能通過胞外域（ECD）與RANK競爭性同RANKL結合，活化GSK-3β 和Gαq 途徑，抑制核因子激活T細胞1（nuclear factor activates T cells 1，NFATc1）表達和活性從而介導OC 分化及骨吸收；LGR4（LGR4 CKO）小鼠顯示OC過度活化（包括OC數(shù)量、表面積和體積增大）和骨質(zhì)破壞增加［25］。這表明，Rspo1 和RANKL 是GPR48 配體，但關于其在骨形成中作用仍需進一步研究。

隨著基因敲除技術發(fā)展，GPR48 調(diào)控骨形成作用引起學者關注，利用CRⅠSPR-Cas9 將其在OB上特異性敲除后發(fā)現(xiàn)，GPR48-/-小鼠和轉(zhuǎn)錄缺失（保留5%轉(zhuǎn)錄活性）小鼠骨組織出現(xiàn)BMD和骨組織形態(tài)結構退化，同時骨生長發(fā)育被阻滯［26-27］。分析其分子機制，GPR48 與GαS 結合后激活cAMP，促進PKA磷酸化并激活cAMP反應單元結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），后者是重要核蛋白，其調(diào)節(jié)啟動子中具有cAMP 反 應 單 元（cAMP-response element，CRE） 的基因轉(zhuǎn)錄， 影響磷酸二酯酶（phosphodiesterase 4，PDE4）和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）表達促進OB 分化及骨形成。經(jīng)典Wnt 途徑是調(diào)控OB 分化的關鍵途徑，GPR48 活化后促進其靶基因β-catenin 磷酸化，入核后與T 細胞因子（T cell factor， TCF）/淋 巴 增 強 結 合 因 子（lymphoid enhancer factor，Lef）形成轉(zhuǎn)錄復合體，調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1（cell cycle protein D1，CyclinD1）、軸抑制因子2（axis inhibitor 2，Axin2）等靶基因表達來調(diào)節(jié)骨形成［28］。并且，Rspondins 通過其Furin 結構域與GPR48 結合可調(diào)控下游Wnt/平面細胞極化（planar cell polarity，PCP）途徑［29］；而敲除GPR48會抑制Wnt/PCP途徑［30］。Luo等［25］發(fā)現(xiàn)GPR48 缺失導致骨長度變小，這與胚胎期骨形成延遲有關，與軟骨成熟和增殖無關；GPR48 通過調(diào)節(jié)OB 分化、增殖及骨形成能力來達成這一功能。綜上發(fā)現(xiàn)，GPR48調(diào)控骨形成由介導的OB分化及骨形成能力增強實現(xiàn)，與軟骨細胞無關。但是，后續(xù)在研究PTHrP、PTH 和PTH/PTHrP 受體調(diào)控軟骨發(fā)育時，發(fā)現(xiàn)GPR48 與PTHrP 作用，將外部刺激信號傳遞到胞內(nèi)引發(fā)級聯(lián)信號反應，促進原代軟骨細胞3H-TdR 進入S-G2/M 期，使得成熟軟骨細胞增殖。并且，二者偶聯(lián)后亦可激活Hedgehog途徑，Smo和Ptch1作為該途徑關鍵跨膜蛋白，通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）/Golgi 分泌途徑進行C 端和N 端修飾，形成脂質(zhì)態(tài)的具有高信號活性的信號分子物質(zhì)，與Nkx3.2 和Sox9 形成自調(diào)節(jié)環(huán)路，調(diào)控軟骨分化與增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog 途徑激活后抑制OC 分化、融核及骨吸收。這表明，GPR48 促進OB 分化同時，亦可通過促進軟骨細胞分化、增殖來促進骨形成，同時也會抑制OC 分化、融核及骨吸收（圖1，表1）。

1.1.3 GPR54

GPR54 是Kiss1 蛋白受體，屬于G 蛋白偶聯(lián)受體視紫紅質(zhì)家族成員［31］。其包含1 197 bp 的開放閱讀框，編碼398 個氨基酸殘基蛋白［32］。Kiss1 基因表達蛋白產(chǎn)物Kisspeptin，其具有一C端區(qū)域，為一個Arg-Phe-NHs 模體，由52 個氨基酸構成，RF-酰胺序列變?yōu)锳rg-Tyr-NH2［33］。GPR54 具有介導能量代謝、性腺功能、腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學功能，有研究證實，GPR54 在OB 膜上大量表達。Kisspeptin 通 過GPR54 誘 導 蛋 白 激 酶C （protein kinase C，PKC）活化和磷酸酶抑制劑MCⅠP-1 表達，激活PKC/Runx2 通路關鍵因子Runx2，促進BMSCs 向OB 分 化［34］，而GPR54 表 達 失 活 后β-catenin 去磷酸化，致使OB 功能紊亂［35］。OB 由BMSCs 分化產(chǎn)生，敲除GPR54 后Runx2、Osx 和C/EBPβ 表達下調(diào)并激活PPARγ，抑制成骨細胞前體細胞向成熟OB分化，導致細胞外基質(zhì)成熟和基質(zhì)礦化紊亂［36］。下丘腦-垂體-性腺（hypothalamuspituitary-gonad，HPG）軸不僅調(diào)控生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能發(fā)揮，并且也可通過“腦-骨”串聯(lián)影響骨代謝。HPG 軸調(diào)控睪酮分泌，下丘腦弓狀核（arcuate nucleus，ARC）和前腹側(cè)腦室周圍核團（anterior ventral periventricular nucleus，AVPV）中的Kisspeptin/GPR54信號通路，可以調(diào)控下丘腦中促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的分泌、釋放，影響性腺激素的分泌， GPR54 表達上調(diào)促進骨鈣素（osteocalcin，OCN）分泌［37］。而OCN的活化形式羧化不全骨鈣素（uncarboxylated osteocalcin，ucOCN） 激 活 磷 脂 酰 肌 醇 3-激 酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PⅠ3K）后，上調(diào)靶基因蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）表達并促進OB對Ⅰ型膠原蛋白、骨橋蛋白等有機質(zhì)分泌，促進骨形成。并且，PⅠ3K激活后Akt磷酸化水平升高， OC 中Bax、 Bcl-2、 Caspase-3、 Cleavedcaspase-3 表達上調(diào)，促進OC 凋亡，降低OC 對骨組織的侵蝕［38］。上述研究顯示，OB 和OC 均是GPR54 靶細胞，通過調(diào)控它們分化及功能發(fā)揮，可促進骨吸收（圖1，表1）。

1.1.4 其他

研究發(fā)現(xiàn)，除上述闡述GPCRs 外，尚有其他GPCRs 可調(diào)控OB 分化及骨形成［39］。與ER 不同，GPR30 作為新發(fā)現(xiàn)的ER，其在骨中OB、OC 等細胞膜上大量表達［40］。當骨中GPR30 活化后，去卵巢大鼠骨轉(zhuǎn)換率提升，BMD和生物力學性能升高，骨流失和骨組織形態(tài)微細結構退化改善［41］。在探究補骨脂素改善骨質(zhì)疏松的研究中，小鼠骨中GPR30 被激活［42］后會活化ERK1/2 信號途徑后并降低ANP 和β-MHC 表達，導致PSMD11 蛋白快速合成，進而介導雌激素調(diào)控MC3T3-E1分化產(chǎn)生的OB 線粒體自噬水平，保護OB 活性［43］。當利用GPR30 特異性激動劑G1 和特異性拮抗劑G15 來調(diào)控GPR30/GPER1 在全身表達時，發(fā)現(xiàn)介導骨形成關 鍵 途 徑（cAMP/PKA/CREB、 MAPK （p38、JNK） 及PⅠ3K/Akt） 均 被 抑 制［44］。 這 表 明，GPR30 與以上途徑存在密切級聯(lián)反應，但有關GPR30介導以上途徑進而調(diào)控OB分化或骨形成的相關研究尚待補充。GPR40和GPR120均是長鏈不飽和脂肪酸受體，將其敲除或轉(zhuǎn)錄缺失后，出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗（insulin resistance，ⅠR）水平升高、大腦中海馬區(qū)去甲腎上腺素水平升高等。而雌激素是治療骨質(zhì)疏松（ssteoporosis，OP）的最直接手段，BMSCs 膜上GPR40 受雌激素影響并調(diào)控OB分化，去卵巢大鼠骨中GPR40表達被抑制；將其敲除后，雌激素改善去卵巢GPR40-/-小鼠骨質(zhì)疏松的作用缺失。這與GPR40 功能缺失后，Wnt/β-catenin 途徑的關鍵因子β-catenin 去磷酸化，進而抑制OB分化及骨形成有關。另外，GPR40是通過Wnt/β-catenin 途徑激活雌激素誘導OB 分化的內(nèi)源性促進劑，該研究首次為GPR40 是通過Wnt/β-catenin 途徑來正向調(diào)節(jié)骨形成提供了直接證據(jù)［45］。當用羅格列酮治療2 型糖尿?。╰ype 2 diabetic mellitus，T2DM）時，發(fā)現(xiàn)羅格列酮抑制OB增殖作用僅通過GPR40來實現(xiàn)，一旦GPR40功能缺失，其下游TLR4/JNK/NF-κB 途徑將被抑制，那么GPR40 生物學作用將缺失［46］。長鏈多不飽和脂肪酸受體GPR120作為近來研究熱點，在探究亞油酸抑制MC3T3-E1向OB分化及其骨形成能力時，發(fā)現(xiàn)亞油酸抑制MC3T3-E1 膜上GPR120 表達，下調(diào)β-arrestin2表達導致調(diào)控OB分化靶基因TAK1去磷酸化［47］（圖1，表1）。隨著骨形成研究逐漸深入，相信更多GPCRs會被研究發(fā)現(xiàn)。

1.2 GPCRs在骨吸收中的調(diào)控作用

OC主導骨吸收，而OC的a3（116 ku）跨膜亞基電質(zhì)子泵突變導致OC分化、融核紊亂和骨吸收異常升高［31］。膜上受體GPCRs 介導的信號途徑或關鍵因子調(diào)控OC分化、融核及骨吸收能力。體外研究中，GPR1 表達上調(diào)后促進環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）與RANKL 胞外結構域的TAAT 啟動子原件作用，激活RANK 及下游NFATc1 等靶基因，促進OC 分化、融核［48］，上調(diào)造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）膜上GPR1受體表達后會抑制chemerin-CMKLR1-PPARγ途徑，進而上調(diào)其靶基因adiponectin 并促進其向OC分化［49］。GPR30作為新型膜雌激素受體，其調(diào)控OC 分化與骨吸收，敲除GPR30 后通過上調(diào)ⅠGF-1表達促進雌性小鼠骨組織生長發(fā)育被顯著抑制［50］。林紫微［51］研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷的抗骨質(zhì)疏松作用機制與膜上GPR30 表達上調(diào)后抑制CTSK、NFATc1、c-Fos、Dc-stamp 等調(diào)控的OC 分化及骨吸收能力密切相關。而作為脂肪酸受體的GPR40，當利用CRⅠSPR-Cas9技術將其在小鼠OC上特異性敲除后，NF-κB信號通路中的κB酶抑制劑（ⅠKKα/β）被抑制且下調(diào)OC 核內(nèi)NFATc1 表達從而抑制OC 分化及其骨吸收能力［52］。其分子機制與GPR40-/-小鼠骨中NF-κB 途徑及其靶基因NFATc1表達上調(diào)密切相關，當NFATc1 表達上調(diào)后促進破骨細胞前體向OC 分化［53］。并且，OC 與OB 之間并非獨立存在，兩者之間借Runx2來相互影響、調(diào)控。將OB 膜上GPR40 特異性敲除后，OB 分化被抑制的同時Runx2 表達下調(diào)，進而激活PⅠ3K/Akt途徑，上調(diào)AP-1、c-myc、c-Src等靶基因表達，促進OC 分化［45］。然而，作為GPCRs 另一關鍵亞型的GPR48，將其全身敲除后骨生長發(fā)育被抑制，后續(xù)發(fā)現(xiàn)RANKL是其配體，可激活RANK及其介導的Gαq-GSK-3β途徑，促進OC 分化及融核［25］（圖2，表2）。

Fig.1 Schematic diagram of the molecular mechanisms of GPCRs regulating bone formation圖1 GPCRs調(diào)控骨形成的分子機制總結示意圖

Table 1 Summary of molecular mechanisms of GPCRs regulating bone formation表1 GPCRs調(diào)控骨形成的分子機制匯總表

GPR54作為GPCRs的關鍵亞型，其缺失后OC封閉圈染色更亮，肌動蛋白環(huán)結構變大［36］。并且，GPR54 介導胞內(nèi)信號途徑（如：磷脂酶C（phospholipase C，PLC） β 異 構 體 的 活化 和磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸（phosphatidylinositol-4,5-diphosphate，PⅠP2））的水解。而PⅠP2被水解成ⅠP3和DAG 兩個第二信使后，引起下游Ca2+動員并作用于花生四烯酸釋放，磷酸化ERK1/2 和p38 MAPK［32］，下調(diào)NFATc1 表達［54］；而p38MAPK 的活化會激活c-Fos途徑及關鍵因子TRAF6表達，促進OC分化［55］。并且，ERK1/2與p38MAPK之間亦相互作用，p38MAPK抑制劑磷酸化ERK1/2，進而抑制OC 分化、融核［56］。而Kiss1 基因編碼的肽類激素Kisspeptin-10（Kp-10）可刺激過表達GPR54 CHO細胞張力絲的形成，而此效應被外酶C3負向調(diào)控，此刺激效應通過激活小G蛋白Rho亞家族來進行調(diào)控。其C端結構域與c-Src SH3 結構域相結合后，抑制RANKL 蛋白表達和激活Kp-10 誘導的c-Src 磷酸化，形成RANK/avp3 復合物基團來激活Syk-Vav3-Rac1 信號通路，調(diào)控OC 分化和骨吸收［57］（圖2，表2）。受限于GPCRs 調(diào)控骨吸收代謝的相關研究較少，導致其相關分析有限且不深入，但確信GPCRs 將是未來生命醫(yī)學領域的研究靶點和熱點。

Fig.2 Schematic diagram of the mechanism of GPCR regulating bone resorption圖2 GPCR調(diào)控骨吸收的分子機制總結示意圖

Table 2 Summary of molecular mechanisms of GPCRs regulating bone resorption表2 GPCRs調(diào)控骨吸收分子機制匯總表

2 GPCRs在運動影響骨代謝中的作用機制

骨以每年約占總骨量10%的速度進行更新，這種以“吸收-構建”為主要特征的骨動態(tài)平衡稱為骨重建［58］。OB 和OC 的偶聯(lián)平衡介導骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，研究證實，運動訓練是改善骨內(nèi)環(huán)境失衡導致代謝紊亂的關鍵因素。8周跑臺訓練使錳超氧化物歧化酶缺乏雜合小鼠骨形成加快，BMD 增加［59］。對比跑臺訓練，震動訓練可顯著上調(diào)大鼠股骨中OPG表達從而預防骨質(zhì)疏松發(fā)生［60］。人體研究亦證實，16 周瑞士球穩(wěn)定運動使得慢性腰痛患者BMD 增加［61］。綜上，適度運動促進骨形成，改善骨代謝。

OB 和OC 膜上GPCRs 對力學刺激敏感，可將運動訓練對骨產(chǎn)生的力學刺激傳入膜內(nèi)［62］。有關GPCRs 調(diào)控運動影響骨代謝的相關研究較少，其中以GPR48 研究為主。敲除GPR48 后，一方面cAMP/PKA/Atf4 信號通路活性被抑制，其靶基因Atf4表達下調(diào)，導致OCN、骨涎蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等表達下調(diào)，降低骨形成［63］，另一方面作為RANKL 受體，GPR48 能通過胞外域（ECD）與RANK 競 爭 性 同RANKL 結 合，活 化GSK-3β 和Gαq 途徑進而抑制OC 分化［64］。在探究運動對T2DM OC 分化的影響時，發(fā)現(xiàn)下坡跑對T2DM 小鼠骨產(chǎn)生的直接作用力可激活骨中GPR48/RANKL通路，抑制RANK及其下游靶基因胞質(zhì)活化T細胞核因 子c2 （nuclear factor of activated T cells c2，NFATc2）和組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）表達， 入核后鞘氨醇磷酸酯（sphingosine 1-phosphate，S1P）失活，抑制破骨細胞前體細胞（osteoclast precursor cells，OCPs）向OC 分化及融核，且其作用效果優(yōu)于游泳產(chǎn)生的間接作用力［65］。破骨細胞抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG）/RANKL/RANK 分子軸可借助中樞因子腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）調(diào)節(jié)下游CN/NFAT和NF-κB途徑，而運動借助OPG/RANKL/RANK分子軸和/或其下游CN/NFAT 和NF-κB 途徑可抑制OC分化及骨吸收［66］。說明，GPR48 介導下游CN/NFAT 和NF-κB 途徑是運動抑制OC 分化及骨吸收的分子機制。并且，該研究還對其分子機制網(wǎng)絡進行了初探，認為TRAF6 介導的PⅠ3K/Akt、JNK/AP-1、p38MAPK、ERK1/2、LPS、CD40 等是該偶聯(lián)網(wǎng)絡的潛在機制［67］。GPR48 不僅調(diào)控OC 分化亦可介導OB 分化，并且其作為7 次跨膜受體可調(diào)控cAMP/PKA、Pitx2、Wnt/β-catenin 和BMPs 等信號途徑并與其形成分子調(diào)控網(wǎng)絡，從而影響OB分化及骨形成［68］。已有研究證實，運動訓練可通過cAMP/PKA、Wnt/β-catenin 和BMPs 等信號途徑調(diào)控OB分化。那么我們不禁思考，運動對細胞產(chǎn)生的力學刺激可能就是以膜上GPR48 為媒介，傳入膜內(nèi)來調(diào)控以上信號途徑及成核結合因子（core-binding factor α1， Cbfα1） 、 PPARγ、

RANKL、OPG 等關鍵因子表達，實現(xiàn)運動促進OB分化。另一研究發(fā)現(xiàn)，在運動促進骨形成過程中，GPR48 可通過與TGF-β/Smads 途徑調(diào)控OB 分化。并且，Norrin 作為GPR48 配體可上調(diào)其表達，磷酸化BMP-2 的Ser122 和Ser132 位點，使得Smad1/5/8 激活并與Smad4 形成磷酸化基團轉(zhuǎn)移入核，上調(diào)靶基因表達來介導運動促進OB 分化［69］（圖3）。

GPR30 作為GPCRs 家族關鍵成員，其缺失后小鼠血液中骨吸收生化標志物CTX和股骨BMD下降［14］。而GPR30可調(diào)控骨形成關鍵蛋白BMP-6表達來發(fā)揮生物學作用。據(jù)此，當對骨施加運動力學刺激時，其可通過GPR30/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein-6，BMP-6）途徑來磷酸化Smad2、3、4并形成磷酸化復合基團，入核后調(diào)控BMSCs 向OB 的分化及骨形成（圖3）。雖然膜上GPCRs 家族成員較多，但目前運動醫(yī)學領域內(nèi)有關運動通過膜上GPCRs 介導下游級聯(lián)信號反應，進而調(diào)控OB和/或OC分化及骨代謝的相關研究尚待探究，這也將會是運動醫(yī)學領域內(nèi)研究骨細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)或骨代謝平衡分子調(diào)控機制的新熱點和新靶點。

3 問題與展望

隨著有關GPCRs 生物研究的不斷深入，其在調(diào)控OB和/或OC分化及功能發(fā)揮進而影響骨代謝中的關鍵作用已廣為認可。雖已有報道GPCRs 調(diào)控運動影響骨代謝，但相關研究較少。本研究拓展了GPCRs 的一個新功能，即其在運動影響OB 和/或OC分化及功能中的作用機制。國內(nèi)外體育科學或運動醫(yī)學領域有關GPCRs 調(diào)控骨代謝的專題研究較少，仍有很多問題亟待澄清，例如：a.還有哪些GPCRs？除已證實的GPR48 外，GPCRs 數(shù)量眾多，還有哪些GPCRs 在運動改善骨代謝中發(fā)揮作用，并且相應的分子調(diào)控機制網(wǎng)絡仍待揭示。b.選擇何種運動方式及強度？前人研究已證實運動方式不同對骨代謝產(chǎn)生的效果迥異，GPCRs 在此過程中扮演何角色，且同一運動的強度不同對骨細胞產(chǎn)生的力學刺激差異較大，所以多大強度可激活GPCRs？c.是否調(diào)控OB 與OC 之間“crosstalk”？OB 與OC 之間可借Runx2 等關鍵因子相互交聯(lián)，那么GPCRs 是否調(diào)控此過程且在運動改善骨代謝中是否也具有調(diào)控作用呢？明確以上問題，將有助于更加充分的熟知運動狀態(tài)下GPCRs 調(diào)控骨代謝的分子機制網(wǎng)絡，并為以后體育運動促進骨生長發(fā)育以及防治骨質(zhì)疏松提供理論依據(jù)和研究靶點。

Fig.3 Schematic diagram of the mechanism of GPCRs in the effect of exercise on bone metabolism圖3 GPCRs在運動影響骨代謝中的作用機制示意圖