滅菌溫度對產(chǎn)腈水合酶菌發(fā)酵生產(chǎn)的影響

鐘山金 周建榮 潘海祥 周建春

江蘇昌九農(nóng)科化工有限公司 江蘇 如東 226499

引言

腈水合酶（nitrile hydratase，NHase）是生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺（acrylamide，AM）的催化劑，能催化丙烯腈（acrylonitrile，AN）水合生成丙烯酰胺[1-2]。該菌的培養(yǎng)是微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的關(guān)鍵。在腈水合酶菌的發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)中，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基需經(jīng)過蒸汽消毒滅菌后才能接入菌種進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)，而培養(yǎng)基的消毒滅菌溫度成為關(guān)鍵，滅菌溫度越高，滅菌越徹底，但同時(shí)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被破壞的越多[3]，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)越少，腈水合酶菌發(fā)酵后的酶活越低；滅菌溫度越低對培養(yǎng)基的破壞越小，腈水合酶菌發(fā)酵后的酶活越高，但是滅菌溫度越低滅菌越不徹底，越容易染雜菌，染雜菌后腈水合酶菌發(fā)酵后酶活降低，酶活越低，發(fā)酵液的消耗量越高。生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)酵液消耗量的高低直接影響丙烯酰胺生產(chǎn)的效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 產(chǎn)腈水合酶的菌。Nocardia.sp.163，為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖20.0 ；K2HPO40.50；KH2PO40.50 ；MgSO4.7H2O0.50 ；谷氨酸1.0；尿素7.0；酵母膏6.0；CoCl2·6H2O，20mg/L，片堿0.5。以上培養(yǎng)基成分中K2HPO4、KH2PO4、MgSO4.7H2O和CoCl2·6H2O是分析純，尿素及片堿為工業(yè)級，其余皆為食品級。

1.2 方法

1.2.1 種子罐種子液的發(fā)酵培養(yǎng)。將制備好的Nocardia.sp.163液體菌種接于已備好的種子罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，溫度為28℃，通氣量40m3/h，培養(yǎng)44 h后降溫至4～6℃，備用。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)基消毒滅菌溫度的實(shí)驗(yàn)方法。在10噸發(fā)酵罐空罐滅菌后打開人孔，按配方投入水、葡萄糖，酵母膏，尿素，K2HPO4、KH2PO4、MgSO4.7H2O，味精，CoCl2·6H2O，片堿后，關(guān)閉人孔，從發(fā)酵罐夾套進(jìn)蒸汽，待溫度上升至90℃后，關(guān)閉夾套蒸汽，改由進(jìn)氣管。出料管，取樣管進(jìn)蒸汽繼續(xù)升溫，分別在120℃，119℃，118℃，117℃，116℃，115℃，114℃，113℃，112℃，111℃，110℃保壓計(jì)時(shí)滅菌17分鐘后，用冷卻水降溫至30℃，再通過管道接入備用好的種子罐種子液，在28℃，氣量150m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘條件下培養(yǎng)42h后，放入發(fā)酵液儲罐降溫至4～6℃，離心機(jī)離心后同過微濾膜清洗至色度50以下；加水混合至原來離心的前的質(zhì)量；備用

1.2.3 水合反應(yīng)方法。在25m3的反應(yīng)釜中投入15噸水，2.5噸上述備用的發(fā)酵液，連續(xù)流加丙烯腈（流量為0.9Th）至丙烯酰胺濃度為30%時(shí)，停止流加丙烯腈,反應(yīng)過程中每小時(shí)取樣一次測定水合釜中的丙烯腈含量，當(dāng)丙烯腈含量≤0.1%，丙烯酰胺濃度為30%時(shí)，用超濾膜分離出丙烯酰胺溶液和發(fā)酵液，丙烯酰胺溶液放入丙烯酰胺反應(yīng)液儲罐一倍后一工序使用，發(fā)酵液回到反應(yīng)釜中加入水至15.5噸位置后再次流加進(jìn)行水合反應(yīng)，直至水合釜中丙烯腈含量超過0.1%且丙烯酰胺含量＜30%時(shí)，適當(dāng)降低丙烯腈流加量，至丙烯酰胺濃度到30%時(shí)，停止流加丙烯腈。待丙烯腈含量丙烯腈含量≤0.1%時(shí)，用超濾膜分離丙烯酰胺溶液和發(fā)酵液后，此2.5噸發(fā)酵液使用結(jié)束。

1.2.4 發(fā)酵液消耗量的計(jì)算方法。發(fā)酵液消耗量=發(fā)酵液用量/此發(fā)酵液產(chǎn)生的丙烯酰胺量，其中丙烯酰胺量按折百丙烯酰胺計(jì)算。

1.2.5 檢測方法。

1.2.5.1 腈水合酶活性的測定。準(zhǔn)確移取1mL發(fā)酵液，19mL磷酸緩沖液于150mL具塞三角瓶中，把三角瓶放入恒溫水浴，開啟振蕩，溫度恒定在28℃，加入1000μL AN，用秒表控制，準(zhǔn)時(shí)反應(yīng)5min，用4moL／L HCL200μL中止反應(yīng)，用氣相色譜儀測定反應(yīng)液中生成的丙烯酰胺含量。

1.2.5.2 丙烯腈含量的測定。用5mL刻度離心管裝5mL樣品液，3000轉(zhuǎn)/min離心15min后上清液倒入到干凈的小瓶中，用氣相色譜儀外標(biāo)法測定反應(yīng)液中丙烯腈含量。

1.2.5.3 鏡檢的測定。取發(fā)酵液直接涂布在載玻片上，干燥后用結(jié)晶紫溶液染色，待干燥后用純水洗去染色液，干燥后滴一滴香波油，用2500倍油鏡觀察一個(gè)視野里的雜菌數(shù)，無雜菌為正常。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌溫度下腈水合酶活性及鏡檢的檢測結(jié)果

不同滅菌溫度下腈水合酶活性變化的檢測結(jié)果見表1。

表1 不同滅菌溫度下腈水合酶活性變化的檢測結(jié)果

從表1中可以看出，滅菌溫度的降低，發(fā)酵液酶活逐漸升高，說明腈水合酶活性與腈水合酶菌的培養(yǎng)基滅菌溫度有關(guān)聯(lián)，在119 ℃、118 ℃、117 ℃、116 ℃、115℃、114℃、113℃和112 ℃滅菌的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)所得到的腈水合酶活性平均酶活單位（萬μ/mg）分別比對照正常120℃滅菌的培養(yǎng)基發(fā)酵所得的腈水合酶活性平均酶活單位分別提高了10%、15.6%、22.2%、38%、55%、67%、45%和31%。其中114℃滅菌培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到的腈水合酶酶活單位為835萬μ/mg，比Nocardia.sp.163菌株的120℃滅菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)所得的腈水合酶酶活單位提高了67%。114℃以下滅菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液出現(xiàn)不同程度的染桿菌現(xiàn)象，隨著溫度的降低桿菌由2個(gè)逐漸上升至20個(gè)。

2.2 不同滅菌溫度下腈水合酶在水合釜中的反應(yīng)結(jié)果

每罐發(fā)酵罐發(fā)酵后的發(fā)酵液為5噸，每個(gè)反應(yīng)釜用發(fā)酵液2.5噸，一罐發(fā)酵液分2個(gè)反應(yīng)釜進(jìn)行反應(yīng)。兩罐發(fā)酵液使用4個(gè)反應(yīng)釜進(jìn)行水合反應(yīng)。Nocardia.sp.163發(fā)酵培養(yǎng)基在不同溫度下滅菌所得到的發(fā)酵液在水合反應(yīng)中的發(fā)酵液消耗量結(jié)果見表2。

表2 Nocardia.sp.163發(fā)酵培養(yǎng)基在不同溫度下滅菌的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液在水合反應(yīng)中的發(fā)酵液消耗量結(jié)果

從表2可以看出，114℃滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液投入水合釜反應(yīng)后的發(fā)酵液消耗量為0.0947T/TAM，比120℃滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液消耗量0.1389T/TAM相對低68%，即降低了32%的發(fā)酵液消耗量。

3 結(jié)束語

Nocardia.sp.163菌株發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基通過不同滅菌溫度發(fā)酵所得到的發(fā)酵液檢測發(fā)酵液中腈水合酶酶活性篩選，獲得優(yōu)良的114℃滅菌溫度，腈水合酶酶活性達(dá)到835萬μ/mg，比出發(fā)的120℃滅菌發(fā)酵培養(yǎng)所得到的腈水合酶酶活性500萬μ/mg提高了67%。

通過不同滅菌溫度發(fā)酵所得到的發(fā)酵液在水合反應(yīng)釜中的發(fā)酵液消耗量計(jì)算，114℃滅菌的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液，其發(fā)酵液消耗量比120℃滅菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液消耗量降低了32%。