小分子靶標(biāo)的核糖開關(guān)生物傳感器研究進展

吳一凡，林晟豪，許文濤，*

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系，食品精準(zhǔn)營養(yǎng)與質(zhì)量控制教育部重點實驗室，北京100083

生物體及環(huán)境中的小分子化合物主要指輔因子、氨基酸、嘌呤、磷酸化糖、金屬離子等，它們在細胞代謝、信號傳導(dǎo)、細胞防御機制等生化過程中具有重要的作用[1]。目前，對于小分子化合物的檢測技術(shù)較為成熟，主要包括色譜法、質(zhì)譜法、熒光法、紫外-可見光譜法及生物傳感器等。其中，生物傳感器具有選擇性高、成本低、操作簡單、便攜等優(yōu)勢，已經(jīng)成為近年來研究的熱點，擁有巨大的市場份額，且已進一步應(yīng)用于合成生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[2]，應(yīng)用前景廣闊[3]。然而在實際應(yīng)用中，傳統(tǒng)檢測方法涉及到大型儀器，存在成本高、操作復(fù)雜等不足，基于酶、抗體、微生物的傳感器同樣存在成本高、穩(wěn)定性欠佳、應(yīng)用范圍有限等缺點[4]。基于核糖開關(guān)（riboswitch）的生物傳感器的出現(xiàn)為小分子檢測提供了一條新途徑。

核糖開關(guān)作為一種34～200 bp 的結(jié)構(gòu)化的非編碼核酸，位于mRNA 的5 '非編碼區(qū)（5'UTR）或3'非編碼區(qū)（3'UTR），可以不依賴于蛋白質(zhì)發(fā)揮作用，通過與配體特異性結(jié)合，導(dǎo)致適體域構(gòu)象改變，并將變化信號傳遞給表達平臺域，進而調(diào)節(jié)基因表達[5-8]。早在1997 年，Gold 等[9-10]推測某些mRNA 可以直接感知小分子濃度的變化，并對這一變化做出響應(yīng)。而1999 年，Gelfand 等[11]在枯草芽孢桿菌核黃素操縱子上游發(fā)現(xiàn)1 個可以折疊成具有5 個發(fā)夾的保守結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)被證明能夠影響芽孢桿菌屬中核黃素基因的表達，由此推測其可能是1 個核糖核酸調(diào)控元件。2002 年Winkler 等[12]在大腸桿菌（Escherichia coli）中發(fā)現(xiàn)某些mRNA 能夠感知代謝物從而控制基因，這是證實mRNA 表達的第1 個實驗性證據(jù)，其中編碼大腸桿菌中參與維生素B1生物合成酶的mRNA，可以與硫氨酸或其焦磷酸衍生物結(jié)合，而不需要蛋白質(zhì)參與，因此，將此mRNA 命名為核糖開關(guān)。

目前發(fā)現(xiàn)的多數(shù)天然核糖開關(guān)主要存在于細菌中，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了40 多種不同類型的細菌核糖開關(guān)[13]。此外，植物、真菌等真核生物中也存在核糖開關(guān)，主要以硫胺素焦磷酸核糖開關(guān)為主，但哺乳動物中尚未發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)[14]。

核糖開關(guān)作為一種功能核酸，具備高親和力、高特異性、較強的可編程性、可操作性和可重復(fù)性，能夠響應(yīng)多種內(nèi)源性小分子代謝物及非內(nèi)源性小分子。因此，基于核糖開關(guān)的生物傳感器具有廣泛應(yīng)用于小分子檢測、跟蹤小分子代謝物等方向的潛力。本文對核糖開關(guān)的來源、構(gòu)成、調(diào)控機制、篩選，特別是對小分子靶標(biāo)的核糖開關(guān)的生物傳感器分類進行了介紹，旨在拓展核糖開關(guān)的新型應(yīng)用領(lǐng)域。

1 核糖開關(guān)

1.1 核糖開關(guān)的構(gòu)成與調(diào)控機制

在結(jié)構(gòu)上，核糖開關(guān)由進化保守的適體結(jié)構(gòu)域和可變表達平臺兩部分組成[15]。適體結(jié)構(gòu)域高度保守，因具有高親和力和特異性，可結(jié)合多種配體，如輔酶、金屬陽離子、陰離子、核苷酸及其衍生物、氨基酸、磷酸化糖等[16]；表達平臺則調(diào)節(jié)下游編碼序列，控制基因表達。核糖開關(guān)的調(diào)控機制通常有3種：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控以及自身剪切作用調(diào)控[17]。

在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)節(jié)是核糖開關(guān)最常見的作用機制之一（圖1A）。由一個莖和一系列尿苷殘基構(gòu)成了一個內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄終止子，導(dǎo)致RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄停止并釋放DNA 模板和RNA 產(chǎn)物。而配體與適體的結(jié)合則會導(dǎo)致抗終止子的形成，從而控制終止子的形成[18]。Barrick 等[19]基于二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的計算方法，選取結(jié)構(gòu)和解離常數(shù)已知的茶堿適體，連接下游序列，使得適體結(jié)構(gòu)的30%交替成為終止子莖的一部分，設(shè)計合成茶堿核糖開關(guān)。

在翻譯水平調(diào)控中，核糖開關(guān)可以通過互斥的堿基配對結(jié)構(gòu)控制核糖體進入核糖體結(jié)合位點或SD（shine-dalgarno）序列，激活或者終止翻譯[8]（圖1B）。當(dāng)核糖體結(jié)合到SD 序列上，則翻譯進行；若適體與配體結(jié)合，阻止核糖體與SD 序列結(jié)合，則翻譯終止[20]。Borujeni 等[21]通過統(tǒng)計熱力學(xué)模型，對激活基因表達的翻譯調(diào)節(jié)核糖開關(guān)的序列-結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系進行了預(yù)測，并利用該模型對62個合成核糖開關(guān)進行了自動計算設(shè)計。

核糖開關(guān)的另一種作用機制則是通過自身選擇性剪切作用和改變mRNA 穩(wěn)定性進行基因調(diào)控，這其中涉及到核酶的切割活性（圖1C）。谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶GlmS 核糖開關(guān)作為其中的一種核酶，其配體為葡糖胺-6-磷酸（GlcN6P）。當(dāng)GlcN6P 與核糖開關(guān)結(jié)合后，可激活核酶活性，啟動降解，從而快速破壞基因的mRNA[21]。

圖1 核糖開關(guān)的調(diào)控機制[23]Fig.1 The regulation mechanism of riboswitches[23]

1.2 核糖開關(guān)的篩選

1990 年，Ellington 等[22]體外篩選出與各種有機染料可以特異性結(jié)合的隨機序列RNA 分子，并將其命名為“適體”。大約每1010個隨機序列的RNA 分子中存在1個可以與某種小分子配體進行特異性結(jié)合的位點。體外篩選核糖開關(guān)通常以適體作為核心組件，利用配體指數(shù)級富集系統(tǒng)進化技術(shù)（systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得[23]。SELEX 體外篩選技術(shù)主要包括建立文庫、與靶標(biāo)物質(zhì)孵育、洗脫分離、擴增富集等步驟[24]。迄今為止，已通過SELEX 方法篩選獲得了多種適體。這一成熟的適體體外篩選方法同樣適用于人工適體的核糖開關(guān)設(shè)計與篩選，具有開發(fā)出與多種小分子靶標(biāo)結(jié)合的核糖開關(guān)的潛力。

理論上這些適體與天然核糖開關(guān)中的適體同樣具有高親和力和特異性結(jié)合的性質(zhì)[25]。然而，僅有有限數(shù)量的適體可以最終進行核糖開關(guān)開發(fā)，如茶堿適體[26-27]、四環(huán)素結(jié)合適體[28-30]。這是由于體外篩選得到的適體無法保證體內(nèi)功能[31]。

與體外篩選系統(tǒng)相比，體內(nèi)篩選系統(tǒng)能夠基于細胞復(fù)雜的生理環(huán)境，對進入細胞的化合物進行篩選。大多數(shù)經(jīng)過體外篩選得到的核糖開關(guān)需要進一步經(jīng)過體內(nèi)遺傳篩選后，才能夠得到具有所需功能的核糖開關(guān)[32-33]。遺傳篩選可以通過細胞表型鑒定細胞中生物分子的功能[34]。Nomura等[35]基于大腸桿菌，通過雙重遺傳選擇，從75 000個克隆中成功篩選出功能性硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate，TPP）核糖開關(guān)，其可以在TPP 作用下調(diào)控下游基因tet A的表達。當(dāng)tet A基因在大腸桿菌中被有效表達，大腸桿菌對四環(huán)素具有耐性，但對氯化鎳敏感；反之，當(dāng)tet A基因不表達，大腸桿菌對四環(huán)素敏感，但對氯化鎳具有耐性。

傳統(tǒng)的遺傳篩選方法雖然可以成功地篩選出具有功能性的核糖開關(guān)，但仍存在背景表達水平高、激活指數(shù)不理想等問題，因此，體內(nèi)遺傳篩選方法需要進一步優(yōu)化。Lynch 等[36]提出了一種自動化的高通量篩選方法，該方法可以鑒定合成的核糖開關(guān)的生物活性。在缺乏所需配體的情況下，這些核糖開關(guān)顯示出極低的基因表達背景水平，而在有配體存在的情況下，這些核糖開關(guān)的表達顯著增加。Kirchner 等[37]利用一種高通量體內(nèi)篩選系統(tǒng)，檢測1 280個大型文庫中來自炭疽桿菌的鳥嘌呤核糖開關(guān)，并鑒定出影響核糖開關(guān)介導(dǎo)的基因調(diào)控的配體化合物。

2 小分子靶標(biāo)的核糖開關(guān)生物傳感器的功能

生物傳感器由分子識別元件、傳感器和報告模塊組成[38]。當(dāng)目標(biāo)分析物質(zhì)通過擴散作用被分子識別元件識別后，即與分子識別元件發(fā)生特異性結(jié)合，并產(chǎn)生生物學(xué)信息，該信息經(jīng)過傳感器轉(zhuǎn)換為可測量的信號，隨后經(jīng)過報告模塊的放大和處理，最終以可視化方式顯示檢測結(jié)果，從而達到分析目標(biāo)物質(zhì)的目的[39]。生物傳感器按照分子識別元件可以分為酶、抗體、細胞、微生物、脫氧核糖核酸、核糖核酸等；而生物傳感器的信號輸出多數(shù)為熒光、電信號以及能夠直接影響宿主菌生長的抗性因子或限制因子。

近年來，核糖開關(guān)作為一種識別元件，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器，與傳統(tǒng)其他傳感器相比，優(yōu)勢更明顯（表1）。核糖開關(guān)是一類功能核酸，具有可編程性、可操作性和可重復(fù)性，這使其能夠依據(jù)實際需求組裝拼接調(diào)控元件，并對其進行合理設(shè)計與優(yōu)化。基于此，核糖開關(guān)具有識別特定的代謝物（如包括輔因子在內(nèi)的多種配體、嘌呤及其衍生物、氨基酸、磷酸化糖和金屬離子[40]）和擴大可檢測配體多樣性的潛力。基于核糖開關(guān)的生物傳感器，最常見的信號輸出系統(tǒng)為蛋白質(zhì)水平的報告系統(tǒng)，如綠色熒光蛋白及其變體[41]等；同時，還存在一類熒光核酸適體也可以作為報告劑使用，如菠菜適體[42-46]、花椰菜適體[47]及芒果適體[48]。此外，也可以通過使用抗生素抗性的基因進行生長依賴性分析，如通過四環(huán)素抗性基因tetA進行陰性或陽性的選擇[49]。

表1 不同類別生物傳感器的特點Table 1 The characteristics of different types of biosensors

2.1 輔因子

2.1.1 硫胺素焦磷酸 硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate，TPP）作為碳水化合物和氨基酸代謝中各種代謝中間產(chǎn)物羧化和脫羧的必要輔因子。TPP 核糖開關(guān)是最普遍且豐富的一種核糖開關(guān)，同樣也是唯一在真核生物中存在的核糖開關(guān)，包括真菌[50-51]、藻類[52]和植物[53]。其可以參與調(diào)節(jié)TPP 的基因表達，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)mRNA 衰減、Rho 依賴性轉(zhuǎn)錄終止、交替剪接[54]。Aghdam 等[55]比較了來源于Alishewanella tabrizica、Alishewanella aestuarii、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的TPP適體結(jié)構(gòu)域，對其親和力進行分析，最終證明Alishewanella tabrizica、Alishewanella aestuarii的TPP 結(jié)合親和力最高，是功能性的TPP 核糖開關(guān)。此外，TPP 核糖開關(guān)還可以作為抗菌藥物靶點。Pavlov 等[56]基于生物信息學(xué)分析，根據(jù)核糖開關(guān)作為抗菌藥物靶點的適宜性對其進行分組，研究得到TPP 可作為抗菌藥物靶點，抑制TPP 核糖開關(guān)將阻礙某些致病菌的生長。

2.1.2 S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAM）SAM 作為生物體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物，是由甲硫氨酸和ATP 通過SAM 合成酶合成的。SAM 在細胞代謝中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，是已知最常見的核糖開關(guān)效應(yīng)因子[57]。作為已知最大的核糖開關(guān)組，SAM核糖開關(guān)已經(jīng)確定了SAM-Ⅰ超家族、SAM-Ⅱ超家族、SAM-Ⅲ家族，這3個不同的SAM 核糖開關(guān)超家族是自然界中最常見的核糖開關(guān)類別，在某種程度上構(gòu)成了結(jié)構(gòu)化核糖核酸的整體。Tang 等[58]通過體內(nèi)外研究表明，野油菜黃單胞菌中SAM-ⅠXcc核糖開關(guān)在黃單胞菌中高度保守，具有雙重功能表達平臺，主要在翻譯水平上利用Met 操縱子調(diào)節(jié)甲硫氨酸的合成，以響應(yīng)細胞中SAM水平。

2.2 嘌呤及其衍生物

嘌呤核糖開關(guān)于2003 年被發(fā)現(xiàn)，是最具特征的核糖開關(guān)之一。這類核糖開關(guān)可以分為4 類，分別與腺嘌呤、鳥嘌呤、脫氧鳥嘌呤核苷和3類高度修飾的鳥嘌呤（prequeuosine，preQ1）結(jié)合[59]。其中，腺嘌呤和鳥嘌呤核糖開關(guān)盡管結(jié)合不同的代謝物，且具有不同的基因表達調(diào)控機制，但是其適體結(jié)構(gòu)域具有高度的結(jié)構(gòu)相似性，結(jié)合口袋幾乎相同[60]。

在多種核糖開關(guān)中，add 型腺嘌呤核糖開關(guān)是結(jié)構(gòu)最簡單的核糖開關(guān)之一[61]。腺嘌呤核糖開關(guān)是目前罕見的具有激活基因表達作用的核糖開關(guān)[62]。對于腺苷敏感的創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificusadd）核糖開關(guān)，其與配體結(jié)合時可以調(diào)控腺嘌呤脫氨酶翻譯的啟動；反之，若缺乏腺嘌呤，則會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)阻止SD 序列與核糖體結(jié)合以抑制翻譯起始[63]。

鳥嘌呤核糖開關(guān)分布廣泛，主要存在于金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等革蘭氏陽性菌基因中[64]。其結(jié)合口袋可以識別配體小分子，通過局部構(gòu)象變化以及Watson-Crick 堿基配對的相互作用，從而將配體完全包裹在內(nèi)[65]。與腺嘌呤核糖開關(guān)的基因表達調(diào)控機制相反，鳥嘌呤核糖開關(guān)作為一種負反饋調(diào)節(jié)機制，通過抑制基因的表達從而對細菌病原體代謝和運輸進行調(diào)控。因此，鳥嘌呤核糖開關(guān)被認(rèn)為具有成為新型抗菌化合物的潛力。Kim 等[66]研究發(fā)現(xiàn)，鳥嘌呤類似物G7 可以抑制枯草芽孢桿菌中由鳥嘌呤核糖開關(guān)調(diào)控的報告基因的表達，表明G7可能通過調(diào)控鳥嘌呤核糖開關(guān)進而抑制細菌生長。Yan 等[67]通過測量鳥嘌呤類似物對艱難梭菌（Clostridium difficile）中的鳥嘌呤核糖開關(guān)的親和力以及其結(jié)構(gòu)-活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)鳥嘌呤核糖開關(guān)能夠調(diào)節(jié)嘌呤化合物的基礎(chǔ)代謝，進而確定了鳥嘌呤核糖開關(guān)幾種鳥嘌呤類似物的抗菌活性。

2.3 氨基酸

在目前發(fā)現(xiàn)的40 類核糖開關(guān)中，僅3 種核糖開關(guān)可以調(diào)節(jié)遺傳編碼的氨基酸濃度，分別為甘氨酸、賴氨酸和谷氨酰胺。其中1 個重要的調(diào)節(jié)途徑涉及到賴氨酸核糖開關(guān)，其可指導(dǎo)賴氨酸自身以及賴氨酸和其他氨基酸前體物質(zhì)的生物合成和運輸[68]。賴氨酸是所有生物的必需氨基酸，因此其生物合成途徑具有至關(guān)重要的意義。Mukherjee 等[69]通過對所有原核生物中賴氨酸核糖開關(guān)的分布進行基因組學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)賴氨酸核糖開關(guān)在厚壁菌門和γ變形菌中分布最為豐富，并揭示了通過核糖開關(guān)進行賴氨酸調(diào)控的模式，其主要存在于生物合成基因的上游，這有利于未來將核糖開關(guān)運用于靶向治療。

2.4 磷酸化糖

GlmS 核糖開關(guān)廣泛存在于革蘭氏陽性菌中，其作為1 種位于GlmS基因的5'非翻譯區(qū)的自剪切核酶，可以催化GlcN6P的合成[70]。GlcN6P是細菌細胞壁的重要組成部分，當(dāng)GlcN6P 與GlmS 核糖開關(guān)結(jié)合后，可以誘導(dǎo)GlmS核糖開關(guān)發(fā)生自剪切，抑制下游基因表達，進而導(dǎo)致mRNA 的不穩(wěn)定，由此形成不穩(wěn)定的細胞壁，限制了細菌的生長[71-73]。因此，GlmS 核糖開關(guān)同樣具有開發(fā)針對各種病原菌藥物的潛力。Luense 等[72]發(fā)現(xiàn)了1 種新的GlcN6P的碳類似物，可以激活金黃色葡萄球菌中的GlmS 核糖開關(guān)，其效力與天然GlcN6P 相同，但僅在高濃度下誘導(dǎo)的GlmS核糖開關(guān)發(fā)生自剪切，從而發(fā)揮抗菌作用。

2.5 金屬離子

金屬離子作為多種酶的輔因子，在生物學(xué)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。然而，當(dāng)細胞內(nèi)金屬離子濃度超過一定閾值，細胞毒性也隨之增加[74]。因此，細胞內(nèi)的金屬離子需受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)。除了多數(shù)細菌通過非編碼核糖核酸進行反式作用調(diào)節(jié)外，研究表明，某些細菌可以利用順式調(diào)控作用RNA 元件核糖開關(guān)調(diào)控金屬離子穩(wěn)態(tài)，其中，Mg2+核糖開關(guān)是最常見的[75]。Dann 等[76]在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了一個參與Mg2+調(diào)控的金屬感應(yīng)核糖開關(guān)，命名為M-box，其可發(fā)揮關(guān)閉開關(guān)的作用，當(dāng)Mg2+與Mg2+核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，下游基因內(nèi)會形成轉(zhuǎn)錄終止子，這可能是調(diào)控細菌中金屬離子水平的一種常見模式。此外，還存在Ni2+、Co2+、Mn2+核糖開關(guān)，這種核糖開關(guān)及其天然配體分布于多種細菌中，可能作為相應(yīng)金屬離子毒性濃度的傳感器[13]。

2.6 其他小分子

除上述涉及的幾類小分子化合物，目前所發(fā)現(xiàn)的最為顯著的核糖開關(guān)之一是氟化物核糖開關(guān)。2010 年，Weinberg 等[77]在細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)1 種結(jié)合配體未知的核糖開關(guān)。隨后，Baker等[78]發(fā)現(xiàn)這一類核糖開關(guān)可以選擇性地結(jié)合氟化物，激活編碼氟化物運輸工具、被氟化物抑制的酶及其他蛋白質(zhì)的基因表達，進而減輕自然界中氟離子的有害影響。因此，根據(jù)這一作用機制，可以有效檢測和控制氟離子的毒性水平。

3 展望

自2002 年初次發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)以來，其作為一種新型調(diào)控基因表達的方式已經(jīng)近20 年，在基因表達的調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。合成核糖開關(guān)是極具前途的工具，目前已將其應(yīng)用于代謝工程、合成生物學(xué)等領(lǐng)域?；谛》肿影袠?biāo)的核糖開關(guān)的生物傳感器具有多種優(yōu)勢，是檢測小分子的有力工具，我們在核糖開關(guān)的篩選、裁剪、理性設(shè)計等幾個方向提出以下展望。

①開發(fā)核糖開關(guān)的高通量篩選及裁剪系統(tǒng)。核糖開關(guān)未來可以通過高通量篩選的方法，進一步開發(fā)更多的核糖開關(guān)，與此同時，通過裁剪進一步提高核糖開關(guān)的識別特異性及親和力。

②體外篩選核糖開關(guān)的體內(nèi)環(huán)境適用性改造。經(jīng)過體外篩選所得的適體，僅有少數(shù)核糖開關(guān)能保證在細胞內(nèi)性能和功能的穩(wěn)定性，未來可以通過高通量自動化體內(nèi)篩選技術(shù)，輔以計算機等新型手段，有望突破傳統(tǒng)遺傳篩選與體外篩選的局限性。

③核糖開關(guān)的計算機輔助理性設(shè)計?，F(xiàn)階段對于設(shè)計核糖開關(guān)的方法還未完全了解，計算輔助熱力學(xué)建模仍存在一定局限性，未來可以進一步開發(fā)更有效的方法進行計算設(shè)計與優(yōu)化。

④核糖開關(guān)識別與發(fā)光功能核酸信號輸出的有機整合。目前核糖開關(guān)信號輸出主要以熒光蛋白和熒光核酸適體為主，未來可以進一步豐富核糖開關(guān)的信號輸出系統(tǒng)。

⑤核糖開關(guān)無細胞傳感器開發(fā)。目前已有研究表明，無細胞傳感器使得核糖開關(guān)小分子靶標(biāo)的出入細胞器不受限制[79]，具有極易調(diào)節(jié)反應(yīng)環(huán)境的關(guān)鍵優(yōu)勢，同時具備便攜、低成本、操作簡便、可以長期儲存等特性，這對于未來針對小分子靶標(biāo)的快速檢測具有極大的應(yīng)用潛力。