回旋狀脈絡膜視網(wǎng)膜萎縮一家系的新型突變與臨床觀察

張文華，但漢東，李曉麗，黃子旭，宋宗明

0引言

回旋狀脈絡膜視網(wǎng)膜萎縮(gyrate atrophy of choroid and retina，GA)是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病，是由于編碼線粒體酶鳥氨酸轉氨酶(ornithine aminotransferase，OAT)的OAT基因(OMIM 258870)突變引起的，該酶是精氨酸和鳥氨酸轉化為主要的興奮性和抑制性神經(jīng)遞質谷氨酸和γ-氨基丁酸的關鍵酶。流行病學研究顯示，GA的全球發(fā)病率約為1/1500000[1]，其主要的眼部癥狀和體征包括夜盲、高度近視、早期白內障形成以及脈絡膜視網(wǎng)膜環(huán)形萎縮、黃斑病變等，萎縮性病變具有扇形或花環(huán)狀邊界，因此稱為“回旋狀”[2]。

OAT基因定位在常染色體10q26.13，全長22kb[3-4]。30多年前，第一次在GA患者中發(fā)現(xiàn)了OAT突變[5]，OAT基因在脈絡膜視網(wǎng)膜中高度表達，尤其在視網(wǎng)膜色素上皮層活性最高[6-7]。HGMD(Human Gene Mutation Database)數(shù)據(jù)庫顯示該基因存在68種不同的致病性突變，突變基因位點分布在整個基因序列中，沒有明顯的突變熱點，大部分突變類型為錯義突變，其次是無義突變和移碼變異，還有剪接變體和一種影響ATG起始密碼子的突變[1]。雖然目前已明確多種變異類型，但仍有很多致病性突變尚未發(fā)現(xiàn)。本研究采用全外顯子組測序檢測一個中國GA家系兩代人(共6名家庭成員)的致病突變，通過對每名家庭成員進行常規(guī)眼科檢查及全外顯子組測序分析來探究與該家系GA相關的致病性變異及分子學病因。

1對象和方法

1.1對象回顧性分析2019-06/2021-08于我院治療的GA患者的臨床資料。納入標準：(1)明確診斷為GA，全外顯子組測序分析顯示存在OAT基因新型致病性變異；(2)參與本研究的親屬與確診患者存在血緣關系、能夠配合所有檢查。排除標準：(1)合并其他眼部疾病的患者；(2)接受過內眼手術、受過眼部外傷的患者。所有患者均就診于河南省立眼科醫(yī)院，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查通過，研究內容符合《赫爾辛基宣言》的宗旨，所有參與者或其監(jiān)護人均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1臨床檢查對先證者及其相關的家庭成員采集詳盡的家族史及臨床數(shù)據(jù)，進行最佳矯正視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡和檢眼鏡、彩色眼底照相以及頻域光學相干層析成像(SD-OCT)等眼科檢查，并通過氣相色譜質譜聯(lián)用儀測定外周血液中鳥氨酸的濃度。

1.2.2全外顯子組測序和生物信息學分析抽取該家系中6名家庭成員的外周血樣本，每個血液樣本約5mL，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(51106)從全血中提取DNA，通過Qubit及瓊脂糖凝膠電泳測定提取的DNA樣本含量及質量。應用Roche SeqCap EZ MedExome Kit進行目標區(qū)域捕獲，使用Illumina Hiseq X-ten二代測序儀對富集的文庫進行PE150測序，平均測序深度為100X，測序后得到FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)，再進行生物信息學分析，在二代測序檢測出的突變位點中進行Sanger驗證排除假陽性。

1.2.3Sanger驗證和共分離分析根據(jù)變異位點信息在UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在線工具上查找對應的基因組序列，利用Prime Primer 5軟件設計引物。引物在PCR過程中用于擴增樣本中包含變異位點的基因片段。將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶并判斷產(chǎn)物的大小與擴增情況。利用Axygen的AxyPrep PCR Clean up Kit(AP-PCR-250)對PCR產(chǎn)物進行純化，通過Qubit對回收的PCR產(chǎn)物進行定量后再進行第二輪PCR，即Sanger PCR。然后利用BigDye XTerminatorTMPurification Kit(4376486)對產(chǎn)物進行純化，利用ABI的Applied Biosystems?3730xl DNA Analyzer進行測序，最后在Sanger測序峰圖上找出需要測序的位點，并判斷是否有變異。

2結果

2.1臨床表現(xiàn)該家系中共6名家庭成員參與研究。先證者(Ⅲ:3)為6歲女童，因自幼視力差，近1a來視力明顯下降伴夜盲就診。既往無特殊病史。否認父母近親結婚史及家族性遺傳學疾病史?；颊甙l(fā)育正常，神經(jīng)系統(tǒng)未見異常。最佳矯正視力：右眼-5.75DS/-2.75DC*180=0.4；左眼-5.50DS/-3.25DC*5=0.25。眼壓：右眼14.7mmHg；左眼16.2mmHg。裂隙燈顯微鏡檢查雙眼前節(jié)未見異常，玻璃體輕度混濁；眼底檢查可見周邊部視網(wǎng)膜色素上皮細胞和脈絡膜毛細血管萎縮，視網(wǎng)膜脈絡膜萎縮呈鋪路石樣改變，病灶邊界清楚，形態(tài)不規(guī)則，萎縮病灶之間的視網(wǎng)膜正常(圖1)。SD-OCT檢查雙眼可見視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮囊樣改變，視網(wǎng)膜劈裂且劈裂累及黃斑，右眼和左眼中心凹厚度分別為439、483μm(圖2)。外周血鳥氨酸濃度為360.57μmol/L(參考范圍41～290μmol/L[8])。先證者的叔叔(Ⅱ:1)、父親(Ⅱ:2)、母親(Ⅱ:3)、哥哥(Ⅲ:1)、姐姐(Ⅲ:2)均無任何異常癥狀或體征。先證者因其臨床表現(xiàn)與體征被診斷為GA。

圖1 先證者眼底照相結果 可見雙眼周邊部視網(wǎng)膜呈鋪路石樣改變，視網(wǎng)膜、脈絡膜萎縮，部分萎縮病灶相互融合成片，邊緣呈花瓣狀，黃斑區(qū)可見劈裂。A：右眼；B：左眼。

圖2 先證者SD-OCT檢查結果 雙眼可見神經(jīng)上皮囊樣改變，視網(wǎng)膜劈裂且劈裂累及黃斑，右眼和左眼中心凹厚度分別為439、483μm。A：右眼；B：左眼。

2.2全外顯子組測序結果全外顯子組測序結果顯示，先證者的OAT基因存在復合雜合型突變，在第6外顯子和第10外顯子上分別發(fā)現(xiàn)錯義突變c.722C>T(p.P241L)和無義突變c.1186C>T(p.R396X)。該錯義突變導致所編碼的氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼?。該無義突變使1個編碼氨基酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼子，提前終止多肽鏈的合成，導致截短蛋白的產(chǎn)生，從而引起OAT基因表達異常?；颊叩母赣H(Ⅱ:2)和哥哥(Ⅲ:1)均檢出雜合型p.R396X致病變異，患者的母親(Ⅱ:3)檢出雜合型p.P241L致病變異，其他樣本未檢出。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)變異分類標準，p.R396X為致病變異，p.P241L為可能致病變異(表1)。

表1 高度影響患者表型的變異

2.3Sanger驗證與共分離分析Sanger驗證結果顯示，先證者在變異位點OATc.1186C>T出現(xiàn)的變異類型與其父親及哥哥一致，在變異位點OATc.722C>T出現(xiàn)的變異類型與其母親一致。該家系的Sanger驗證結果見圖3，遺傳圖譜見圖4。通過多種算法預測，在變異位點OATc.722C>T出現(xiàn)的p.P241L錯義變異類型是有害的。這兩種變異在多人口種族數(shù)據(jù)庫中的可匹配人群不多見，除上述變異類型外，不存在可能對患者表型有影響的變異，以及與患者部分臨床表型相關的其它變異。

圖3 Sanger驗證基因測序圖譜 A：Sanger驗證對6名家庭成員在突變位點OAT c.1186C>T的基因測序圖譜顯示先證者(Ⅲ:3)與其父親(Ⅱ:2)、哥哥(Ⅲ:1)均檢出雜合型p.R396X致病變異，這種突變類型因堿基G突變?yōu)閴A基A引起。紅色：先證者的突變堿基；黃色：先證者父親和哥哥的突變堿基。B：Sanger驗證對6名家庭成員在突變位點OAT c.722C>T的基因測序圖譜顯示先證者(Ⅲ:3)和其母親(Ⅱ:3)檢出雜合型p.P241L致病變異，這種突變類型因堿基G突變?yōu)閴A基A引起。紅色：先證者的突變堿基；黃色：先證者母親的突變堿基。

圖4 OAT基因突變家系的遺傳圖譜 先證者為復合雜合性突變，該突變類型在家系中呈完全共分離狀態(tài)。圓圈：未受影響的女性；方框：未受影響的男性；單斜線符號：未納入本研究的家庭成員；多斜線符號：檢出雜合型的參與者；黑色實心圓圈：先證者。

3討論

本研究納入的家系成員中，先證者OAT基因的第6外顯子和第10外顯子上分別發(fā)現(xiàn)錯義突變c.722C>T(p.P241L)和無義突變c.1186C>T(p.R396X)，這是一種復合雜合型變異，前者為首次報道的變異類型，來源于其母親，后者來源于其父親，除先證者以外，其余家庭成員均無異常表現(xiàn)。先證者存在接近-6.00D的近視和2.00D以上的散光，以視力下降和夜盲為主要癥狀，晶狀體目前未見異常，眼底表現(xiàn)出典型的回旋狀視網(wǎng)膜脈絡膜萎縮灶，暫無其他系統(tǒng)的特殊表現(xiàn)。但因先證者年齡小，暫時無法有效配合視野檢查，我們會在隨訪過程中補充。本研究通過全外顯子組測序技術、生物信息學分析、Sanger驗證及共分離分析，明確了導致GA的基因突變位點及家系遺傳方式。

典型的GA本質上是一種眼科疾病，首先會累及周邊部視網(wǎng)膜色素上皮，隨后由周邊部向后極部進行性發(fā)展同時伴發(fā)漸進性視野縮小，最終導致全脈絡膜視網(wǎng)膜病變[9]。早期表現(xiàn)為夜盲，青少年時期出現(xiàn)后囊下白內障，最遲在60歲時導致失明[10]。眼底照相能夠直觀反映病灶形態(tài)。結合眼底熒光素血管造影(FFA)有助于GA的早期診斷，F(xiàn)FA所顯示的病變范圍可以超出眼底檢查所見的范圍，有利于發(fā)現(xiàn)位于赤道部小范圍的早期淡黃色病灶[11]。此外，視野檢查也有助于判斷疾病進展的情況，早期視野可無明顯改變，后期逐漸出現(xiàn)進行性向心性視野縮小，形成管狀視野[12]。也有研究報道了發(fā)生于骨骼肌、中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的眼外表現(xiàn)，然而，在多數(shù)情況下，這些系統(tǒng)的表現(xiàn)是亞臨床的[13]。無脈絡膜癥(choroideremia，CHM)與GA有類似的臨床表現(xiàn)，CHM是由于X染色體長臂上的CHM基因缺失或突變導致的，其男性患者發(fā)病較早，通常癥狀從早期的夜盲癥逐漸發(fā)展為周邊視野缺失，到晚年僅存中心管狀視野，最終失明；而女性患者一般為攜帶者，無臨床癥狀[14]。眼底典型表現(xiàn)為早期視網(wǎng)膜色素上皮細胞變性，眼底呈椒鹽狀，中期病變逐漸從周邊視網(wǎng)膜向后極部發(fā)展，晚期眼底色素上皮幾乎完全被破壞，脈絡膜血管消失并萎縮，鞏膜外露，僅殘留黃斑區(qū)一小塊邊界清楚的脈絡膜[15]。

OAT能將精氨酸和鳥氨酸轉化為主要的興奮性和抑制性神經(jīng)遞質谷氨酸和γ-氨基丁酸，是該途徑中的關鍵酶。缺乏這種酶會導致血漿和組織中的鳥氨酸水平升高，進而對視網(wǎng)膜產(chǎn)生毒性作用[8]。有研究者認為二氫吡咯羧化物(P5C)缺乏或肌酸缺乏對視網(wǎng)膜功能的拮抗作用是重要的致病因素[16]。P5C是鳥氨酸與脯氨酸之間的中間產(chǎn)物，由OAT和P5C合酶合成。生理濃度鳥氨酸對P5C合酶有抑制作用，OAT缺乏會導致鳥氨酸堆積及P5C生成減少。因此，在GA患者中，形成P5C的兩條通路均出現(xiàn)障礙，從而導致脯氨酸合成減少或P5C調節(jié)作用受損，視網(wǎng)膜細胞內因脯氨酸缺乏而引起眼病[17-18]。此外，精氨酸在甘氨酸轉氨酶作用下合成肌酸，但鳥氨酸是甘氨酸轉氨酶的強競爭性抑制劑，所以GA患者也會出現(xiàn)肌酸代謝異常進而出現(xiàn)相應的肌肉病變，如Ⅱ型肌纖維萎縮和肌無力[19]。GA患者血清、尿液、腦脊液、房水中的鳥氨酸濃度可以為正常人的10～20倍[20]，通過限制精氨酸的攝入可以限制鳥氨酸的來源，補充維生素B6也是可選擇的治療方法，部分患者經(jīng)過治療可將血清鳥氨酸濃度降低到正常水平，從而減緩病情惡化及視力喪失的進度[21]。也有部分患者僅存在GA眼底表現(xiàn)，但沒有血液鳥氨酸濃度的升高[22]。本研究中先證者外周血鳥氨酸濃度為360.57μmol/L，高于正常值范圍，目前正通過飲食控制精氨酸的攝入，需定期隨訪。

遺傳性眼病不同變異類型的臨床表現(xiàn)不盡相同，明確基因型和臨床表型之間的關系有利于輔助基因治療的研究[23]。王曉光等[4]在OAT基因第4外顯子和第10外顯子上發(fā)現(xiàn)雙等位基因突變c.461G>A(p.R154H)和c.1186C>T(p.R396X)，該患者除GA眼底表現(xiàn)外，存在綠色和藍色色盲，雙眼視野向心性縮小，視網(wǎng)膜電圖示視桿細胞和視錐細胞的a和b波呈熄滅型，同時合并血鳥氨酸濃度的嚴重升高。Jalali等[16]在OAT基因第5外顯子發(fā)現(xiàn)純合型突變c.425-1G>A，該患者除GA眼底表現(xiàn)外合并有高鳥氨酸血癥和中度肌無力。本研究中的先證者年齡尚小，目前處于疾病早期階段，隨著疾病的進展視力是否會進一步下降，是否會出現(xiàn)白內障、色盲或其他癥狀仍需隨訪觀察。