高級別漿液性卵巢癌中細胞角蛋白19的表達和意義*

祝彩霞, 袁林靜, 楊娟, 牛剛

中山大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(廣東廣州 510080)

上皮性卵巢癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌，病死率居首位。高級別漿液性卵巢癌(HGSOC)是主要的上皮性卵巢癌類型，占上皮性卵巢癌死亡的70%～80%[1]，進展型HGSOC指病理確診HGSOC，臨床分期FIGOⅢ期或FIGO Ⅳ期的卵巢癌。由于臨床表現(xiàn)不典型和缺乏特異性的檢測手段，患者確診時多為進展型HGSOC，治療以手術(shù)治療和化療為主，但術(shù)后中位無進展生存期僅為18個月[2]。細胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)是分子量最小的Ⅰ類細胞角蛋白，在非小細胞肺癌[3]、甲狀腺癌[4]、宮頸癌[5]和肝細胞癌[6]中均有表達。研究認為，CK19可能通過一系列信號通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。目前關(guān)于CK19在進展型HGSOC的報道匱乏，因此探索進展型HGSOC中CK19的表達和調(diào)控機制有助于指導個體化治療。本研究首先檢測進展型HGSOC中CK19 mRNA的表達，體外實驗分別驗證CK19過表達對卵巢癌細胞的增殖和侵襲的影響，為進展型HGSOC的精準治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2004年1月1日至2014年12月31日我院術(shù)后病理確診HGSOC患者128例，患者年齡33～88歲，平均(61.9±11.67)歲，臨床分期均為FIGOⅢ/Ⅳ期(進展型)，所有患者均未行新輔助化療，術(shù)后均應用TC方案化療(鉑類+紫杉醇)。選取患者腫瘤新鮮組織，保存用于后續(xù)實驗。

納入標準：(1)術(shù)前未進行放射、靶向、免疫和化學治療；(2)病理確診HGSOC；(3)臨床病理分期為FIGO Ⅲ期或FIGO Ⅳ期；(4)患者臨床資料完整，依從性高，配合隨訪。

排除標準：(1)術(shù)前行新輔助化療、放射、靶向或免疫治療；(2)臨床病理分期為FIGO Ⅰ期或FIGO Ⅱ期；(3)合并其他類型腫瘤；(4)心、肝、腎等器官嚴重損傷；(5)卵巢癌復發(fā)者。

隨訪至患者死亡或截止至2019年12月，時間為2～240個月?？偵嫫?overall survival，OS)為初次治療開始至死亡日或終檢值；5年無進展生存期(progression-free survival，PFS)為初次治療至疾病出現(xiàn)進展或任何原因死亡的時間。

研究經(jīng)本院臨床科研和實驗動物倫理委員會審核批準(倫審[2017]222號)。

1.2 細胞及試劑 卵巢腺癌細胞株OVMZ-6由本單位實驗室保存。細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectin(Life Technologies，美國)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Invitrogen，美國)、CK19-pRc/RSV(吉瑪，中國)；MTT(Sigma，美國)、Transwell小室(8 μm，Millipore，美國)；相關(guān)抗體：CK19和GAPDH(Abcam，美國)。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 應用Lipofectin試劑盒轉(zhuǎn)染過表達CK19的質(zhì)粒(CK19-pRc/RSV)和空載質(zhì)粒(pRc/RSV)至生長對數(shù)期的卵巢腺癌細胞OVMZ-6，通過嘌呤霉素(G418)篩選獲得CK19穩(wěn)定過表達的OVMZ-6細胞(OV-CK19)和對照組OVMZ-6細胞(OV-VC)。

1.4 RT-PCR 提取上述HGSOC的腫瘤組織、OV-CK19細胞和OV-VC細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應用Taqman PCR反應體系對各樣本的CK19 mRNA和內(nèi)參HPRT進行qPCR反應，反應條件是：95℃ 3 min 預變性，95℃ 15 s，60℃ 1 min 延伸，共40個循環(huán)。CK19和內(nèi)參HPRT應用Hs00761767_s1和Hs02800695_m1。相對表達量采用2-ΔΔCt法分析。

1.5 Western blot實驗 提取OV-CK19和OV-VC細胞的蛋白，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PDVF膜封閉后，加入一抗(CK19抗體)4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h。清洗后加入ECL溶液，應用激光成像系統(tǒng)顯影檢測CK19蛋白的表達。

1.6 MTT實驗 分別將OV-CK19和OV-VC細胞接種到96孔板(2 000個/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、24、48、72 h后加入MTT，37℃孵育3 h后加入DMSO，室溫孵育20 min，應用用酶聯(lián)免疫檢測儀讀取每孔吸光度，記錄OD值，計算細胞增殖率=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%]。

1.7 Transwell實驗和流式細胞學實驗 取OV-CK19和OV-VC細胞接種于Transwell小室(1×105/孔)，上室加入無血清DMEM培養(yǎng)基，分別于下室加入10%FCS和0.1%BSA/PBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，應用甲醛固定微孔膜下層表面的OV-CK19和OV-VC細胞，結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下隨機挑選5個不重復視野拍照。同時收集轉(zhuǎn)移至下室OV-CK19和OV-VC細胞，流式細胞儀檢測其數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 進展型HGSOC組織中CK19 mRNA的表達 在128例進展型HGSOC患者的CK19 mRNA相對表達量為0.54～24.03，根據(jù)X-tile分析以60.9%為cut-off值分為CK19 mRNA低表達組(78例)和高表達組(50例)。腹腔積液量>500 mL的患者中CK19 mRNA高表達占50%，而腹腔積液量≤500 mL的患者中CK19 mRNA高表達僅占32.1%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.042)。大約50.9%的鉑類耐藥患者CK19 mRNA高表達，而30.1%的非鉑類耐藥的患者CK19 mRNA高表達，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.017)。見表1。CK19 mRNA的表達與進展型HGSOC患者的年齡和腫瘤殘余情況無統(tǒng)計學相關(guān)性。

表1 HGSOC中CK19 mRNA表達和臨床特征

2.2 進展型HGSOC中CK19 mRNA表達的臨床意義 Kaplan-Meier生存曲線顯示，CK19 mRNA高表達組的5年無進展生存期(PFS)明顯降低(圖1-A)，但CK19 mRNA高表達組的總生存期(OS)與CK19 mRNA低表達組差異無統(tǒng)計學意義(圖1-B)。單因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，CK19 mRNA高表達的患者5年P(guān)FS低于CK19 mRNA低表達的患者(P=0.018)，但兩組患者OS差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。多因素回歸分析結(jié)果顯示，CK19 mRNA高表達的患者5年P(guān)FS顯著低于CK19 mRNA低表達的患者，并且獨立于年齡、腫瘤殘余、腹水量等其他風險因素(P=0.049)，見表3。

注：A: PFS; B: OS

表2 單因素回歸分析HGSOC的預后因素

表3 多因素回歸分析HGSOC的預后因素

2.3 卵巢腺癌細胞CK19過表達促進細胞增殖 轉(zhuǎn)染后應用RT-PCR和Western blot檢測，OV-CK19組的CK19 mRNA(圖2-A)和蛋白(圖2-B)均顯著升高，而對照組(OV-VC)均無明顯改變。MTT實驗中，經(jīng)48 h和72 h培養(yǎng)后，OV-CK19組細胞增殖率分別是4.41和8.66，是OV-VC組的1.21倍和1.23倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖3。

注:A: CK19 mRNA表達水平；B: CK19 蛋白表達水平

圖3 CK19過表達增加卵巢腺癌細胞增殖能力

2.4 卵巢腺癌細胞CK19過表達增加細胞侵襲性 運用Transwell小室和流式細胞學實驗發(fā)現(xiàn)，與OV-VC細胞相比，穿過transwell微孔膜抵達下層小室的OV-CK19細胞明顯增加(圖4、5)，CK19過表達顯著增加卵巢腺癌細胞的侵襲能力。

注：A: OV-VC細胞+0.1%BSA；B: OV-VC細胞+10%FCS；C: OV-CK19細胞+0.1%BSA；D: OV-CK19細胞+10%FCS

圖5 CK19過表達增加卵巢腺癌細胞侵襲能力

3 討論

本研究在進展型HGSOC中檢測細胞CK19 mRNA的表達，CK19 mRNA 高表達的患者腹腔積液增多和鉑類耐藥率高，CK19 mRNA高表達是進展型HGSOC的5年無進展生存期的獨立風險因素，體外實驗證實CK19過表達的卵巢腺癌細胞增殖和侵襲能力明顯增加，提示CK19可促進卵巢癌生長和轉(zhuǎn)移，影響患者預后。

研究發(fā)現(xiàn)，CK19在各種上皮源性腫瘤中高表達，如甲狀腺癌[8]、乳腺癌[9]和非小細胞肺癌[10]，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Jin等[11]發(fā)現(xiàn)血清CK19可溶性片段的表達與上皮性卵巢癌患者腫瘤分期、病理學級別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹腔積液有關(guān)。與該研究一致，我們在進展型HGSOC中驗證CK19 mRNA表達與患者腹腹腔積液量相關(guān)。同時，我們發(fā)現(xiàn)CK19 mRNA高表達的患者鉑類耐藥率高，CK19 mRNA高表達的HGSOC患者5年P(guān)FS低于CK19 mRNA低表達患者。Wu等[12]發(fā)現(xiàn)CK19可溶性片段和CA125的表達增加與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和鉑類耐藥相關(guān)，CK19可溶性片段高表達的患者OS和PFS均降低，佐證了本研究結(jié)果。

我們通過MTT實驗證實CK19過表達可增加卵巢腺癌細胞OVMZ-6增殖能力。Lu等[13]在卵巢腺癌細胞SKOV-3中過表達CK19，發(fā)現(xiàn)CK19可激活Wnt/β-catenin信號通路，引起卵巢癌細胞增殖增加。研究認為CK19參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Saha等[14]在結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CK19可與β-catenin/RAC1復合物，進而促進結(jié)腸癌細胞增殖。在肝癌細胞中過表達CK19可增加細胞增殖和抑制細胞凋亡[6]。我們進一步實驗發(fā)現(xiàn)CK19過表達促進卵巢腺癌細胞侵襲，使穿越Matrigel膜的卵巢腺癌細胞增多。Govaere等[15]在肝細胞癌細胞Huh-7D12中敲降CK19后，肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降，提示CK19可能促進癌細胞侵襲和遷移。Saha等[16]發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞中CK19可直接與β-catenin/RAC1復合物結(jié)合，介導下游NUMB相關(guān)性Notch信號通路，激活腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。在卵巢癌細胞SKOV-3的研究中，CK19可上調(diào)β-catenin、C-myc和cyclinD1，進而促進卵巢癌細胞侵襲和遷移[13]。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)CK19過表達可激活甲狀腺癌細胞上皮間質(zhì)化，促進腫瘤細胞侵襲和遷移。因此，CK19可通過介導下游信號通路影響卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移，但其涉及的具體分子機制仍需要進一步實驗驗證。

本研究旨在探討CK19 mRNA的表達與進展型HGSOC的臨床特征和預后之間的關(guān)系，由于樣本收集的年代跨度較大，手術(shù)和化療水平的改進，可能導致統(tǒng)計學偏倚；另外，本研究未就正常卵巢組織中CK19 mRNA的表達情況進行分析；上述問題均有待開展進一步研究。

綜上所述，進展型HGSOC中CK19過表達與鉑類耐藥和5年無進展生存期相關(guān)，CK19過表達可促進卵巢腺癌細胞增殖和侵襲。由于CK19過表達可引起患者血清CK19可溶性片段CYFRA21-1表達水平增加，可為進展型HGSOC預后評估和靶向治療提供新的思路。

利益相關(guān)聲明：本文所有作者聲明無相關(guān)利益沖突。

作者貢獻說明：祝彩霞參與醞釀和設計實驗，分析解釋數(shù)據(jù)；起草論文；統(tǒng)計分析。袁林靜參與實施研究，采集數(shù)據(jù)；獲取研究經(jīng)費。楊娟參與實施研究，采集數(shù)據(jù)；統(tǒng)計分析。牛剛參與醞釀和設計實驗；對論文的知識性內(nèi)容做批評性審閱；指導工作。