腫節(jié)風藥渣綠色制備納米銀及體外抗癌作用研究

王英輝，鄒太艷，蘇 瑞，魏思敏

·藥劑與工藝·

腫節(jié)風藥渣綠色制備納米銀及體外抗癌作用研究

王英輝1，鄒太艷2，蘇 瑞2，魏思敏2*

1. 長安大學理學院，陜西 西安 710064 2. 陜西中醫(yī)藥大學，陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育），陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083

使用單味藥渣綠色合成納米銀，研究生物合成參數(shù)對納米銀生成、粒徑及多分散性的影響；研究合成的納米銀理化性質(zhì)、抗癌活性及作用機制。使用腫節(jié)風藥渣在超聲條件下合成納米銀，紫外可見光譜監(jiān)測納米銀生成和生長，激光粒度儀和透射電鏡表征納米銀的組成、粒徑、分散性、表面性質(zhì)和形貌，MTT法檢測抗癌活性，流式細胞技術(shù)測納米銀內(nèi)吞作用，2′,7′-二氯熒光素-二乙酸酯染色法檢測活性氧物質(zhì)。pH 7.0、腫節(jié)風藥渣提取液-AgNO32∶1、反應(yīng)時間4.0 h時生成效率最高；pH 10.0、物料比1∶1或pH 7.0、物料比2∶1時能獲得粒徑為34 nm左右的納米銀，但堿性條件影響納米銀的分散性；物料比1∶1時可獲得分散性最好的納米銀，多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.20。pH 7.0、物料比2∶1、反應(yīng)時間2.0 h時生成的納米銀呈近球形，粒徑在20～30 nm，以單分散形式存在，為六方晶型結(jié)構(gòu)，表面帶負電荷，ζ電勢?22.2 mV，1個月內(nèi)保持穩(wěn)定，對人肝癌HepG2細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為44.2 μg/mL，該方法合成的納米銀可被細胞攝入并在細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)。使用單味中藥腫節(jié)風藥渣可綠色合成納米銀，生物合成參數(shù)對納米銀形成、粒徑及多分散性影響較大；制得的納米銀有強體外抗癌活性，可能通過產(chǎn)生活性氧物質(zhì)破壞細胞組織或DNA等殺死癌細胞。

納米銀；單味中藥；藥渣；綠色合成；生物合成參數(shù)；抗癌活性；活性氧物質(zhì)

納米銀（silver nanoparticles）具有獨特的光、電、磁及比表面大等特性，被廣泛用于催化、防靜電材料、低溫超導(dǎo)材料、電子漿料、生物傳感和醫(yī)藥領(lǐng)域[1-2]；且以納米銀為材料的導(dǎo)電薄膜具有高透明、可彎曲折疊和拉伸特性，在折疊屏手機生產(chǎn)制造中也有重要應(yīng)用，因此其制備方法備受關(guān)注[3-7]。近年來植物提取液、細菌、真菌和生物聚合物均被用于合成納米銀，即生物還原法；由于該方法綠色節(jié)能，制得納米銀生物活性多樣、毒性低，已引起研究人員極大興趣。迄今，多種植物已被用于合成納米銀，比如櫻桃[8]、咖啡樹[9]、馬齒莧[10]、蓮藕[11]、薄荷[12]、荷花[13]等。

根據(jù)文獻報道[14]，植物中包含的萜類、黃酮類、酮類、醛類等生物分子既作為還原劑使Ag+轉(zhuǎn)變?yōu)锳g，又作為保護劑吸附在納米銀的表面防止納米銀團聚，此外還可以降低納米銀的毒性。有研究顯示，如果植物提取液中包含的物質(zhì)生物活性較強，協(xié)同效應(yīng)使其制得的納米銀也具有較強生物活性[14]。因此，利用中藥綠色合成納米銀是該領(lǐng)域目前研究的熱點[15]。本課題組在近期利用沙棘[16]、大棗[17]、山茱萸[18-20]等成功制備了具有生物活性的納米銀。

然而，中藥資源作為我國重要的戰(zhàn)略資源，其開發(fā)利用面臨“入不敷出”的狀態(tài)，資源相對匱乏[21]，限制了中藥在綠色合成納米銀領(lǐng)域的應(yīng)用。文獻證實[22]，中藥渣中殘留有大量生物堿、黃酮類、脂肪、多糖、蛋白質(zhì)和氨基酸等成分。

本課題組前期利用八正合劑[23]和銀翹解毒合劑藥渣[24]成功制備了具有生物活性的納米銀，這些實驗結(jié)果充分說明，中藥渣可作為中藥替代物用于綠色合成納米銀。然而，八正合劑和銀翹解毒合劑屬于復(fù)方藥物，藥渣為多味藥的混合藥渣，藥渣混合的均勻程度會對納米銀的制備產(chǎn)生影響。使用單味藥渣可以避免該問題，因此，本實驗擬采用腫節(jié)風藥渣制備納米銀。

腫節(jié)風是一種常見的中藥，為金粟蘭科草珊瑚屬植物草珊瑚(Thunb.) Nakai的全株，具有清熱涼血、活血消斑、祛風通絡(luò)的功效，可用于治療肺炎、闌尾炎、蜂窩組織炎、風濕痹痛、跌撲損傷、腫瘤等諸多疾病[25]?；瘜W成分分析顯示，腫節(jié)風主要包含倍半萜、香豆素、黃酮和皂苷等物質(zhì)[25]。腫節(jié)風藥渣成分穩(wěn)定、易于獲得。本實驗以腫節(jié)風藥渣為原材料，通過將其中殘留的活性成分提取并作為還原劑和保護劑，在室溫超聲條件下將Ag+還原制備納米銀；并研究納米銀的體外抗癌活性，初步揭示其抗癌機制。該研究結(jié)果可有效克服中藥渣綠色合成納米銀時混合藥渣穩(wěn)定性差的缺點，有望促進中藥渣在綠色合成納米銀領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2600型紫外-可見分光光度計，島津（日本）公司；ZEN 3600激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；JEM-2100 Plus型透射電子顯微鏡，日本JEOL公司；Thermo Multiskan GO多功能酶標儀，美國Thermo公司；BD FACS Canto流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 試劑

硝酸銀（質(zhì)量分數(shù)＞99%）、胰蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、瓊脂粉均為分析純，購于成都科隆化學品有限公司；2′,7′-二氯熒光素-二乙酸酯購于Sigma- Aldrich公司；MTT試劑盒、青霉素/鏈霉素雙抗購于北京索萊寶科技有限公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購于Biological Industries公司；腫節(jié)風藥渣由陜西中醫(yī)藥大學制藥廠生產(chǎn)咽炎清丸（國藥準字：Z20090559，批號18E01）時產(chǎn)生。人肝癌HepG2細胞從中國科學院細胞庫購買。

2 方法與結(jié)果

2.1 腫節(jié)風藥渣水提液的制備

準確稱取干燥腫節(jié)風藥渣5.0 g，粉碎過300目篩后得粉末，隨后加入100 mL超純水超聲提取4.0 h，濾過得濾液，備用。經(jīng)測定腫節(jié)風藥渣水提液原液pH約為7.0。

2.2 腫節(jié)風藥渣水提液制備納米銀

取5.0 mL腫節(jié)風藥渣水提液（原液），加入10 mmol/L的AgNO3溶液5.0 mL，室溫超聲（60 kHz，400W）；制備條件篩選實驗中，提取液pH使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)；反應(yīng)過程中使用紫外-可見光譜監(jiān)測納米銀生成。待反應(yīng)完成后取反應(yīng)懸浮液，10 000 r/min離心10 min（離心半徑13.5 cm），棄上清液取沉淀，用超純水洗滌3次，收集沉淀，冷凍干燥12 h至恒定質(zhì)量得納米銀。

2.2.1 生物合成參數(shù)對納米銀生成的影響 使用5.0 mL腫節(jié)風藥渣水提液原液（pH 7.0）與5.0 mL AgNO3（10 mmol/L）在室溫超聲條件下反應(yīng)，反應(yīng)2.0 h后，反應(yīng)混合液由淡黃色變?yōu)樯詈稚砻鞣磻?yīng)混合液中生成納米銀，腫節(jié)風藥渣水提液原液可以還原Ag+制備納米銀。因為納米銀在400～500 nm有等離子體共振吸收峰（SPR）[26-27]，且腫節(jié)風藥渣水提液和AgNO3在300 nm后沒有明顯吸收[18]，所以可通過紫外-可見吸收（UV-Vis）光譜實驗確認納米銀生成。如圖1-A所示，經(jīng)過2.0 h反應(yīng)后，腫節(jié)風藥渣水提液原液在300 nm后仍沒有吸收，但是反應(yīng)混合液卻具有強吸收，吸收最大峰位于421 nm，與文獻報道的納米銀SPR吸收峰一致，因此可以確定反應(yīng)混合液中生成納米銀。

根據(jù)文獻報道[28-29]，生物合成參數(shù)對納米銀的生成效率、粒徑以及分散性有影響，所以首先評價生物合成參數(shù)對還原反應(yīng)效率的影響。如圖1-A所示，將反應(yīng)液pH由7.0變至9.0，反應(yīng)混合液在420 nm附近的吸收峰強度逐漸減少，最大吸收峰位置從421 nm藍移至401 nm。反應(yīng)混合液吸收強度變化表明，隨著反應(yīng)液pH增加，體系中生成納米銀的數(shù)量減少；最大吸收峰移動可能源于不同pH值下生成的納米銀粒徑不同。隨后，將反應(yīng)液pH升高至10.0發(fā)現(xiàn)，吸收峰強度雖然有所增強，但最大吸收峰（371 nm）處的強度小于pH 7.0時的強度，并且吸收峰變寬，同時在500 nm附近出現(xiàn)1個弱肩峰。吸收峰變寬及出現(xiàn)肩峰可能源于各向異性納米銀生成或聚集體產(chǎn)生[30]?？梢钥闯?，反應(yīng)液pH對還原反應(yīng)影響較大，單位時間內(nèi)，中性條件（pH 7.0）時生成納米銀最多。

圖1 不同pH值 (A)、物料比(B)、反應(yīng)時間(C)下反應(yīng)混合液的紫外-可見吸收光譜

接著，在pH 7.0，室溫超聲反應(yīng)1.0 h的條件下，使用不同體積比的腫節(jié)風藥渣提取液與硝酸銀（10 mmol/L）評價物料比對還原反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1-B所示?？梢钥闯?，隨著反應(yīng)混合液中腫節(jié)風藥渣提取液量增加，混合液在420 nm附近的吸收峰強度逐漸增加，最大吸收峰從438 nm藍移至407 nm。這表明，1.0 h內(nèi)物料比為2∶1時生成的納米銀最多，不同物料比導(dǎo)致生成納米銀的粒徑有差異。

最后，在pH 7.0，腫節(jié)風藥渣提取液-AgNO32∶1時評價反應(yīng)時間對還原反應(yīng)效率的影響。從圖1-C看出，反應(yīng)初始時刻（0.5 h）420 nm附近就有強吸收；反應(yīng)4.0 h后，420 nm附近吸收峰強度達到最大；不同反應(yīng)時間時最大吸收峰位置稍有不同。表明反應(yīng)4.0 h時還原反應(yīng)已經(jīng)完成，反應(yīng)時間對生成的納米銀粒徑有影響。綜合以上實驗數(shù)據(jù)看出，在pH 7.0，腫節(jié)風藥渣提取液-AgNO32∶1時反應(yīng)效率最高，該條件下進行4.0 h還原反應(yīng)即可完成。

2.2.2 生物合成參數(shù)對納米銀平均粒徑的影響 使用動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）測量納米銀平均粒徑，評價生物合成參數(shù)對納米銀粒徑的影響。從表1可以看出，在腫節(jié)風藥渣提取液- AgNO31∶1時，反應(yīng)液pH值及反應(yīng)時間對生成的納米銀粒徑均有影響，但是反應(yīng)相同時間，在pH 10.0時生成的納米銀粒徑最?。ǔ?.0 h），這與UV-Vis吸收光譜觀測到的結(jié)果一致，也與文獻報道的堿性條件下生成的納米銀粒徑較小的結(jié)論一致[12]。在pH 10.0，反應(yīng)3.0 h后得到的納米銀粒徑最小，為（34.9±0.6）nm。此外，在pH 8.0和9.0，反應(yīng)初始時刻（1.0 h）生成的納米銀粒徑較大，這可能源于AgNO3在體系中分布不均勻，導(dǎo)致局部濃度較大使生長速度大于成核速度。

表2展示了pH 7.0時，不同物料比在反應(yīng)不同時間后生成納米銀的平均粒徑分布。由表可知，在相同反應(yīng)時間內(nèi)，腫節(jié)風藥渣提取液-AgNO32∶1時生成納米銀的粒徑較小（除3.0和4.0 h）。在腫節(jié)風藥渣提取液-AgNO32∶1，反應(yīng)2.0 h時得到的納米銀平均粒徑為（34.0±0.7）nm。稍小于pH 10.0，反應(yīng)3.0 h后得到的納米銀粒徑。

表1 不同pH值和反應(yīng)時間時合成的納米銀平均粒徑分布(提取液-AgNO3 1∶1)

Table 1 Average size of biosynthesized AgNPs under different pH values and incubation time (extract-AgNO3 1∶1)

pH值平均粒徑/nm 1 h2 h3 h4 h5 h 7.054.8±0.365.7±1.047.0±0.348.8±0.347.4±0.4 8.064.0±1.948.2±1.048.4±0.548.5±0.948.1±0.5 9.063.2±1.348.6±1.448.8±1.142.6±1.849.2±0.5 10.048.8±0.640.2±1.134.9±0.654.9±1.044.4±0.6

表2 不同提取液-AgNO3比例和反應(yīng)時間時合成的納米銀平均粒徑分布(pH 7.0)

Table 2 Average size of biosynthesized AgNPs under different material ratios and incubation time (pH 7.0)

提取液-AgNO3平均粒徑/nm 1 h2 h3 h4 h5 h 2∶139.9±2.334.0±0.753.7±1.845.1±1.642.1±1.2 1∶154.8±0.365.7±1.047.0±0.348.8±0.347.4±0.4 1∶249.8±3.545.5±0.645.7±1.143.0±1.049.9±1.2 1∶1077.8±2.271.1±5.865.9±6.388.2±2.455.0±1.8

2.2.3 生物合成參數(shù)對納米銀多分散性的影響 納米粒子的多分散性會影響其理化性質(zhì)，根據(jù)文獻報道[31]，當納米粒子的多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）小于0.3時，納米粒子具有好的分散性。所以，使用DLS對不同生物合成參數(shù)下合成的納米銀PDI進行測量。表3展示了物料比1∶1時不同pH值和反應(yīng)時間合成的納米銀PDI。由表3可知，隨著反應(yīng)液pH逐漸增加，PDI有變大趨勢。表明在較高pH時合成的納米銀分散性相對較差，與UV-Vis吸收光譜上觀測到的結(jié)果一致。在pH 7.0，反應(yīng)時間3.0 h時PDI最小，為0.20±0.01。在pH 7.0時，考察不同物料比及反應(yīng)時間對納米銀分散性的影響。

如表4所示，反應(yīng)液中腫節(jié)風藥渣提取液濃度增大到1∶1時得到的納米銀分散性最好；繼續(xù)增加腫節(jié)風藥渣提取液濃度至2∶1不會得到分散性更好的納米銀，這可能是由于體系中單位體積內(nèi)生成的納米銀太多導(dǎo)致。

在pH 7.0，腫節(jié)風藥渣提取液-AgNO32∶1，反應(yīng)時間1.0 h時，考察溫度對納米銀生成效率、粒徑和多分散性的影響，發(fā)現(xiàn)升高溫度可促進納米銀生成，但是3次平行實驗測量發(fā)現(xiàn)平均粒徑［（60.0± 0.4）nm］和PDI（0.43±0.01）會增大，所以選取室溫作為反應(yīng)溫度。

表3 不同pH值和反應(yīng)時間時合成的納米銀PDI(提取液- AgNO3 1∶1)

Table 3 PDI of biosynthesized AgNPs under different pH and incubation time (extract-AgNO3 1∶1)

pH值PDI 1 h2 h3 h4 h5 h 7.00.27±0.010.33±0.030.20±0.010.21±0.010.20±0.01 8.00.40±0.020.25±0.010.25±0.010.25±0.010.26±0.01 9.00.48±0.010.45±0.010.44±0.020.40±0.020.45±0.01 10.00.37±0.010.39±0.010.35±0.040.41±0.010.28±0.01

表4 不同提取液-AgNO3比例和反應(yīng)時間時合成的納米銀PDI(pH 7.0)

Table 4 PDI of biosynthesized AgNPs under different material ratio and incubation time (pH 7.0)

提取液-AgNO3PDI 1 h2 h3 h4 h5 h 2∶10.40±0.030.36±0.040.45±0.010.46±0.010.43±0.02 1∶10.27±0.010.33±0.030.20±0.010.21±0.010.20±0.01 1∶20.39±0.020.38±0.010.37±0.020.29±0.030.38±0.01 1∶100.44±0.050.37±0.040.49±0.060.48±0.020.41±0.04

2.2.4 最佳工藝參數(shù)的確定及驗證 最終，通過綜合評價生物合成參數(shù)對納米銀生成效率、平均粒徑及多分散性的影響，結(jié)合文獻報道的納米銀生物活性與其粒徑大小相關(guān)等信息，確定最佳工藝參數(shù)為pH 7.0，腫節(jié)風藥渣提取液-AgNO32∶1，反應(yīng)2.0 h。

另取3批不同生產(chǎn)批次的腫節(jié)風藥渣在最佳工藝參數(shù)時反應(yīng)，合成的納米銀平均粒徑基本相同，分別為（33.5±0.5）、（34.0±0.2）、（34.1±0.4）nm。

2.3 納米銀的表征

使用JEM-2100 Plus型透射電子顯微鏡（TEM）表征納米銀的粒徑、形貌；高分辨TEM（HRTEM）和選區(qū)電子衍射（SAED）表征晶型。

對最佳工藝參數(shù)下合成的納米銀平均粒徑、形貌、分散性、晶型以及表面性質(zhì)和穩(wěn)定性等進行表征。使用能量色散X射線光譜儀（EDX）對腫節(jié)風藥渣合成的納米銀進行表征，結(jié)果如圖2-A所示。由圖看出，在3 keV附近有大量的銀元素峰，證實合成的粒子為納米銀；此外，在8 keV處觀察到很強的Cu元素峰，這主要由載樣的銅網(wǎng)導(dǎo)致。

使用TEM對納米銀形貌進行表征。由圖2-B看出納米銀呈近球形；粒徑分布在20～30 nm，與DLS得到的平均粒徑［（34.0±0.7）nm，圖2-C］一致；以單分散形式存在。

通過選區(qū)電子衍射（SAED）和高分辨TEM（HRTEM）表征納米銀晶型（圖2-D、E）。從SAED圖上觀察到3個明顯的環(huán)，值為0.219 4、0.138 4、0.115 2 nm，分別對應(yīng)六方晶型（Hexagonal）結(jié)構(gòu)納米銀的（1, ?1, 2）、（1, 1, 2）和（2, 0, 3）晶面。表明使用腫節(jié)風藥渣合成的納米銀為六方晶型結(jié)構(gòu)。此外，HRTEM測得的晶格條紋參數(shù)為0.256 5 nm，歸屬為（0, 0, 4）晶面，進一步證實合成的納米銀為六方晶型結(jié)構(gòu)。

采用DLS表征納米銀表面性質(zhì)，測量得到ζ電勢為?22.2 mV（圖2-F），表明合成的納米銀表面吸附的物質(zhì)帶負電荷，這些物質(zhì)可能為倍半萜、香豆素、黃酮和皂苷等[25]。

有研究顯示，如果納米銀的ζ電勢大于25.0 mV或者小于?25.0 mV，因為同種電荷之間的排斥作用，納米銀有較好的穩(wěn)定性。本實驗合成的納米銀ζ電勢接近?25.0 mV，因此可預(yù)期其好的穩(wěn)定性。實際上，將合成的納米銀放置1個月后其平均粒徑并未發(fā)現(xiàn)明顯變化［（35.2±0.6）nm］，也證實納米銀具有良好的穩(wěn)定性。

圖2 納米銀的能譜(A)、TEM (B)、平均粒徑(C)、選區(qū)電子衍射(D)、高分辨TEM(E)、ζ電勢(F)

2.4 納米銀的抗癌活性

將納米銀配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，加入HepG2細胞系培養(yǎng)24 h。利用MTT法測量490 nm處的吸收強度，根據(jù)公式計算細胞存活率。

細胞存活率＝(－b)/(0－b)

為納米銀＋細胞吸光度，b為DMSO吸光度，0為細胞吸光度

如圖3所示，在一定范圍內(nèi)，HepG2的存活率與納米銀質(zhì)量濃度相關(guān)。當加入10.0 μg/mL納米銀后，HepG2細胞的存活率下降至78%，顯示出抑制癌細胞增長的效果。當納米銀質(zhì)量濃度增大至50.0 μg/mL后，HepG2細胞的存活率只有14%。繼續(xù)增大納米銀質(zhì)量濃度至100.0 μg/mL，HepG2細胞的存活率略降至10%。使用GraphPad Prism 8.0程序包擬合得納米銀對HepG2癌細胞系的半數(shù)抑制濃度（IC50）為44.22 μg/mL。

對不同質(zhì)量濃度納米銀處理后的HepG2細胞形態(tài)學進行研究（圖4）。從圖4看出，HepG2細胞（0 μg/mL）形態(tài)規(guī)則、狀態(tài)良好，呈網(wǎng)狀分布；當加入20 μg/mL的納米銀后，有部分細胞皺縮變圓，從網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中脫離，可能是細胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞使細胞間的突觸折斷導(dǎo)致；同時，在細胞內(nèi)部觀測到大量納米銀；增大納米銀質(zhì)量濃度至40 μg/mL后，皺縮變圓且從網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中脫離的HepG2細胞數(shù)量明顯增加，表明HepG2癌細胞更大范圍死亡；當加入納米銀質(zhì)量濃度超過IC50時，視野范圍內(nèi)很難觀測到狀態(tài)良好的HepG2細胞。該結(jié)果與MTT實驗結(jié)果一致。

圖3 納米銀對HepG2細胞的抑制作用

圖4 不同質(zhì)量濃度納米銀處理后HepG2細胞的形態(tài) (圖像放大倍數(shù)4)

本實驗使用腫節(jié)風藥渣合成的納米銀抗癌活性與傳統(tǒng)中藥，比如紅葉莧（HeLa 51 μg/mL）[32]和山茱萸（HCT116 20.68 μg/mL，HepG2 69.72 μg/mL）等[18]基本一樣，表明使用腫節(jié)風藥渣合成的納米銀可以作為潛在的抗腫瘤藥物。

2.5 納米銀抗癌機制初步探索

2.5.1 HepG2細胞對納米銀的內(nèi)吞作用 通過流式細胞分析研究癌細胞對納米銀的內(nèi)吞作用。將癌細胞種植在6孔板中，加入40 μg/mL納米銀培養(yǎng)12 h，然后使用流式細胞儀進行分析，激發(fā)光波長為488 nm。數(shù)據(jù)使用FlowJo 7.6.1程序包處理。

根據(jù)文獻報道[33]，納米銀會進入細胞，然后通過氧化應(yīng)激等機制殺死細胞，所以為了初步揭示腫節(jié)風藥渣合成的納米銀抗癌機制，首先研究HepG2細胞對納米銀的內(nèi)吞作用。研究顯示[34]，將細胞暴露在納米粒子中時，光散射信號可以提供細胞攝取納米粒子的信息。當納米粒子進入細胞后，其在細胞內(nèi)的密度會增大，從而導(dǎo)致光散射信號增加。一般使用波長為488 nm的激光激發(fā)細胞后通過流式細胞儀探測激光垂直方向上光散射的信號（side scattering channel，SSC），用于評價細胞對納米粒子的攝取水平。對納米銀處理后的HepG2細胞進行流式細胞分析，結(jié)果如圖5-A、B所示。由圖可知，與空白組相比較，加入40 μg/mL納米銀后，細胞SSC值從1.86%增加到4.08%。表明利用腫節(jié)風藥渣合成的納米銀可以進入HepG2細胞，與觀察細胞形態(tài)得出的結(jié)論一致。

2.5.2 活性氧物質(zhì)的測量 納米銀處理HepG2細胞后活性氧物質(zhì)（ROS）含量采用2′,7′-二氯熒光素-二乙酸酯（DCFH-DA）染色法檢測。DCFH-DA是非極性化合物，能夠迅速擴散到細胞內(nèi)；當其進入細胞后會與酯裂解酶作用脫去乙?；蒁CFH，DCFH會被細胞內(nèi)的活性氧物質(zhì)氧化生成DCF；DCF是綠色熒光分子，使用485 nm激光激發(fā)后在530 nm處具有強發(fā)光。因此可以使用熒光顯微鏡直接觀察體系中活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生。將20.0、40.0 μg/mL納米銀加入HepG2細胞培養(yǎng)24 h，用無血清的培養(yǎng)基清洗細胞，然后加入10.0 μmol/L的DCFH- DA在37 ℃培養(yǎng)20 min。

如圖6所示，隨著體系中納米銀質(zhì)量濃度增加，細胞內(nèi)產(chǎn)生的綠色熒光物質(zhì)DCF量逐漸增加，表明體系中產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)增加。該結(jié)果證實，納米銀處理后的HepG2細胞內(nèi)產(chǎn)生了活性氧物質(zhì)，且體系中產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)在一定范圍內(nèi)與加入的納米銀濃度呈正比。由此推測，使用本實驗合成的納米銀處理HepG2細胞后，癌細胞死亡可能源于活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生。

圖5 0 (A)、40μg?mL?1 (B) 納米銀處理后HepG2細胞對納米銀的內(nèi)吞作用

圖6 DCFH-DA染色監(jiān)測不同質(zhì)量濃度納米銀處理24.0 h后HepG2細胞內(nèi)的活性氧含量(圖像放大倍數(shù)4)

3 討論

本實驗通過使用腫節(jié)風藥渣提取液作為還原劑和保護劑，以AgNO3為銀源，在室溫超聲條件下成功合成了納米銀；此方法有效改善了前期使用復(fù)方中藥渣綠色合成納米銀時原材料組分不穩(wěn)定的缺點。使用該方法合成的納米銀粒徑分布在20～30 nm，分散狀態(tài)良好，穩(wěn)定性高，有望被發(fā)展成為一種綠色制備納米銀的方法。此外，抗癌活性研究表明，該方法獲得的納米銀具有抗癌活性，這為此方法的推廣應(yīng)用提供了保障?？拱C理的研究雖然在一定程度上反映了納米銀與癌細胞的相互作用機制，但是因為納米粒子與癌細胞的作用機制很復(fù)雜，想要全面揭示該方法合成的納米銀與HepG2細胞的相互作用機制還需要進一步的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Green synthesis of silver nanoparticles usingherb residues and anticancer activity

WANG Ying-hui1, ZOU Tai-yan2, SU Rui2, WEI Si-min2

1. College of Science, Chang’an University, Xi’an 710064, China 2. State Key Laboratory of Research & Development of Characteristic Qin Medicine Resources (Cultivation)/Shaanxi Innovative Drug Research Center, Co-construction Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine Resources Industrialization by Shaanxi & Education Ministry, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712083, China

To develop a novel method to biosynthesize silver nanoparticles (AgNPs) by using the extractof single Chinese herbal waste to overcome the difficulty in obtaining raw materials. To evaluate the effect of biosynthesis parameters on the formation of AgNPs, average size and polydispersity, and investigating the anticancer activity.The formation of AgNPs was monitored by UV-visible spectroscopy; The average size, polydispersity, surface and morphology features of AgNPs were characterized by laser granularity analyzer and transmission electron microscopy; The anticancer activity of AgNPs were evaluated by MTT assay. The internalization of AgNPs inside HepG2 cancer cell line was determined by flow cytometric analysis. Reactive oxygen species (ROS) were measured by 2′,7′-dichlorofluorescein-diacetate staining.By using the extract ofherb residues, AgNPs could be prepared at ambient temperature under ultrasonic radiation. Biosynthesis of AgNPs- AgNO32∶1 at pH 7.0 would have the maximum efficiency. The AgNPs with small average size could be obtained at pH 10.0, extract-AgNO31∶1 or pH 7.0, extract-AgNO32∶1. But the AgNPs with superior polydispersity could be prepared under extract- AgNO32∶1. TEM, HRTEM and SAED characterization revealed that AgNPs (pH 7.0; material proportion 2∶1; 2.0 h) had a hexagonal structure, spherical shape with an average size of (34.0 ± 0.7) nm and existed in monodispersed form. The ζ potential of as-prepared AgNPs was ?22.2 mV. The biosynthesized AgNPs displayed potent toxic effects against HepG2 cancer cell line with IC5044.2 μg/mL. The AgNPs as-prepared revealed significant uptake into cancer cell and could produce reactive oxygen species in HepG2 cancer cell lines.The extract ofresidues could be used to synthesize AgNPs at ambient temperature; The biosynthesis parameters have significant effects on the generation, average size and polydispersity of AgNPs; The biosynthesized AgNPs have potent anticancer activity, which may originate from the formation of ROS.

silver nanoparticles; single Chinese herbal; the residues of Chinese herbal medicine; green synthesis; biosynthesis parameter; anticancer activity; reactive oxygen species

R283.6

A

0253 - 2670(2022)07 - 1964 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.005

2021-10-08

國家自然科學基金資助項目（22103007）；陜西省高?？茀f(xié)青年人才托舉計劃（20190307）；陜西省教育廳重點科研計劃（21JY009）；陜西省重點研發(fā)項目（2019SF-082）；陜西省教育廳自然科學研究項目（19JK0233）

王英輝（1989—），男，博士，講師，從事納米材料的合成與表征研究。E-mail: wangyinghui@chd.edu.cn

魏思敏（1989—），女，碩士生導(dǎo)師，副教授，從事納米材料的合成與表征研究。E-mail: weismiccas@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]