表觀遺傳修飾劑線性肟酸對(duì)樺褐孔菌三萜合成的影響

趙艷霞，周 蓉，孫夢(mèng)妮，袁雯雯，鄭維發(fā)

表觀遺傳修飾劑線性肟酸對(duì)樺褐孔菌三萜合成的影響

趙艷霞，周 蓉，孫夢(mèng)妮，袁雯雯，鄭維發(fā)*

江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116

三萜類化合物是藥用真菌樺褐孔菌產(chǎn)生的主要次生代謝產(chǎn)物之一，但其在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下積累量較少。旨在研究組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）活性抑制劑線性肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）對(duì)樺褐孔菌三萜合成的調(diào)控。液體搖瓶發(fā)酵法培養(yǎng)樺褐孔菌，并在培養(yǎng)液中添加SAHA。采用熒光定量PCR測(cè)定三萜合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平，香草醛-高氯酸法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)和發(fā)酵液中三萜的含量。SAHA的添加提高了樺褐孔菌體內(nèi)編碼3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶、3-羥基-3-甲基戊二單酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、二磷酸酯脫羧酶、角鯊烯合成酶和羊毛甾醇合成酶等基因的表達(dá)水平。SAHA顯著提高了樺褐孔菌菌絲體內(nèi)和發(fā)酵液中三萜的積累量。SAHA誘導(dǎo)下樺褐孔菌菌絲體內(nèi)三萜積累量達(dá)（66.4±5.24）mg/g，明顯高于對(duì)照組[（22.7±3.3）mg/g]，并且胞外三萜的含量由對(duì)照組的（30.5±2.7）mg/L提高至（49.3±3.8）mg/L。此外，經(jīng)SAHA處理后樺褐孔菌胞內(nèi)三萜清除自由基的能力顯著提高。SAHA可以作為調(diào)節(jié)因子激發(fā)樺褐孔菌液體培養(yǎng)條件下三萜類化合物的積累。

樺褐孔菌；三萜；組蛋白去乙?；?；線性肟酸；自由基

樺褐孔菌屬于藥用擔(dān)子真菌，可以合成黑色素[1]、多酚[2]和三萜[3]等次級(jí)代謝產(chǎn)物。三萜類化合物具有抑制腫瘤、抗菌、抗病毒和鎮(zhèn)痛等作用[3-4]，對(duì)癌肉瘤Walker-256細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和皰疹病毒具有顯著的抑制作用[5]。樺褐孔菌合成的三萜類化合物主要有3-羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、羊毛甾醇、3β-羥基-羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、白樺脂醇、樺褐孔菌醇、栓菌酸、3β,21-二羥基-羊毛甾-8,24-二烯、齊墩果酸、烏蘇酸、白樺脂酸、樺褐孔菌素A、樺褐孔菌萜D、3β-乙酰氧基-11α,12α-環(huán)氧-齊墩果烷- 28,13β-內(nèi)酯等[6]，該類化合物對(duì)肺癌人類肺泡基底上皮A549細(xì)胞、結(jié)直腸腺癌HT29細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞和小鼠白血病L1210細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞具有毒性[7]，對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞株和MCF-7細(xì)胞的具有毒性[8]。然而，樺褐孔菌在自然界中生長(zhǎng)緩慢，不能作為三萜類化合物的主要來(lái)源。其在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)繁殖速度比較快，但是次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因處于沉默或者低表達(dá)狀態(tài)[9]，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下三萜類化合物積累量較低。

生物體三萜類化合物主要通過(guò)甲戊二羥酸途徑合成[10]。其中3-羥基-3-甲基戊二單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）是催化異戊二烯生物合成，角鯊烯合成酶（squalene synthase，SS）催化從異戊二烯途徑到甾醇和三萜生物合成[10]。羊毛甾醇合成酶（lanosterol synthase，LS）催化2,3-氧雜質(zhì)量烯環(huán)化形成羊毛甾烷[9]。目前本實(shí)驗(yàn)室對(duì)ATCC 22881的全基因組進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)合Narimene等[9]發(fā)表的文章，發(fā)現(xiàn)L.中編碼3-羥基-3-甲基戊二單酰輔酶A合成酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS）、HMGR、甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase，MK）、二磷酸酯脫羧酶（diphosphomevalonate decarboxylase，DPMD）、和等基因參與三萜類化合物的合成。生物體內(nèi)基因表達(dá)水平受表觀遺傳調(diào)控。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)修飾、基因表達(dá)調(diào)控和次級(jí)代謝產(chǎn)物積累發(fā)揮著重要的作用[11-12]。組蛋白的乙?；欣贒NA與組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞核內(nèi)，組蛋白乙酰化與組蛋白去乙酰化過(guò)程處于動(dòng)態(tài)平衡，并由組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）共同調(diào)控。HAT將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上，HDAC使組蛋白去乙?；c帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合，染色質(zhì)致密卷曲，基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制[13]。研究表明，HDAC可以調(diào)節(jié)黃曲霉中黃曲霉毒素B1（AFB1）的積累[12]，稻瘟病菌和亞洲鐮刀菌中hda1型組蛋白去乙酰酶的缺失能增加代謝物的產(chǎn)生[14]。線性肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）是HDAC的抑制劑，SAHA通過(guò)結(jié)合到酶的活性位點(diǎn)抑制HDAC的活性。據(jù)報(bào)道，SAHA可以改變次級(jí)代謝產(chǎn)物的組成[15]，SAHA的處理可以增加中抗炎環(huán)肽的合成[16]。然而，組蛋白乙?；揎検欠裼绊憳搴挚拙祁惢衔锖铣上嚓P(guān)基因的轉(zhuǎn)錄尚不確定。本實(shí)驗(yàn)中研究了SAHA對(duì)樺褐孔菌三萜類化合物積累量和相關(guān)合成基因的影響。研究結(jié)果將為提高藥用真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因的表達(dá)水平從而提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 供試菌株

樺褐孔菌（ATCC22881）購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，現(xiàn)保存于江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。樺褐孔菌液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖（2%）、蛋白胨（0.35%）、酵母提取物（2%）、KH2PO4（0.01%）、MgSO4·7H2O（0.05%）。培養(yǎng)溫度為26 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min。SAHA（批號(hào)149647-78-9）購(gòu)買于Sigma公司。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀（SYNERGY2，美國(guó)BioTek公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（StepOnePlus，美國(guó)Applied Biosystems公司），離心機(jī)（Eppendorf 5418，德國(guó)Eppendorf有限公司），閃式提取器（ZHBE-50T，河南金鼎科技發(fā)展有限公司）。

2 方法

2.1 樺褐孔菌的培養(yǎng)

將樺褐孔菌接種在PDA培養(yǎng)基中，于26 ℃培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)接到含有80 mL培養(yǎng)液的250 mL的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在無(wú)菌條件下收集菌絲體，勻漿后接種到含有150 mL培養(yǎng)液的500 mL的三角瓶中培養(yǎng)2 d后，向培養(yǎng)液中添加SAHA，使培養(yǎng)液中SAHA的濃度為200 μmol/L。以未添加SAHA的樺褐孔菌培養(yǎng)物為對(duì)照組。每天取樣備用。

2.2 基因表達(dá)水平的測(cè)定

采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)樺褐孔菌合成三萜類化合物相關(guān)基因的表達(dá)水平。菌絲體經(jīng)液氮研磨后利用Trizol（Takara公司，日本）法提取RNA，采用DnaseI去除基因組DNA的污染（New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA，美國(guó)）。然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA （Takara公司，日本）。使用SYBR?Green Supermix（Roche）進(jìn)行qRT-PCR，相關(guān)引物見表1。以β-肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)參基因，以未添加SAHA的培養(yǎng)物中靶基因的表達(dá)值為對(duì)照，用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平[17]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每組樣品均做3個(gè)生物重復(fù)。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物名稱引物序列（5’-3’）目的 qhmgs FAGACCTTCGTAGCAGTTGCChmgs轉(zhuǎn)錄水平 qhmgs RTGTAGAACGAGGAAGCGCAG qhmgr FGAGCCAACGAATGATGACGChmgr轉(zhuǎn)錄水平 qhmgr RAGCGCGGAAAGCAAAGAAAG qmk FCTTCCAGTCTGAGGGTGCAGmk轉(zhuǎn)錄水平 qmk RACGAGGAGATCCGAGGTTCA qdpmd FTCCGTTCGACGACTACCTCTdpmd轉(zhuǎn)錄水平 qdpmd RTGTACGAGGCGATATGCACG qss1FCGAATTCGACTGCGTCGTTCss1轉(zhuǎn)錄水平 qss1 RAAGCCAGGGCACTTCCTTAC qss2 FCGAATTCGACTGCGTCGTTCss2轉(zhuǎn)錄水平 qss2 RAAGCCAGGGCACTTCCTTAC qls1 FTGTGCGATACCACCTCTTCGls1轉(zhuǎn)錄水平 qls1 RTACCATTGGGGCCAATCCAC qls2 FCATACCGCTCTCCTGGACACqls2轉(zhuǎn)錄水平 qls2 RTGAAATCTCGGCGCTTCAGT qactin FATGGATCACTTTTCAGAGqactin轉(zhuǎn)錄水平 qactin RTCAACTAACCCGTCTGGG

2.3 三萜類化合物的提取和測(cè)定

利用雙水相超聲法提取樺褐孔菌菌絲體內(nèi)三萜，提取條件為：異丙醇體積濃度40%，硫酸銨質(zhì)量濃度0.125 g/mL，料液比0.9∶1，超聲時(shí)間為35 min[18]。胞外三萜的提?。菏占煌囵B(yǎng)條件下樺褐孔菌的培養(yǎng)液，將入醋酸乙酯進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取3次。收集醋酸乙酯相，濃縮后定容。以在野生型樺褐孔菌中分離純化到的肌醇為對(duì)照品，利用香草醛-高氯酸法[19]測(cè)定樺褐孔菌在不同培養(yǎng)條件下三萜類化合物的積累量。

2.4 三萜抗氧化活性的測(cè)定

利用分光光度計(jì)法測(cè)定樺褐孔菌胞內(nèi)三萜清除超氧陰離子、羥自由基和DPPH的能力。3 mmol/L的鄰苯三酚用于測(cè)定樺褐孔菌三萜類化合物清除超氧陰離子的能力[20]，5 mmol/L的1,10-二氮雜菲用于檢測(cè)清除羥自由基的能力[21]，0.1 mmol/L的1, 1-二苯基-2-苦基肼用于清除DPPH自由基的活性研究[22]。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 三萜類化合物合成基因的表達(dá)水平

樺褐孔菌中編碼HMGS、HMGR、MK、DPMD、SS和LS等基因參與羊毛甾烷型三萜的合成[9]，其含有1個(gè)編碼3-羥基-3-甲基戊二單酰輔酶A合成酶的基因（，GenBank：MK825554），1個(gè)編碼3-羥基-3-甲基戊二單酰輔酶A還原酶的基因（，GenBank：MK825555）、1個(gè)編碼甲羥戊酸激酶的基因（，GenBank：MK825557）、1個(gè)編碼二磷酸酯脫羧酶的基因（，GenBank：MK825558）、2個(gè)編碼角鯊烯合成酶的基因（1，GenBank：MK825564；2。GenBank：MK825565）和兩個(gè)編碼羊毛甾醇合成酶的基因（1，GenBank：MK825567；2，GenBank：MK825568）。本實(shí)驗(yàn)研究了SAHA對(duì)編碼HMGS、HMGR、MK、DPMD，SS和LS基因的表達(dá)水平的影響。分別以對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)水平為1，計(jì)算SAHA處理組基因的表達(dá)水平。由圖1可以發(fā)現(xiàn)，SAHA的添加激發(fā)了、、、、和的表達(dá)水平，其中、、1和1在培養(yǎng)的144 h時(shí)達(dá)最高表達(dá)水平，分別為16.34、6.36、11.08和2.65，、2和2在培養(yǎng)的168 h時(shí)達(dá)最高表達(dá)水平，分別為10.13、7.73和4.08，在培養(yǎng)的192 h達(dá)最高表達(dá)水平為6.51。

3.2 三萜類化合物的積累

SAHA顯著提高了樺褐孔菌細(xì)胞內(nèi)和發(fā)酵液中三萜類化合物的積累。樺褐孔菌在添加SAHA后的24 h至96 h中菌絲體內(nèi)三萜的含量沒有顯著性差異，在培養(yǎng)的120 h開始，添加SAHA組樺褐孔菌菌絲體中三萜的積累量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，培養(yǎng)至192 h時(shí)，對(duì)照組菌絲體內(nèi)三萜的積累量為（22.7±3.3）mg/g，極顯著的低于SAHA添加組中三萜的積累水平（66.4±5.24）mg/g（＜0.001，圖2-A）。在添加SAHA 24 h后，樺褐孔菌細(xì)胞外

圖1 樺褐孔菌培養(yǎng)過(guò)程中SAHA的添加對(duì)hmgs、hmgr、mk、dpmd、ss和ls表達(dá)水平的影響

三萜的含量明顯提高至（11.3±0.8）mg/L，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中三萜的積累水平逐漸升高，培養(yǎng)至192 h時(shí)，三萜的積累量高達(dá)（49.3±3.8）mg/L，極其明顯的高于正常培養(yǎng)條件下發(fā)酵液中三萜的積累量（30.5±2.7）mg/L（＜0.001，圖2-B）。并且經(jīng)5-AC處理后的樺褐孔菌胞內(nèi)多酚清除DPPH自由基、超氧陰離子和羥自由基的能力均顯著性的高于正常培養(yǎng)條件下多酚的清除能力（圖3），推測(cè)是由于樺褐孔菌胞內(nèi)三萜類化合物的組成成分的含量和種類的變化引起其清除自由基能力的變化。可見，SAHA的添加不僅促進(jìn)了三萜類化合物的合成，而且提高了該類化合物的抗氧化活性。

CTR-對(duì)照 SAHA-線性肟酸，下圖同

*P＜0.05 **P＜0.01

4 討論

真菌是天然產(chǎn)物的主要來(lái)源，然而，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下參與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因均處于沉默或低表達(dá)狀態(tài)[9]。表觀遺傳修飾作為激發(fā)劑可以激活基因表達(dá)水平從而提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，誘導(dǎo)新化合物的形成[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在液體發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌的過(guò)程中，SAHA的添加提高了參與三萜合成的基因、、、、和等的表達(dá)水平，促進(jìn)樺褐孔菌菌絲體內(nèi)和發(fā)酵液中三萜類化合物的合成，并且菌絲體內(nèi)三萜類化合物抗氧化能力顯著性的提高。

生物體內(nèi)組蛋白乙?；癄顟B(tài)是動(dòng)態(tài)的，同時(shí)受組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶控制。組蛋白的低乙酰化與異染色質(zhì)形成和基因沉默相關(guān)，組蛋白高乙?；c常染色質(zhì)形成和基因激活有關(guān)[24-25]。利用HDAC的抑制劑調(diào)節(jié)真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成被認(rèn)為是開發(fā)新的真菌天然產(chǎn)物的有效途徑。如SAHA可以調(diào)控乳突葡萄球菌代謝產(chǎn)物的生成并能誘導(dǎo)新化合物的合成[15]，誘導(dǎo)白僵菌產(chǎn)生具有抗炎活性的環(huán)縮肽[16]以及誘導(dǎo)曼陀羅內(nèi)生真菌鐮刀菌酸的合成[26]、芋枝孢霉中新型乙酰甾醇的合成[27]。樺褐孔菌胞內(nèi)三萜類化合物抗氧化活性的增強(qiáng)，說(shuō)明樺褐孔菌胞內(nèi)三萜類化合物組成成分的含量和種類發(fā)生了變化，為此將深入研究表觀遺傳修飾劑對(duì)樺褐孔菌三萜類化合物組成成分的影響，確定樺褐孔菌體內(nèi)抗氧化活性較強(qiáng)的物質(zhì)組成，為進(jìn)一步研究表觀遺傳修飾劑提高樺褐孔菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of epigenetic modifier SAHA on production of triterpenoids in

ZHAO Yan-xia, ZHOU Rong, SUN Meng-ni, YUAN Wen-wen, ZHENG Wei-fa

School of Life Sciences, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116, China

Triterpenoids are one of the major classes of bioactive secondary metabolites produced by medicinal basidiomycete.However, the accumulation of triterpenoids is less under lab culture conditions. The purpose of this study was to investigate the regulation of the histone deacetylase (HDAC) inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) on the biosynthesis of triterpenoids in.was cultured by liquid shake flask in the presence of SAHA. For determining the effects of SAHA on biosynthesis of triterpenoids by, the mRNA expression level of genes encoding 3-hydroxy-3-methyl glutaryl-CoA synthase (HMGS), 3-hydroxy-3-methyl glutary-CoA reductase (HMGR), mevalonate kinase (MK), diphosphomevalonate decarboxylase (DPMD), squalene synthase (SS) and lanosterol synthase (LS) by real-time PCR. For assaying the triterpenoids contents inunder submerged culture conditions, Vanillin- Perchloric Acid Method was used to determine the production of total triterpenoids either in mycelia or in the culture broth.The results showed that the addition of SAHA enhanced the expression levels of,,,,andin. Consistent with the increase of gene expression, the accumulation of total triterpenoids was increased to (66.4 ± 5.24) mg/g for mycelial triterpenoids and (49.3 ± 3.8) mg/L for extracellular triterpenoids, which was obviously higher than (22.7 ± 3.3) mg/g mycelial triterpenoids and (30.5 ± 2.7) mg/L extracellular triterpenoids found in the control cultures. Furthermore, SAHA treatment enhanced the capacity of mycelial triterpenoids to scavenge free radicals.In summary, SAHA can be used as a regulator to stimulate the accumulation of triterpenoids ofunder submerged culture conditions.

; triterpenoids; histone deacetylase; suberoylanilide hydroxamic acid; free radical

R286.2

A

0253 - 2670(2022)07 - 2137 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.024

2021-08-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470173）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31400431）；江蘇師范大學(xué)研究生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2021XKT0752）

趙艷霞（1980—），女，河北衡水，副教授，博士，主要從事藥用真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物研究。Tel: (0516)83403179 E-mail: zhaoyx0318@126.com

鄭維發(fā)（1962—），男，安徽南陵，教授，博士，主要從事藥用真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝調(diào)控研究。Tel: (0516)83403179 E-mail: yyzw@jsnu.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]