發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白質(zhì)降解及蛋白肽生物活性的影響

魏光強(qiáng)，王道滇，楊彩艷，萬長江，黃艾祥,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程學(xué)院，云南 大理 671003）

乳餅是滇中彝族、路南撒尼族地區(qū)的一種歷史悠久、民族特色濃郁的傳統(tǒng)酸凝新鮮奶酪，距今已有600多年的歷史。目前，酸凝奶酪加工過程中的酸化技術(shù)主要有添加酸凝劑的直接酸化和微生物發(fā)酵慢酸化，研究表明，不同的酸化技術(shù)影響奶酪的理化特性、功能特性、微生物組成以及風(fēng)味特征[1-2]。乳餅沿襲了傳統(tǒng)的直接酸化技術(shù)，通過向原料乳中添加自然發(fā)酵的酸乳清，在高溫條件下（85～90 ℃）酸促凝乳，排乳清得到乳凝膠，然后在模具里壓制成型制得[3]，因直接酸化工藝具有快速、簡便、成本低等特點而得以傳承。但傳統(tǒng)的直接酸化技術(shù)在高溫條件下通過添加自然發(fā)酵的酸乳清，快速酸化凝乳，導(dǎo)致乳餅的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性、維生素受損，產(chǎn)品伴有不愉悅的酸腐味，產(chǎn)品保質(zhì)期段，質(zhì)量難以控制，從而阻礙了乳餅行業(yè)的發(fā)展。

乳酸菌在發(fā)酵乳制品中起重要作用，乳酸菌發(fā)酵代謝能產(chǎn)生有機(jī)酸、游離氨基酸、肽以及揮發(fā)性風(fēng)味成分，在改善乳制品風(fēng)味的同時，提升其營養(yǎng)價值。在過去20年中[4-5]，從乳制品中分離和鑒定了各種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制肽[6-7]；此外，從酪蛋白和乳清的水解物中分離鑒定了具有螯合過渡金屬和清除自由基能力的抗氧化肽[8-9]。張軍蒙[10]篩選具有益生的乳酸菌制備了具有降糖活性的發(fā)酵乳，Ayyash等[11]發(fā)現(xiàn)添加植物乳桿菌駱駝奶發(fā)酵乳具有抗癌活性、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性、ACE抑制活性和抗氧化活性。前期研究通過添加乳酸菌發(fā)酵酸化，再輔助加熱凝乳，研發(fā)了一種發(fā)酵酸化乳餅（fermented rubing cheese，F(xiàn)RB），改善了乳餅的營養(yǎng)品質(zhì)和風(fēng)味特征。

目前，關(guān)于發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白質(zhì)降解以及蛋白肽生物活性的影響鮮有報道，本研究通過接種課題組前期自主篩選的羅伊氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌，復(fù)配中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）菌株嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵原料乳產(chǎn)酸酸化，再輔助加熱促使乳凝膠加工FRB，以傳統(tǒng)直接酸化乳餅（traditional rubing cheese，TRB）作為對照組，探究酸化技術(shù)對乳餅蛋白質(zhì)的降解及蛋白肽的ACE抑制活性、降糖活性和體外抗氧化活性的影響，以期改善乳餅的營養(yǎng)品質(zhì)，為乳餅工藝的改進(jìn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

荷斯坦牛奶：由云南德摩菲爾生物科技有限公司提供，其主要成分為蛋白質(zhì)3.1%，脂肪3.4%，總固體11.84%，乳糖4.88%，酸度13.38oT。

自然發(fā)酵酸乳清：加工乳扇、乳餅剩余的乳清裝于密閉的玻璃罐中，在自然條件下發(fā)酵15～20 d而成，pH值在3.0～3.2之間。

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（菌株編號6063）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）（菌株編號6047）為CICC菌株；羅伊氏乳桿菌（L. reuteri）和嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）從用于生產(chǎn)乳扇、乳餅的酸乳清中分離鑒定，4 株菌活化至活菌數(shù)大于108CFU/mL時按體積比為1∶1∶2∶2復(fù)配，菌液經(jīng)離心后除去上清液，并用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入凍干保護(hù)劑后進(jìn)行冷凍干燥制得直投式發(fā)酵劑（活力為2.6×107CFU/g）。

1.1.2 試劑

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)G250（均為分析純） 美國Sigma公司；丙烯酰胺、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）（均為分析純） 美國Amresco公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker（10～180 kDa） 美國Solarbio公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 上海晶純生化科技股份有限公司；α-葡萄糖苷酶（分析純）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu，HHL）上海源葉生物科技有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷酶（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG）；ACE 上海源葉生物科技有限公司；甲酸、甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國默克股份兩和公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；1658001垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；URA14M0018紫外分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；Merck Millipore（膜片直徑76 mm）超濾杯 上海軒儀儀器設(shè)備有限公司；Q Exactive四極桿質(zhì)譜儀、Easy-nLC 1000液相色譜儀 賽默飛世爾科技公司；ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 乳餅樣品的制備

TRB加工工藝：鮮牛奶→殺菌（85 ℃，15 min）→添加自然發(fā)酵酸乳清（按牛奶-酸乳清6∶1比例添加酸乳清）→調(diào)整pH 4.8→凝乳（85～90 ℃，5 min）→形成凝乳顆?！^濾→壓制成型→TRB。

FRB加工工藝：鮮牛奶→殺菌（85 ℃，15 min）→冷卻（38～42 ℃）→接種發(fā)酵劑（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%～0.3%）→發(fā)酵（42 ℃，酸化終點pH 4.9）→升溫凝乳（65 ℃，30 min）→形成凝乳塊→過濾→壓制成型→FRB。

1.3.2 乳餅水溶性蛋白肽的提取及超濾分離

乳餅樣品切碎→按料液（水）比為1∶15進(jìn)行混合→均質(zhì)（8 000 r/min，5 min）→超聲提?。ǔ暪β?60 W、超聲時間30 min）→高速冷凍離心（9 000 r/min、4 ℃、20 min）→取上清液→超濾（0.3 MPa，過10、3 kDa的超濾膜）→冷凍干燥（5～10 MPa，－50 ℃）→乳餅蛋白肽凍干粉，保存于－80 ℃冰箱中，備用。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

利用4%的濃縮膠、12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE，上樣質(zhì)量濃度3 mg/mL，上樣量20 μL。電泳結(jié)束后，電泳膠片用考馬斯亮藍(lán)G-250染液染色1 h，用20%的甲醇與冰醋酸混合液進(jìn)行脫色至電泳條帶清晰可見，電泳膠片使用Quantity One（Biorad, Hercules, CA, USA）軟件拍攝圖像并進(jìn)行分析。

1.3.4 乳餅蛋白肽超濾組分中的游離氨基酸含量的測定

1.3.4.1 樣品處理

精確稱取50 mg樣本于2 mL EP管中，準(zhǔn)確加入600 μL 10%甲酸-甲醇-ddH2O（甲酸∶甲醇=1∶1，V/V）溶液，加入50 mg玻璃珠。放入高通量組織研磨儀中60 Hz振蕩1 min，重復(fù)2 次；12 000 r/min、4 ℃離心5 min，取原始上清液100 μL，加入900 μL 10%甲酸-甲醇-ddH2O溶液，渦旋振蕩30 s，取稀釋后的樣本100 μL，加入質(zhì)量濃度為100 μg/L的雙同位素內(nèi)標(biāo)100 μL渦旋振蕩30 s，上清液過0.22 μm濾膜，過濾液加入到檢測瓶中，待測。

1.3.4.2 液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法測定游離氨基酸含量

色譜條件：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量5 μL；柱溫40 ℃；流動相：A為10%甲醇溶液（含0.1%甲酸），B為50%甲醇溶液（含0.1%甲酸）；梯度洗脫條件：0～6.5 min，90%～70% A、10%～30% B；6.5～7 min，70%～0% A、30%～100% B；7～8 min，0% A、100% B；8～8.5 min，0%～90% A、100%～10% B；8.5～12.5 min，90% A、10% B；流速：0～8.5 min，0.3 mL/min；8.5～12.5 min，0.3～0.4 mL/min。

1.3.5 乳餅蛋白肽的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒定

樣品用0.1%三氟乙酸溶解，ZipTip脫鹽，真空離心旋干，0.1%的甲酸溶解，上質(zhì)譜。反相柱：C18柱（150 μm×15 cm，1.8 μm）；色譜儀器：Thermo Fisher Easy-nLC 1000；質(zhì)譜儀器：Thermo Fisher LTQ Obitrap ETD；流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：乙腈；LC-MS/MS梯度分離條件為：0～2 min，96%～93% A、4%～7% B，300 nL/min；2～98 min，93%～75% A、7%～25% B，300 nL/min；98～108 min，75%～65% A、25%～35% B，300 nL/min；108～110 min，65%～10% A、35%～90% B，600 nL/min；110～117 min，10%A、90% B，600 nL/min；117～118 min，10%～96% A、90%～4% B，300 nL/min；118～122 min，96% A、4% B，300 nL/min。

1.3.6 乳餅蛋白肽數(shù)據(jù)庫檢索

Xcalibur采集的*.RAW文件用Thermo Proteome Discoverer Daemon（v1.4）轉(zhuǎn)換成*.MGF格式，之后用Mascot 2.2軟件在牛（bovine，蛋白質(zhì)數(shù)目為17 890）蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索。搜庫參數(shù)如下：不設(shè)置酶切、最大漏切數(shù)和固定修飾，可變修飾設(shè)置為甲硫氨酸的氧化（＋15.994 9 Da）。母離子的質(zhì)量容忍偏差為20×10－6，碎片離子為0.1 Da。導(dǎo)出肽段時設(shè)置Score≥30，顯著性差異P＜0.01，同時控制假陽性率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜1%。通過數(shù)據(jù)庫BIOPEP（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）、EROP（http://erop.inbi.ras.ru/）和Milk Bioactive Peptide Database（http://mbpdb.nws.oregonstate.edu/）檢索，評估乳餅水溶性蛋白肽的潛在生物活性。

1.3.7 乳餅蛋白肽生物活性測定

1.3.7.1 體外抗氧化活性測定

參考Liu Jingbo等[12]的方法測定ABTS陽離子自由基清除能力；參考Gecibesler等[13]的方法測定DPPH自由基清除能力；根據(jù)Lin Songyi等[14]的方法測定還原能力。

1.3.7.2α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參照Lim等[15]的方法略作修改。吸取5 μL的25 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液、10 μL的樣品溶液和620 μL pH 6.8的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液于試管中，混勻后于37.5 ℃反應(yīng)20 min，然后加入10 μL 10 mmol/L PNPG溶液，混合并在37.5 ℃反應(yīng)30 min，最后，通過添加650 μL 0.2 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。使用分光光度計測定每個樣品在405 nm波長處的最大吸光度（A）。α-葡萄糖苷酶抑制率按式（1）計算：

1.3.7.3 ACE抑制活性的測定

參照Cushman等[16]的方法略作改動。取5 mL離心管，加入5 mmol/L HHL 底物為0.05 mol/L的硼酸鈉緩沖液200 μL，再加入100 μL待測乳清，混合，在37 ℃水浴中預(yù)熱3 min，加入20 μL ACE酶液，在37 ℃水浴中等待30 min，再加入250 μL 1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。加入1.7 mL乙酸乙酯，振蕩15 s，4 000 r/min離心10 min，取上層的1 mL乙酸乙酯，45 ℃加熱揮發(fā)去除有機(jī)溶劑，再加入3 mL去離子水，并振蕩搖勻30 s，用紫外分光光度計在228 nm波長處測定樣品吸光度。按式（2）計算ACE抑制率：

式中：Aa為未加乳餅蛋白肽對照組吸光度；Ab為反應(yīng)組吸光度；Ac為空白組吸光度。

1.3.7.4 蛋白肽生物活性IC50值測定

將乳餅蛋白肽各超濾組分稀釋成不同的濃度（≥5 個濃度梯度），分別測定其體外抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制率和ACE抑制率，以濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，進(jìn)行非線性擬合，得出回歸方程，并計算各生物活性的IC50值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均做平行實驗，使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，處理結(jié)果以表示，P＜0.05，差異顯著。采用Microsoft Excel 2007和Origin 2019b進(jìn)行圖表繪制；采用Origin 2019b進(jìn)行相關(guān)性分析及繪制相關(guān)性熱圖；采用Image J進(jìn)行電泳條帶強(qiáng)度的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白質(zhì)降解的影響

圖1 FRB和TRB酪蛋白SDS-PAGE圖譜（A）和各酪蛋白組分電泳條帶強(qiáng)度譜圖（B）Fig. 1 SDS-PAGE pattern of casein from rubing cheese (A) and intensity of electrophoretic band of each casein component in FRB and TRB (B)

利用SDS-PAGE測定了FRB和TRB蛋白質(zhì)的降解程度，通過Image J軟件分析2 種蛋白質(zhì)各組分電泳條帶強(qiáng)度，結(jié)果如圖1所示。可知FRB和TRB中的酪蛋白在加工過程中都產(chǎn)生了一定程度的降解，F(xiàn)RB的αs-酪蛋白譜帶灰度低于TRB，而TRB的β-酪蛋白譜帶灰度低于FRB，此外，F(xiàn)RB中的乳清蛋白（β-乳球蛋白和α-乳白蛋白）條帶灰度比TRB淺，說明發(fā)酵酸化技術(shù)對αs-酪蛋白和乳清蛋白產(chǎn)生了更高程度的水解。蛋白降解主要依靠內(nèi)源蛋白酶和微生物蛋白酶的共同作用，發(fā)酵酸化技術(shù)除發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)生的酸水解作用外，非發(fā)酵劑和次生菌群的微生物在發(fā)酵過程中能夠分泌出肽內(nèi)切酶、二肽酶和氨基酸酶等胞外蛋白酶和肽酶，它們會對乳蛋白進(jìn)行特異性的水解，釋放生物活性肽[17]。而傳統(tǒng)的直接酸化工藝是直接加入酸凝劑使牛奶中的蛋白質(zhì)快速沉淀，直接酸化技術(shù)不僅作用于蛋白質(zhì)表面，還作用于膠束內(nèi)部[18]，從而酸水解乳中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生蛋白肽。綜上，直接酸化和發(fā)酵酸化技術(shù)都能促進(jìn)乳蛋白的降解，發(fā)酵酸化技術(shù)對αs-酪蛋白和乳清蛋白的水解程度更高。

2.2 發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白肽中游離氨基酸含量的影響

表1 乳餅水溶性蛋白肽中游離氨基酸含量Table 1 Free amino acid contents of water-soluble peptides in rubing cheese μg/g

由表1可知，乳餅蛋白肽各超濾組分中都含有游離氨基酸，原因是大分子肽具有一定的空間結(jié)構(gòu)，能吸附小分子的游離氨基酸，從而使部分游離氨基酸難以通過超濾達(dá)到與肽完全分離的目的。FRB水溶性蛋白肽超濾組分中的游離氨基酸含量是TRB的3 倍，原因是FRB加工過程中添加了乳酸菌發(fā)酵劑，在發(fā)酵過程中能夠分泌出肽酶和蛋白酶，它們會對乳蛋白進(jìn)行不同程度的水解，釋放出生物活性肽和游離氨基酸[17,19]。乳餅蛋白肽各分離組分中游離氨基酸含量由大到小順序為FRB 3～10 kDa（673.69 μg/g）、FRB＜3 kDa（597.18 μg/g）、TRB 3～10 kDa（196.37 μg/g）、TRB＜3 kDa（181.87 μg/g），馬鹿茸酶解液中3～10 kDa分子質(zhì)量段中的游離氨基酸含量高于＜3 kDa肽段，與本研究結(jié)果一致[20]。FRB超濾組分中具有抗氧化活性的氨基酸（Met、Tyr、His、Lys）[21]含量高于TRB，它們具有將質(zhì)子捐贈給自由基的能力以及具有螯合金屬陽離子的能力，對超濾組分的抗氧化活性具有一定的促進(jìn)作用。較高的疏水性氨基酸（Ala、Val、Pro、Trp、Leu、Met）含量（FRB 3～10 kDa：181.63 μg/g；FRB 3 kDa：144.35 μg/g）對α-葡萄糖苷酶顯示出較好的抑制活性，Leu本身就具有與Ile和Val一起合作修復(fù)肌肉，控制血糖等作用，脯氨酸可能強(qiáng)化目標(biāo)肽段的降糖活性[22]。

2.3 乳餅源生物活性肽分析

表2 乳餅潛在的抗氧化肽、降糖肽和ACE抑制肽Table 2 Potential antioxidant peptides, glycopeptides and ACE inhibitory peptides in rubing cheese

通過LC-MS/MS從FRB和TRB中分別鑒定出467 條和465 條源于酪蛋白和乳清蛋白的蛋白肽，通過數(shù)據(jù)庫檢索注釋到乳餅潛在的ACE抑制肽28 條、潛在的抗氧化肽7 條以及潛在的降糖肽5 條，如表2所示，其中FRB中鑒定出潛在的ACE抑制肽23 條、抗氧化肽6 條和降糖肽5 條，而TRB中分別為13、4 條和1 條。潛在的ACE抑制肽主要來源于β-酪蛋白和α-酪蛋白，潛在的抗氧化肽主要來源于β-酪蛋白和α-酪蛋白，而潛在的降糖肽主要來源于乳清蛋白。原因是酪蛋白中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白含量較高，其靈活又開放的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它們很容易被酶解。由表2可知，傳統(tǒng)的直接酸化工藝和發(fā)酵慢酸化工藝均能促進(jìn)乳蛋白的降解產(chǎn)生抗氧化肽、降糖肽以及ACE抑制肽，但FRB中潛在的活性肽數(shù)量明顯多于TRB，特別是ACE抑制肽[17-18]。研究表明，酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白是ACE抑制肽的主要來源[23-25]，瑞士乳桿菌[26]、干酪乳桿菌[27]、鼠李糖乳桿菌489[28]等乳酸菌能促進(jìn)干酪中ACE抑制肽的釋放。發(fā)酵酸化和直接酸化過程均能作用于酪蛋白膠束，破壞其結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生多肽，但發(fā)酵酸化中乳酸菌自身分泌出肽內(nèi)切酶、二肽酶和氨基酸酶等胞外蛋白酶和肽酶能特異性水解蛋白質(zhì)生產(chǎn)具有生物活性的蛋白肽。

2.4 發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白肽生物活性的影響

2.4.1 發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白肽體外抗氧化活性的影響

2.4.1.1 發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白肽總抗氧化能力的影響

圖2 乳餅蛋白肽超濾組分的ABTS陽離子自由基清除率（A）和IC50值（B）Fig. 2 ABTS radical cation scavenging capacity (A) and IC50 values (B)of the fractions obtained from rubing cheese by ultrafiltration

由圖2A可以看出，隨著乳餅蛋白肽各超濾分離組分質(zhì)量濃度的提高，ABTS陽離子自由基清除活性逐漸增強(qiáng)，分子質(zhì)量為3～10 kDa的FRB和TRB蛋白肽ABTS陽離子自由基清除活性高于其余分離組分清除活性，在質(zhì)量濃度為20 mg/mL時，清除率分別為（85.08±0.26）%和（70.62±1.00）%，具有較好的抗氧化活性。如圖2B所示，分子質(zhì)量為3～10 kDa的FRB和TRB蛋白肽組分ABTS陽離子自由基清除率的IC50值較低，分別為7.32 mg/mL和9.94 mg/mL。酸化技術(shù)對乳餅蛋白肽的ABTS陽離子自由基清除活性影響不顯著（P＞0.05）。

2.4.1.2 發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白肽DPPH自由基清除活性的影響

圖3 乳餅蛋白肽超濾組分的DPPH自由基清除率（A）和IC50值（B）Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity (A) and IC50 values (B) of the fractions obtained from rubing cheese by ultrafiltration

由圖3可以看出，乳餅蛋白肽各超濾組分均具有清除DPPH自由基的能力，且DPPH自由基清除活性表現(xiàn)出顯著濃度依賴關(guān)系。與一些報道的乳清抗氧化肽[29]（IC50=5.52 mg/mL）相比，3～10 kDa乳餅蛋白肽較低的IC50值（FRB：1.66 mg/mL；TRB：1.76 mg/mL）表明該組分具有較好的DPPH自由基清除活性，在質(zhì)量濃度為15 mg/mL時，清除率分別高達(dá)（84.18±0.36）%和（83.80±0.21）%，可能是上述2 個分離組分中含有大量的氨基酸基團(tuán)，能傳遞氫離子或電子給DPPH自由基，從而增強(qiáng)DPPH自由基清除活性。研究表明，瑞氏乳桿菌加工的切達(dá)奶酪水溶性肽（分子質(zhì)量為3～10 kDa，質(zhì)量濃度為5 mg/mL）的DPPH自由基清除率為48.40%[30]，低于發(fā)酵型乳餅的64.22%，說明FRB水溶性肽具有較好的自由基清除活性，可能和加工過程中釋放一些具有螯合自由基的活性多肽和氨基酸有關(guān)。

2.4.1.3 發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白肽還原能力的影響

抗氧化劑通過將電子提供給自由基而獲得一個質(zhì)子從而使自由基變?yōu)榉€(wěn)定分子，還原力越強(qiáng)抗氧化性越強(qiáng)[31]。由圖4可以看出，乳餅蛋白肽各組分的還原能力與其質(zhì)量濃度成量效關(guān)系，分子質(zhì)量＜3 kDa、3～10 kDa的FRB和TRB蛋白肽在其質(zhì)量濃度為10 mg/mL時還原能力分別為0.454±0.007、0.619±0.004和0.548±0.007、0.545±0.005，3～10 kDa的FRB蛋白肽還原能力的IC50值最低，為7.750 mg/mL。酸化技術(shù)對乳餅蛋白肽的還原能力影響不顯著（P＞0.05）。

圖4 乳餅蛋白肽超濾組分的還原能力（A）和IC50值（B）Fig. 4 Reducing power (A) and IC50 values (B) of the fractions obtained from rubing cheese by ultrafiltration

研究表明，鮑魚外套膜酶解物分子質(zhì)量為3～5 kDa的組分對羥自由基和DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于分子質(zhì)量＜1 kDa的組分[32]，分子質(zhì)量在3～10 kDa的鮮馬奶乳清蛋白酶解液體外抗氧化活性高于分子質(zhì)量＜3 kDa的酶解液[33]；酶解駝血制備的抗氧化肽分離各組分的抗氧化活性大小順序為＞10 kDa、3～10 kDa、＜3 kDa[34]。LCMS/MS鑒定發(fā)現(xiàn)乳餅中潛在的抗氧化肽分子質(zhì)量小于3 kDa，但活性測定表明分子質(zhì)量為3～10 kDa的組分具有較好的抗氧化活性，說明超濾組分的抗氧化活性與潛在的抗氧化肽有關(guān)，但同時也和超濾組分的游離氨基酸含量相關(guān)。

2.4.2 發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白肽α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

由圖5可以看出，當(dāng)乳餅蛋白肽的質(zhì)量濃度在5～25 mg/mL之間時，TRB蛋白肽各超濾組分除3～10 kDa組分外均無α-葡萄糖苷酶抑制活性。分子質(zhì)量＜3 kDa和3～10 kDa的FRB蛋白肽表現(xiàn)出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其α-葡萄糖苷酶抑制率IC50值分別為1.25 mg/mL和7.43 mg/mL，顯著低于其余組分（P＜0.05）。添加解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶加工的切達(dá)干酪水溶性提取物表現(xiàn)出α-葡萄糖苷酶抑制活性[35]，分離自駝乳中的乳酸菌能提升發(fā)酵駝乳的抗糖尿病作用[36-37]；鼠李糖乳桿菌GG[38]、干酪乳桿菌LC2W[39]等益生菌發(fā)酵牛乳和駝乳，均能提升發(fā)酵乳的α-葡萄糖苷酶抑制活性，因此，特異性的酶解或乳酸菌發(fā)酵能提升發(fā)酵乳制品的降糖活性。FRB加工過程中添加保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和羅伊斯乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，乳酸菌自身的代謝和酶系統(tǒng)能分解乳蛋白產(chǎn)生一些具有降糖活性的肽，從而提升乳餅的降糖活性，與活性肽鑒定結(jié)果一致。

圖5 乳餅蛋白肽超濾組分的α-葡萄糖苷酶抑制率（A）和IC50值（B）Fig. 5 Percentage of α-glucosidase inhibition by the fractions obtained from rubing cheese by ultrafiltration (A) and their IC50 values (B)

2.4.3 發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅蛋白肽ACE抑制率的影響

乳制品中的ACE抑制肽不僅含量高、無毒害作用，且活性好，約有30%的ACE抑制肽來自于乳制品。由圖6A可以看出，乳餅蛋白肽各組分都有一定的ACE抑制活性。由圖6B可知，F(xiàn)RB未超濾、3～10 kDa和＜3 kDa 3 個組分蛋白肽的ACE抑制率IC50值分別為0.927、0.648 mg/mL和0.416 mg/mL，均顯著低于TRB各組分（1.369、1.496、1.253 mg/mL）。原因是嗜熱鏈球菌和德氏保加利亞乳桿菌亞種的X-脯氨酸二肽氨基肽酶和脯氨酸特異性氨基肽酶能水解乳蛋白產(chǎn)生一些與抑制ACE有關(guān)的生物活性肽[40-41]，與活性肽鑒定結(jié)果一致。成熟24 周的切達(dá)奶酪水溶性肽的ACE抑制率IC50值為0.37 mg/mL[42]，ACE抑制活性強(qiáng)于FRB水溶性，主要原因與其較長成熟期和酶凝工藝有關(guān)。

圖6 乳餅蛋白肽超濾組分的ACE抑制率（A）和IC50值（B）Fig. 6 Percentage of ACE inhibition by the fractions obtained from rubing cheese by ultrafiltration (A) and their IC50 values (B)

2.5 體外生物活性與游離氨基酸相關(guān)性分析

圖7 乳餅蛋白肽超濾組分的體外生物活性與游離氨基酸的相關(guān)性分析Fig. 7 Correlation analysis between free amino acid contents and biological activity of rubing cheese peptides

由圖7可以看出，ACE抑制活性、ABTS陽離子自由基清除率、α-葡萄糖苷酶抑制活性與大多數(shù)游離氨基酸呈正相關(guān)。ACE抑制活性與Ser、Val、Leu、Asp、Trp呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）[43]。α-葡萄糖苷酶抑制活性與Pro、Val、Ile、Leu、Asp、Tyr、Trp等呈正相關(guān)，較高的疏水性氨基酸Pro、Leu、Trp、Met含量對α-葡萄糖苷酶顯示出較好的抑制活性，Leu本身就具有與Ile和Val一起合作修復(fù)肌肉、控制血糖等作用，Pro可能強(qiáng)化目標(biāo)肽段的降糖活性[26]。ABTS陽離子自由基清除率與Hcy、Met、Phe、Trp，Tyr等具有抗氧化活性的氨基酸呈正相關(guān)，它們具有將質(zhì)子捐贈給自由基的能力以及具有螯合金屬陽離子的能力[21]。

3 結(jié) 論

傳統(tǒng)直接酸化和發(fā)酵酸化技術(shù)均能促進(jìn)乳蛋白的降解，發(fā)酵酸化技術(shù)對乳清蛋白的降解程度更高。發(fā)酵酸化過程中，乳酸菌自身的代謝和酶系統(tǒng)能特異性水解乳蛋白產(chǎn)生具有ACE抑制活性、抗氧化活性和降糖活性的生物活性肽，同時促進(jìn)游離氨基酸的釋放，顯著提升乳餅蛋白肽的ACE抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性（P＜0.05）。發(fā)酵酸化技術(shù)能提升乳餅的生物學(xué)價值，研究可為國內(nèi)酸凝奶酪制品工藝的改進(jìn)提供一定的理論依據(jù)。而發(fā)酵酸化技術(shù)對乳餅的品質(zhì)和風(fēng)味形成機(jī)制尚不明確，有待開展相應(yīng)的研究。