ESCRT復(fù)合體在細(xì)胞質(zhì)膜損傷修復(fù)中的功能*

趙莎莎 石麗君 吳 迎

（北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京100084）

骨骼肌、血管內(nèi)皮及胃腸道上皮等細(xì)胞質(zhì)膜在生理情況下處于“損傷”和“修復(fù)”的動(dòng)態(tài)平衡中。胞膜損傷的誘因包括細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變、細(xì)菌毒素打孔、寄生蟲(chóng)感染、機(jī)械外力改變和缺血應(yīng)激等［1］。細(xì)胞膜修復(fù)（plasma membrane repair，PMR）延遲或受阻可能導(dǎo)致膜的損傷與修復(fù)失衡，誘發(fā)一系列生理或病理變化。如血管內(nèi)皮細(xì)胞膜的損傷可致動(dòng)脈粥樣硬化，胃腸道黏膜上皮受損可引起胃潰瘍的發(fā)生，覆蓋皮膚表層的復(fù)層上皮細(xì)胞膜破壞可誘發(fā)疤痕產(chǎn)生等［2］。此外，當(dāng)人體進(jìn)行高強(qiáng)度或不習(xí)慣的運(yùn)動(dòng)后（如離心運(yùn)動(dòng)），骨骼肌細(xì)胞膜將發(fā)生明顯破損。研究表明，細(xì)胞會(huì)在機(jī)械刺激或化學(xué)應(yīng)激下誘發(fā)細(xì)胞膜損傷，如不及時(shí)進(jìn)行修復(fù)將導(dǎo)致細(xì)胞“死亡”。相反，有效的PMR能夠及時(shí)關(guān)閉細(xì)胞的“大門(mén)”，防止胞內(nèi)成分的外流及胞外大量離子、氧化劑進(jìn)入，從而維持胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，確保細(xì)胞存活［3］。細(xì)胞膜的修復(fù)是一項(xiàng)復(fù)雜的“工程”，許多膜修復(fù)蛋白協(xié)同參與其中，并依據(jù)損傷的特點(diǎn)遵守時(shí)序性完成修復(fù)，其機(jī)制目前尚未完全清晰。

實(shí)驗(yàn)技術(shù)及膜修復(fù)的快速動(dòng)態(tài)變化是限制膜修復(fù)研究開(kāi)展的最大障礙，但隨著活細(xì)胞成像技術(shù)的不斷發(fā)展，這一復(fù)雜過(guò)程的“神秘面紗”逐漸被揭開(kāi)。目前研究發(fā)現(xiàn)的參與PMR 的蛋白質(zhì)包括肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（dysferlin）、膜聯(lián)蛋白（annexins）、MG53 （mitsugumin 53）、小窩蛋白（caveolin）、鈣激活蛋白酶（calpains）、 突觸結(jié)合蛋白（synaptotagmin，Syt）、可溶性-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble N-ethylmaleimidesensitive factor attachment protein receptors，SNAREs）等［1，4］。近年來(lái)，與晚期內(nèi)吞體形成途徑有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合體（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）系統(tǒng)被認(rèn)為是打開(kāi)PMR“黑箱”的關(guān)鍵鑰匙。2014年，Jimenez 等［5］證實(shí)了ESCRT 系統(tǒng)在質(zhì)膜小傷口修復(fù)過(guò)程中的重要作用。隨后，Scheffer等［6］又驗(yàn)證了其在質(zhì)膜大傷口快速修復(fù)中的作用機(jī)制?；诖?，ESCRT 系統(tǒng)是目前探究到的為數(shù)不多的既能調(diào)控小傷口“縫合”，也能介導(dǎo)大傷口“封印”的重要修復(fù)系統(tǒng)。

本文綜述了ESCRT 系統(tǒng)介導(dǎo)的以胞外出芽和多囊泡體（multivesicular body，MVB）形成為核心的兩種修復(fù)方式，梳理了ESCRT 系統(tǒng)各亞復(fù)合體在質(zhì)膜損傷修復(fù)中的重要作用，旨在為細(xì)胞膜損傷修復(fù)提供新的研究思路和防治策略。

1 ESCRT系統(tǒng)的組成及其生理學(xué)功能

ESCRT 系統(tǒng)廣泛存在于人體的多種組織細(xì)胞中，如肌組織、神經(jīng)組織、上皮組織等，并參與胞質(zhì)分裂、病毒出芽、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制、PMR 及核膜重塑等重要生命過(guò)程［5-14］。ESCRT 系統(tǒng)由6 個(gè)亞復(fù)合體組成，包括

ESCRT-0、 ESCRT-Ⅰ、 ESCRT-ⅠⅠ、 ESCRT-ⅠⅠⅠ、Vps4-Vta1 和ALⅠX 二 聚 體［15］。以 酵 母 為 例，ESCRT系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。ESCRT系統(tǒng)的6個(gè)亞復(fù)合體都由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物構(gòu)成，不同復(fù)合體的亞基雖結(jié)構(gòu)各異，但不同亞基經(jīng)特定結(jié)構(gòu)域相互聯(lián)系作為功能復(fù)合體共同發(fā)揮作用。人類(lèi)與酵母的ESCRT 系統(tǒng)同源性較高，發(fā)揮其特異性作用的結(jié)構(gòu)域或基序相似［15-16］。酵母與人類(lèi)ESCRT 命名法的轉(zhuǎn)換，各組成部分的功能序列及作用見(jiàn)表1［16-42］。ESCRT 的發(fā)現(xiàn)與人們對(duì)MVB 的研究密切相關(guān)。 MVB 中的內(nèi)腔囊泡（intraluminal vesicles，ⅠLVs）在ESCRT 的作用下對(duì)“貨物”蛋白進(jìn)行分揀，最后由晚期內(nèi)吞體的限制膜向腔內(nèi)出芽而成。這些ESCRT 蛋白能夠按照順序依次被招募至內(nèi)吞體膜上協(xié)同形成ⅠLVs。

Fig.1 Basic structure of the ESCRT system圖1 ESCRT系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)

Table 1 ESCRT system composition，naming，functional domain，motif and function表1 ESCRT系統(tǒng)的組成、命名、功能結(jié)構(gòu)域、基序及作用

1.1 ESCRT-0

ESCRT-0的主要功能是識(shí)別泛素化蛋白并富集底物。除此以外，ESCRT-0 還具有招募網(wǎng)格蛋白（包涵素）、泛素化連接酶及去泛素化酶的作用。ESCRT-0 由亞基Vps27/HRS 和Hse1/STAM 以1∶1比例構(gòu)成［18-19］。Vps27 和Hse1 的N 端都包含了能與泛素結(jié)合的VHS 結(jié)構(gòu)域［20］。Vps27 的VHS 結(jié)構(gòu)域下游緊跟一個(gè)FYVE結(jié)構(gòu)域，Vps27和HRS可通過(guò)FYVE結(jié)構(gòu)域與早期內(nèi)吞體膜的磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinosito-3-phosphate，PⅠ3P）結(jié)合，從而介導(dǎo)膜定位［21-22］。FYVE結(jié)構(gòu)域的下游是泛素結(jié) 合 結(jié) 構(gòu) 域（ubiquitin-binding motif， UⅠM），ESCRT-0的多個(gè)泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域使其對(duì)多聚泛素化鏈具有很高的親和力，并對(duì)泛素化標(biāo)記的“貨物”蛋白有聚集作用。包涵素通過(guò)與HRS 的包涵素結(jié)合（clathrin-binding， CB） 結(jié) 構(gòu) 域 相 連， 同ESCRT-0一起被招募，以促進(jìn)ESCRT-0在電子致密微域中的聚集［23］。Vps27 則通過(guò)P（S/T）XP 基序與ESCRT-Ⅰ的Vps23亞基結(jié)合［24-26］，并將后者招募至內(nèi)體膜上。ESCRT-0 通過(guò)VHS、UⅠM 結(jié)構(gòu)域與泛素結(jié)合從而識(shí)別標(biāo)記目的蛋白，是MVB 路徑中募集靶蛋白的關(guān)鍵步驟。

1.2 ESCRT-I和ESCRT-II

ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠ功能相似，通常協(xié)同發(fā)揮作用。ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠ以1∶1 的比例在膜上組裝，其主要功能是使內(nèi)體膜內(nèi)陷形成初始芽體［27-28］。ESCRT-Ⅰ由亞基Vps23/TSG101、Vps28/VPS28、Vps37/VPS37 和Mvb12/MVB12 組 成，亞基Vps22/EPA30、Vps25/EPA20 和Vps36/EPA45 則構(gòu)成了ESCRT-ⅠⅠ［29-31］。其中，ESCRT-Ⅰ亞基Vps23的N 端有一個(gè)UEV（ubiquitin E2 variant）結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合泛素化蛋白和某些病毒蛋白；Vps28 的C端有一個(gè)四螺旋結(jié)構(gòu)CTD，主要負(fù)責(zé)招募ESCRT-ⅠⅠ；Vps37 的N 端結(jié)構(gòu)域能夠幫助ESCRT-Ⅰ與膜結(jié)合。Vps22 與ESCRT-Ⅰ的Vps37 功能類(lèi)似，有助于ESCRT-ⅠⅠ的膜定位。ESCRT-ⅠⅠ亞基Vps25 包含的WH （winged-helix） 結(jié) 構(gòu) 域 能 與ESCRT-ⅠⅠⅠ亞 基Vps20 結(jié)合；Vps36 包含一個(gè)GLUE 結(jié)構(gòu)域，能與PⅠ3P 結(jié)合介導(dǎo)其定位［15］。另外，ESCRT-Ⅰ可通過(guò)Vps23 的UEV 結(jié)構(gòu)域與ESCRT-0 相互作用，而ESCRT-ⅠⅠ則 通 過(guò)WH 結(jié) 構(gòu) 域 與ESCRT-ⅠⅠⅠ連接［24-26，32］。 ESCRT-Ⅰ 和 ESCRT-ⅠⅠ 通 過(guò) CTD（Vps28）-GLUE（Vps36）結(jié)構(gòu)域相連接，共同驅(qū)動(dòng)MVB的形成，分揀“貨物”蛋白［16］。

1.3 ESCRT-III

ESCRT-ⅠⅠⅠ的主要功能是剪切芽頸、生成小泡，其在ESCRT 系統(tǒng)介導(dǎo)膜剪切中發(fā)揮了核心作用［33］。ESCRT-ⅠⅠⅠ由 亞 基Vps2/CHMP2、Vps20/CHMP6、 Vps24/CHMP3、 Snf7/CHMP4、 Vps60/CHMP5、Did2/CHMP1 和Ⅰst1/ⅠST1 組 成［15，27，33］。與ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-ⅠⅠ亞復(fù)合體不同，ESCRT-ⅠⅠⅠ亞復(fù)合體以單體形式存在于細(xì)胞基質(zhì)中，只有當(dāng)這些亞基在內(nèi)體膜上有序組裝時(shí)才能發(fā)揮其蛋白分揀轉(zhuǎn)運(yùn)功能。其中，Vps2、Vps20、Vps24和Snf7 是行使復(fù)合體剪切功能的核心亞基，而Vps60、Did2和Ⅰst1并不是ESCRT-ⅠⅠⅠ發(fā)揮功能所必需的［15-16］。ESCRT-ⅠⅠⅠ按Vps20-Snf7-Vps24-Vps2順序進(jìn)行組裝。Vps20是組裝的起點(diǎn)，隨后Snf7介導(dǎo)多聚化形成絲狀、環(huán)狀或螺旋狀結(jié)構(gòu)剪切芽莖，Vps24 終止Snf7 多聚化，Vps2 招募ATP 酶Vps4，Did2 招募Vta1 或Ⅰst1［34-36］。ESCRT-ⅠⅠⅠ不僅可以通過(guò)特定區(qū)域與ESCRT-ⅠⅠ結(jié)合，而且其不同亞基通過(guò)MⅠM 基序（MⅠT interacting motif）能與Vps4 等含有MⅠT（microtubule interacting and transport）結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合［32］。在水解ATP 提供能量時(shí)，Vps4 可能與ESCRT-ⅠⅠⅠ協(xié)同作用。ESCRT-ⅠⅠⅠ剪切功能的正常執(zhí)行依賴(lài)于各亞基的多聚化組裝［15］。

1.4 Vps4-Vta1

Vps4-Vta1 的主要功能是調(diào)控ESCRT-ⅠⅠⅠ的解離以維持ESCRT 系統(tǒng)的正常功能。Vps4 屬于AAA+ATP 酶 （ATPases associated with diverse cellular activities），其主要功能是水解ATP 提供能量，將內(nèi)體膜上的ESCRT-Ⅲ亞復(fù)合體解聚下來(lái)，從而完成循環(huán)利用［15，37-39］。其中，Vps4 由1 個(gè)N端結(jié)合ESCRT-ⅠⅠⅠ的MⅠT 結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)大的ATPase結(jié)構(gòu)域、1個(gè)小的ATPase結(jié)構(gòu)域、1個(gè)β結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C端螺旋組成［37］。Vta1結(jié)合在Vps4上，促進(jìn)了Vps4 的聚合、催化活性以及與ESCRT-ⅠⅠⅠ的結(jié)合［40］。Vta1 的N 端包含了兩個(gè)序列不同的MⅠT 結(jié)構(gòu)域，通過(guò)MⅠT 結(jié)構(gòu)域既能與Did2 結(jié)合來(lái)介導(dǎo)Vta1 的膜定位，又能與Vps60 緊密結(jié)合相互作用。Vta1的C端VSL結(jié)構(gòu)域能與Vps4的β結(jié)構(gòu)域結(jié)合。雖然Vta1與Vps4在晶體結(jié)構(gòu)上并不像其他ESCRT復(fù)合體亞基之間一樣組合相連，但Vta1 與Vps4 在功能上以復(fù)合體的形式發(fā)揮作用。Vps4-Vta1 共同作用于MVB途徑和其他Vps4參與的生命過(guò)程［41］。Vta1 與Vps4、ESCRT-ⅠⅠⅠ結(jié)合并能促進(jìn)Vps4 的多聚化、激活A(yù)TP酶活性，是Vps4的組裝因子。

1.5 ALIX

活化的ALⅠX 形成二聚體發(fā)揮作用，其通過(guò)Bro1 結(jié)構(gòu)域與Snf7 結(jié)合以穩(wěn)固Snf7 多聚體，并參與招募去泛素化酶Doa4，也可作為適配器連接ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠⅠ［15］。除此之外，ALⅠX還能激活ESCRT-ⅠⅠⅠ的組裝，調(diào)控ESCRT-ⅠⅠⅠ的功能，從而作為功能復(fù)合體參與PMR［42-44］。

2 ESCRT系統(tǒng)在PMR中的作用

大多數(shù)研究學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞膜主要有三種修復(fù)模式：胞吞、胞外出芽和膜“補(bǔ)丁”［5］。細(xì)胞膜受損時(shí)細(xì)胞采用何種修復(fù)模式取決于“傷害”的性質(zhì)和“傷口”的大小。如造孔毒素（pore-forming toxins，PFTs） 誘導(dǎo)的“傷口”較?。ㄖ睆剑?00 nm），且它們形成的蛋白質(zhì)孔不能通過(guò)脂質(zhì)補(bǔ)丁修補(bǔ)，所以多采用胞吞和胞外出芽的方式修復(fù)；而大傷口（直徑200～500 nm）則主要采用膜“補(bǔ)丁”進(jìn)行修復(fù)［1，45-48］。ESCRT 系統(tǒng)可同時(shí)參與大傷口和小傷口的修復(fù)，但目前對(duì)于大傷口修復(fù)的研究較少［5-6］。根據(jù)ESCRT系統(tǒng)介導(dǎo)修復(fù)模式的不同，可將其分為胞外出芽和MVB 形成兩種修復(fù)途徑。

2.1 ESCRT系統(tǒng)與出芽修復(fù)

胞外出芽修復(fù)依賴(lài)于ESCRT 系統(tǒng)。激光誘導(dǎo)的HeLa 細(xì)胞膜損傷實(shí)驗(yàn)中，活細(xì)胞成像觀察發(fā)現(xiàn)了膜傷口處ESCRT 系統(tǒng)相關(guān)蛋白招募，其中包括ESCRT-ⅠⅠⅠ 的 CHMP4B、 CHMP3、 CHMP2A、CHMP2B 亞基和VPS4。在此基礎(chǔ)上，Jimenez等［5］進(jìn)一步研究證實(shí)了CHMP4B 在該修復(fù)方式中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。掃描電子顯微鏡觀察可見(jiàn)，損傷區(qū)域附近帶有CHMP4B 熒光標(biāo)記的細(xì)胞外芽，用siRNA-CHMP4B 技術(shù)處理?yè)p傷細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率顯著下降，證實(shí)ESCRT-ⅠⅠⅠ可通過(guò)出芽的方式參與PMR［5］。隨后在其他研究中又陸續(xù)驗(yàn)證了Ca2+、Annexin A7和ALG-2（apoptosis link protein）是ESCRT 系統(tǒng)介導(dǎo)出芽修復(fù)的重要參與者，ESCRT系統(tǒng)介導(dǎo)的出芽修復(fù)機(jī)制如圖2所示。

2.1.1 Ca2+觸發(fā)ESCRT系統(tǒng)相關(guān)蛋白的順序性裝配

Ca2+是啟動(dòng)ESCRT系統(tǒng)介導(dǎo)出芽式修復(fù)的“鑰匙”。Scheffer等［6］證實(shí)只有當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多時(shí)，細(xì)胞膜表面的ALⅠX、ALG-2、VPS4 和ESCRT-ⅠⅠⅠ聚集才會(huì)增強(qiáng)。反之，無(wú)Ca2+時(shí)未能觀察到ESCRT參與的修復(fù)發(fā)生。

ESCRT 系統(tǒng)介導(dǎo)的出芽修復(fù)相關(guān)蛋白的募集呈現(xiàn)出嚴(yán)格的時(shí)序性。損傷后的細(xì)胞膜表面可見(jiàn)修復(fù)蛋白呈現(xiàn)順序性聚集，如ALⅠX和ALG-2在損傷后30 s 內(nèi)開(kāi)始組裝，CHMP1A 和CHMP4B 于損傷后45 s 開(kāi)始組裝，而VPS4 則于損傷后60 s 開(kāi)始組裝［6］。該修復(fù)過(guò)程中招募的鈣離子結(jié)合蛋白ALG-2已被證實(shí)以Ca2+依賴(lài)的方式與ALⅠX、TSG-101 和CHMP4B相聯(lián)系。S?nder等［44］用免疫共沉淀證明了ALG-2 與Annexin A7 以復(fù)合體的形式聚集于損傷處，ESCRT-ⅠⅠⅠ和VPS4功能的執(zhí)行依賴(lài)于ALG-2與Annexin A7 精確的膜定位。首先，Annexin A7以Ca2+和磷脂酰絲氨酸依賴(lài)的方式與游離的膜邊緣結(jié)合，并促進(jìn)Ca2+與膜的結(jié)合；其次，Annexin A7在細(xì)胞膜損傷時(shí)被招募至損傷部位靶定于細(xì)胞膜，并于損傷處與具有EF-Hand結(jié)構(gòu)的鈣離子結(jié)合蛋白ALG-2結(jié)合，ALⅠX通過(guò)與ALG-2直接作用被招募至細(xì)胞膜缺口處；最后，ALG-2 與ALⅠX 組裝ESCRT-ⅠⅠⅠ亞復(fù)合體和TSG101，在傷口愈合過(guò)程中幫助切除和脫落細(xì)胞膜的受損部分［6，44，49］。綜上所述，ESCRT-ⅠⅠⅠ和VPS4 等ESCRT 系統(tǒng)相關(guān)蛋白在損傷細(xì)胞膜上的定位累積需要Annexin A7、ALG-2和ALⅠX復(fù)合體的形成，且缺一不可［44］。

Fig.2 Budding repair mediated by the ESCRT system圖2 ESCRT系統(tǒng)介導(dǎo)的出芽式修復(fù)

2.1.2 ESCRT-III和VPS4參與出芽小泡的形成及脫落

膜斷裂和囊泡形成是修復(fù)所必需的，ESCRT-Ⅲ和VPS4參與了出芽小泡的形成及脫落過(guò)程。行使重要修復(fù)職能的ESCRT-ⅠⅠⅠ由眾多亞基組成，這些亞基是細(xì)胞質(zhì)中不活躍的單體，當(dāng)膜修復(fù)觸發(fā)后，它們能組裝成具有活性的ESCRT-ⅠⅠⅠ異型聚合物［15］。在此過(guò)程中，ESCRT-ⅠⅠⅠ一方面驅(qū)動(dòng)細(xì)胞膜向胞外突出變形、剪切芽頸，促進(jìn)胞外小泡（或微囊泡體）的釋放［33］，另一方面，Meng 等［50］研究發(fā)現(xiàn)ESCRT-ⅠⅠⅠ可作為上游信號(hào)招募與細(xì)胞膜修復(fù)相關(guān)的關(guān)鍵蛋白Syntaxin2 和EFF-1。VPS4 主要在水解ATP 提供能量的條件下介導(dǎo)ESCRT-ⅠⅠⅠ的解離。

ESCRT-ⅠⅠⅠ介導(dǎo)的胞外出芽式修復(fù)具有以下特點(diǎn)：a.ESCRT-ⅠⅠⅠ靶向細(xì)胞膜聚集不需要ATP。出芽修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵亞基CHMP4B 在細(xì)胞膜中的募集不需要完全聚合的微管，不依賴(lài)于ATP。b.胞外出芽修復(fù)主要依賴(lài)于ESCRT-Ⅲ和VPS4。于“傷口”處監(jiān)測(cè)ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠ，只觀察到了TSG101 在膜處的聚集［5-6］。TSG101 在適配器ALG-2 的作用下連接ALⅠX，這可能是TSG101在PMR 部位積累的基礎(chǔ)［49］。ALⅠX 通過(guò)特定結(jié)構(gòu)域直接與ESCRT-ⅠⅠⅠ相連接，在出芽修復(fù)中損傷誘導(dǎo)的ESCRT-ⅠⅠⅠ組裝繞過(guò)了ESCRT-0、Ⅰ和ⅠⅠ。c.與MVB 路徑相比，出芽修復(fù)中的泛素化反應(yīng)相對(duì)滯后。MVB 途徑中“貨物”蛋白的泛素化是修復(fù)的初始過(guò)程，而出芽修復(fù)中TSG101引起的多聚泛素化反應(yīng)相對(duì)延遲。與MVB 路徑不同，出芽式修復(fù)中滯后的泛素化反應(yīng)主要是為了加強(qiáng)最初ESCRT系統(tǒng)的招募［51］。兩種修復(fù)方式中ESCRT參與工作的機(jī)制并不相同，相比之下，ESCRT 介導(dǎo)的MVB修復(fù)更為復(fù)雜。

2.2 ESCRT系統(tǒng)與MVB形成的修復(fù)

MVB生物發(fā)生涉及20多種囊泡分揀蛋白，其中最重要的是在內(nèi)吞體膜上聚集的ESCRT 蛋白。PMR 過(guò)程中，損傷細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷形成約300～500 nm 大小的細(xì)胞內(nèi)吞泡，經(jīng)內(nèi)吞體途徑發(fā)展，在ESCRT 系統(tǒng)的作用下，內(nèi)吞泡融合在一起形成富含多個(gè)ⅠLVs 的MVB［16］。MVB 形成后一方面可以通過(guò)溶酶體途徑將侵害細(xì)胞膜的PFTs 或受損蛋白降解，另一方面可與細(xì)胞膜融合并胞出大量促使組織修復(fù)和再生的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）， 通 過(guò) 這 兩 種 途 徑 完 成PMR［45，52-55］。

2.2.1 ESCRT-0、Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ介導(dǎo)MVB的形成

MVB 的形成始發(fā)于細(xì)胞膜內(nèi)陷。當(dāng)細(xì)胞膜受損時(shí)，胞外Ca2+向胞內(nèi)聚集，Ca2+濃度升高觸發(fā)溶酶體胞吐，溶酶體與細(xì)胞膜的融合可減輕膜張力，引起酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）釋放。鞘磷脂酶移至細(xì)胞膜表面，水解鞘磷脂磷脂酰膽堿頭部基團(tuán)產(chǎn)生富含神經(jīng)酰胺的微域，隨后神經(jīng)酰胺驅(qū)動(dòng)膜內(nèi)陷使受損脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等內(nèi)化形成內(nèi)吞囊泡［47，53］。這種膜響應(yīng)方式作為真核生物保護(hù)自己免受細(xì)菌攻擊的早期有效方法。該過(guò)程中的內(nèi)陷囊泡也被稱(chēng)為早期內(nèi)吞體，早期內(nèi)吞體是晚期內(nèi)吞體形成的基礎(chǔ)，MVB就是含有眾多ⅠLVs的成熟晚期內(nèi)吞體。ⅠLVs 的形成依賴(lài)于ESCRT 亞復(fù)合體蛋白，這些蛋白質(zhì)是泛素化蛋白正確分選后內(nèi)陷到MVB腔間隙囊泡中所必需的［7］。

ESCRT系統(tǒng)是MVB形成的重要參與者，其亞復(fù)合體通過(guò)特定的功能結(jié)構(gòu)域使“貨物”蛋白實(shí)現(xiàn)順序性呈遞［7，16］。首先，“貨物”蛋白被泛素化修飾?！柏浳铩钡鞍仔璞环核貥?biāo)記后才能被ESCRT-0的Vps27 亞基和Hse1 亞基的VHS、UⅠM 泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識(shí)別。其次，ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ及ESCRT-ⅠⅠ通過(guò)特定亞基與內(nèi)吞體膜上的特異性脂質(zhì)磷脂酰肌醇三磷酸結(jié)合，這有助于ESCRT 系統(tǒng)在內(nèi)吞體的靶向定位。ESCRT-0、Ⅰ、ⅠⅠ亞復(fù)合體按照P（S/T）XP 基序-UEV 和CTD-GLUE 的順序連接起來(lái)，隨后經(jīng)各自的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)泛素化“貨物”的順序性呈遞。最后，ESCRT-ⅠⅠⅠ通過(guò)亞基Vps25 與Vps20 之間的連接被ESCRT-ⅠⅠ招募。ESCRT-0能結(jié)合泛素連接酶和去泛素化酶協(xié)調(diào)泛素化及去泛素化過(guò)程，是簇集“貨物”蛋白的主要因子。ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠ這兩種亞復(fù)合體富集于囊泡芽頸處，顯著降低了泛素化蛋白的運(yùn)動(dòng)性，能夠有效誘導(dǎo)芽體生成，啟動(dòng)膜內(nèi)陷。ESCRT-ⅠⅠⅠ的組裝是按照亞基Vps20-Snf7-Vps24-Vps2 的順序依次進(jìn)行，主要功能是剪切芽頸驅(qū)動(dòng)囊泡的產(chǎn)生。在ESCRT 系統(tǒng)的調(diào)控下，泛素化“貨物”被分選并向內(nèi)凹陷形成囊泡釋放至內(nèi)腔中。隨著ⅠLVs 的增多，MVB逐漸形成［7，15-16，28］。

最新研究表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中除了典型的ESCRT-0、 ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠ依 賴(lài) 途 徑 外，ALⅠX 能繞開(kāi)ESCRT-Ⅱ直接激活ESCRT-ⅠⅠⅠ，作為替代的適配器將“貨物”蛋白分選到ⅠLVs［7］?；罨腁LⅠX 形成二聚體，作為支架蛋白偶聯(lián)CHMP4，調(diào)控及穩(wěn)定CHMP4 的多聚化。ALⅠX 通過(guò) 亞 基CHMP4、 TSG101 分 別 與ESCRT-ⅠⅠⅠ、ESCRT-Ⅰ相互作用，具有連接ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠⅠ的潛力。此外，Baietti 等［56］和Hurley 等［57］報(bào)道了ALⅠX 與細(xì)胞內(nèi)接合蛋白syntenin 的結(jié)合能促進(jìn)MVB 來(lái)源EVs 的釋放。目前認(rèn)為ALⅠX 在MVB途徑中充當(dāng)“輔助角色”，但這些該研究的重要發(fā)現(xiàn)提示了ALⅠX 可能在MVB 修復(fù)中舉足輕重，這需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.2.2 Vps4-Vta1介導(dǎo)ESCRT-ⅠⅠⅠ的解聚與循環(huán)

ESCRT-ⅠⅠⅠ完成剪切后，不會(huì)進(jìn)入ⅠLVs 內(nèi)部，而是留在內(nèi)體膜表面。Vps4-Vta1 亞復(fù)合體的催化作用使ESCRT-ⅠⅠⅠ各亞基發(fā)生解聚并從內(nèi)體膜釋放到細(xì)胞質(zhì)中，完成循環(huán)并作用于下一輪膜剪切。ESCRT-ⅠⅠⅠ的解聚是一個(gè)耗能過(guò)程，Vps4 水解ATP提供能量使ESCRT-ⅠⅠⅠ構(gòu)象改變，最終使其解聚。Vps4 是ESCRT 整個(gè)系統(tǒng)的反應(yīng)能量來(lái)源，也是ESCRT系統(tǒng)參與的生理過(guò)程的“總開(kāi)關(guān)”，其缺失將導(dǎo)致MVB途徑被完全阻斷［58-59］。

除此之外，MVB 途徑的正常進(jìn)行需要完整的泛素化和去泛素化過(guò)程。因此，控制蛋白質(zhì)的泛素化對(duì)于ESCRT 系統(tǒng)調(diào)控的ⅠLVs“貨物”分選至關(guān)重要［60］。E3泛素連接酶和去泛素化酶是ESCRT系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分選的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。MVB 途徑的調(diào)控不僅是通過(guò)調(diào)節(jié)“貨物”泛素化實(shí)現(xiàn)的，而且也是通過(guò)控制ESCRT 系統(tǒng)組件（如HRS、TSG101 和ALⅠX） 的泛素化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Amerik等［61］在萌芽酵母實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，“貨物”去泛素化發(fā)生在ⅠLVs分選之前?！柏浳铩钡鞍妆环核鼗揎椧赃M(jìn)入MVB 途徑進(jìn)行分揀，并在進(jìn)入MVB 囊泡之前及時(shí)去掉泛素分子，這對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)泛素的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。

2.2.3 MVB發(fā)展路徑與PMR

MVB 形成后可通過(guò)兩種不同的發(fā)展路徑促進(jìn)PMR，即通過(guò)溶酶體途徑直接將內(nèi)含物降解和驅(qū)動(dòng)MVB同細(xì)胞膜融合釋放ⅠLVs。MVB中的PFTs、膜表面蛋白及膜脂質(zhì)等可趨向溶酶體降解。Corrotte 等［45］已證實(shí)，內(nèi)吞毒素以MVB 的形式趨向溶酶體降解。PFTs 或受損膜蛋白的內(nèi)吞清除過(guò)程包括溶酶體的胞吐和窖體的內(nèi)吞，以及ESCRT系統(tǒng)介導(dǎo)的ⅠLVs 在晚期內(nèi)吞體內(nèi)的萌發(fā)?！柏浳铩北环核鼗揎椇蠓诌x進(jìn)入MVB，最后通過(guò)溶酶體途徑在酸性環(huán)境中將囊泡中的“貨物”蛋白進(jìn)行降解。雖然ⅠLVs 中的“貨物”主要靶向至溶酶體，但一些ⅠLVs 及其“貨物”并不一定要降解。MVB經(jīng)胞吐釋放出傳遞細(xì)胞外信號(hào)的ⅠLVs，這些ⅠLVs也是一種EV。大量研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間存有眾多來(lái)源于MVB 的EVs［62］。PMR 過(guò)程中，SNARE 蛋白和眾多束縛因子，如突觸關(guān)聯(lián)蛋白（SNAP23）、突觸融合蛋白1a（Syntaxin1a）、囊泡相關(guān)膜蛋白7（vesicle-associated membrane protein 7，VAMP7）、VAMP8、Rabs11、Rabs27 和Rabs35 等協(xié)同作用，促使MVB 趨向細(xì)胞膜進(jìn)行胞吐，并在胞外分泌時(shí)釋放ⅠLVs［53］。通過(guò)囊泡運(yùn)輸，受損的細(xì)胞膜一般可在損傷后幾分鐘內(nèi)完成修復(fù)。但當(dāng)質(zhì)膜受損嚴(yán)重時(shí)，EVs 釋放的細(xì)胞外信號(hào)將調(diào)控修復(fù)過(guò)程持續(xù)進(jìn)行。

ESCRT系統(tǒng)介導(dǎo)的胞外出芽和以MVB形成為核心的兩種修復(fù)途徑既有區(qū)別又有聯(lián)系。它們的共通點(diǎn)是在修復(fù)過(guò)程中都有EVs產(chǎn)生，不同點(diǎn)是這兩種修復(fù)方式所產(chǎn)生的EVs 大小、組成和來(lái)源不同。例如，出芽小泡的直徑約在150～1 000 nm，而ⅠLVs 直徑約在30～150 nm。Roefs 等［54］和Cabral等［55］認(rèn)為，EVs 能夠以旁分泌或內(nèi)分泌的方式促進(jìn)組織修復(fù)和創(chuàng)面愈合。此外，Bittel等［53］報(bào)道出芽和MVB 兩種途徑產(chǎn)生的EVs 均可參與骨骼肌細(xì)胞膜損傷修復(fù)。骨骼肌作為人體運(yùn)動(dòng)的主要功能器官，細(xì)胞膜的損傷較為常見(jiàn)。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)或離心收縮后骨骼肌最明顯的損傷就是細(xì)胞膜通透性提高，若能促進(jìn)骨骼肌運(yùn)動(dòng)后細(xì)胞膜的損傷修復(fù)，將有利于骨骼肌疲勞的恢復(fù)加速，改善運(yùn)動(dòng)疲勞恢復(fù)效率?；诖?，深入研究ESCRT系統(tǒng)在PMR中的作用，將有助于探尋促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞膜損傷修復(fù)的新方法，為促進(jìn)運(yùn)動(dòng)骨骼肌疲勞恢復(fù)提供新思路。

3 ESCRT系統(tǒng)膜修復(fù)異常與疾病

細(xì)胞膜破損出現(xiàn)“傷口”是程序性壞死、細(xì)胞焦亡及鐵死亡等細(xì)胞壞死的主要誘因［63］。一方面，經(jīng)“傷口”釋放的細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)細(xì)胞裂解并刺激機(jī)體進(jìn)行免疫應(yīng)答，而這與癌癥、敗血癥和神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。另一方面，ESCRT 系統(tǒng)及時(shí)、有效地修復(fù)可延緩細(xì)胞“死亡”，成為相關(guān)疾病治療的新靶點(diǎn)［64-67］。

ESCRT 系統(tǒng)的膜修復(fù)功能為治療癌癥提供了新思路。大量研究證實(shí)，ESCRT-Ⅲ亞復(fù)合體通過(guò)修復(fù)受損的細(xì)胞膜能抑制程序性壞死、細(xì)胞焦亡及鐵死亡［64-66］。ESCRT-Ⅲ亞基CHMP4B 在這三個(gè)不同的調(diào)控細(xì)胞“死亡”途徑中具有共同作用，即抗衡膜穿孔和延遲細(xì)胞“死亡”，這為細(xì)胞存活爭(zhēng)取了寶貴時(shí)間，受損細(xì)胞得以釋放特異性細(xì)胞因子向鄰近細(xì)胞發(fā)出危險(xiǎn)信號(hào)。ESCRT-Ⅲ的“拯救”機(jī)制有可能延長(zhǎng)被病毒感染的細(xì)胞壽命，降低氧氣缺乏導(dǎo)致的移植損傷及減輕心臟病或中風(fēng)引發(fā)的組織缺血損傷等［66］。但是，壞死過(guò)程中與膜結(jié)合的死亡執(zhí)行因子（如MLKL、焦孔素（gasdermins）、脂質(zhì)過(guò)氧化物（lipid peroxides））濃度過(guò)高時(shí)，細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制不堪重負(fù)，也會(huì)導(dǎo)致膜破裂和“死亡”。Liu 等［68］認(rèn)為負(fù)調(diào)控依賴(lài)于ESCRT-Ⅲ的膜修復(fù)功能促進(jìn)細(xì)胞的非凋亡性死亡，這在一定程度上能夠提高抗癌劑對(duì)腫瘤細(xì)胞“死亡”的敏感性，可作為治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)。

ESCRT 系統(tǒng)的膜修復(fù)功能為治療阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）提供了新的可能。β 淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）異常沉積是AD發(fā)病的關(guān)鍵，與神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷、突觸功能紊亂、細(xì)胞內(nèi)鈣離子失調(diào)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等有關(guān)［69］。所以，降低Aβ含量及減弱其神經(jīng)毒性作用是延緩AD 進(jìn)程、減輕AD 癥狀的關(guān)鍵。ESCRT 系統(tǒng)通過(guò)胞外出芽和MVB 途徑共同調(diào)控Aβ 毒性［67，70-71］。例如，F(xiàn)ruhmann 等［67］敲除Bro1 基因證實(shí)了ESCRT系統(tǒng)可通過(guò)增強(qiáng)膜修復(fù)功能下調(diào)Aβ毒性。此外，溶酶體膜、核膜等的修復(fù)也是由ESCRT 系統(tǒng)介導(dǎo)的。溶酶體膜修復(fù)時(shí)，ESCRT-ⅠⅠⅠ依賴(lài)TSG101 和ALⅠX 被招募至傷口處［72］；核膜修復(fù)過(guò)程中，CHMP4B 被ESCRT-Ⅲ附屬蛋白CHMP7 及核膜內(nèi)層蛋白LEMD2 招募至損傷部位發(fā)揮作用［73］。

ESCRT 系統(tǒng)為肌肉損傷或肌營(yíng)養(yǎng)不良患者提供了潛在的治療靶點(diǎn)。當(dāng)骨骼肌受到機(jī)械刺激，或因遺傳性疾病（如肌營(yíng)養(yǎng)不良）使肌纖維脆性增加時(shí)，膜損傷更容易發(fā)生。肌纖維修復(fù)主要依賴(lài)于胞內(nèi)修復(fù)蛋白如dysferlin、annexins 和ESCRT 系統(tǒng)等，而再生則側(cè)重依賴(lài)于ESCRT 系統(tǒng)和激活衛(wèi)星細(xì) 胞（satellite cells，SCs） 增 殖 分 化 的EVs。Scheffer等［6］已證實(shí)，在肌細(xì)胞質(zhì)膜大面積局灶性損傷中，ESCRT 系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用，若其功能喪失將會(huì)抑制受損質(zhì)膜出芽形成EVs，最終影響修復(fù)完成。Le Bihan 等［74］認(rèn)為，EVs 不僅可以作為監(jiān)測(cè)先天性肌病進(jìn)展的生物標(biāo)志物，而且能夠有效協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號(hào)交流，增強(qiáng)修復(fù)效應(yīng)，改善先天性肌病。Koutsoulidou 等［75］研究表明，EVs 在1 型肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良（myotonic dystrophy type 1，DM1）中發(fā)揮作用。ESCRT系統(tǒng)對(duì)EVs的產(chǎn)生和調(diào)控是至關(guān)重要的，因此，在未來(lái)有關(guān)EVs引起的疾病可考慮以ESCRT 系統(tǒng)為落腳點(diǎn)，可能會(huì)實(shí)現(xiàn)新的突破。

4 總結(jié)與展望

ESCRT 系統(tǒng)是PMR 近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。深入探究ESCRT 系統(tǒng)的修復(fù)機(jī)制，能夠?yàn)橛行Ц深A(yù)細(xì)胞膜損傷修復(fù)提供幫助。以ESCRT 系統(tǒng)為靶點(diǎn)完善或加速PMR 過(guò)程，可為機(jī)械損傷或化學(xué)應(yīng)激引起的細(xì)胞膜損傷修復(fù)提供新方法。例如，ESCRT系統(tǒng)的PMR 機(jī)制為運(yùn)動(dòng)骨骼肌的加速恢復(fù)提供了潛在可能。如何加速骨骼肌在延遲性肌肉酸痛（delayed onset muscle damage，DOMS）期的恢復(fù)是提高運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練效率的重要問(wèn)題，通過(guò)加速細(xì)胞膜“傷口”的封印，將有效防止肌細(xì)胞胞內(nèi)成分的外流和胞外大量離子、氧化劑進(jìn)入，從源頭加快骨骼肌損傷修復(fù)和運(yùn)動(dòng)疲勞的消除。ESCRT 系統(tǒng)可能在運(yùn)動(dòng)或遺傳性缺陷引起的肌肉損傷修復(fù)和再生中發(fā)揮重要作用。因此，外源性ESCRT 重組蛋白手段干預(yù)促進(jìn)ESCRT 系統(tǒng)修復(fù)可能成為骨骼肌、血管內(nèi)皮及神經(jīng)元損傷修復(fù)的治療靶點(diǎn)之一。

與其他膜修復(fù)蛋白相比，ESCRT 系統(tǒng)的修復(fù)過(guò)程更為復(fù)雜，其機(jī)制遠(yuǎn)未明了。例如：胞外出芽和MVB 形成兩種修復(fù)方式的觸發(fā)順序、時(shí)程特點(diǎn)尚未完全清晰；ALⅠX如何激活ESCRT-Ⅲ也未見(jiàn)報(bào)道；Vps4十二聚體是如何撬動(dòng)ESCRT-ⅠⅠⅠ亞復(fù)合體以實(shí)現(xiàn)解聚反應(yīng)目前難以闡明；ESCRT 可調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其介導(dǎo)PMR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還有待探討。PMR精密且復(fù)雜，“修補(bǔ)匠們”各司其職共同完成修復(fù)，ESCRT 與其他膜修復(fù)蛋白是如何協(xié)同工作的，是否相互影響？在膜修復(fù)不同模型中其又有哪些特點(diǎn)？如“修復(fù)帽”模型中ESCRT 系統(tǒng)是否參與？這些都是今后研究ESCRT 膜修復(fù)中需要解決的問(wèn)題。