匹伐他汀鈣光降解雜質(zhì)的合成

林輝，王正澤，陳慧（南京長澳醫(yī)藥科技有限公司，南京 210038）

匹伐他汀鈣，化學(xué)名為（＋）-雙-｛（3

R

，5

S

，6

E

）-7-[2-環(huán)丙基-4-（4-氟苯基）-3-喹啉基]-3，5-二羥基-6-烯庚酸｝單鈣鹽，是由日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會社和日本興和株式會社共同研制的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，于2003年在日本上市，主要用于高膽固醇血癥和家族性高膽固醇血癥治療。他汀類原料藥如匹伐他汀鈣、氟伐他汀鈣、阿托伐他汀鈣和瑞舒伐他汀鈣等通常對光照敏感，原料藥及制劑產(chǎn)品在生產(chǎn)和貯存過程中若曝露于光環(huán)境中，會發(fā)生光環(huán)化和光氧化反應(yīng)，分解成不同類型的降解產(chǎn)物。文獻(xiàn)報道匹伐他汀鈣經(jīng)曝光可分解為（＋）-雙-｛（3

R

，6

E

）-7-[2-環(huán) 丙 基-4-（4-氟 苯 基）-3-喹 啉 基]-3-羥基-5-氧代-6-烯庚酸｝單鈣鹽（簡稱5-酮體，1）和（＋）-雙-｛（3

R

，5

S

）-5-[6-環(huán) 丙 基-7，8-二氫-10-氟苯并[k]菲啶-8-基]-3，5-二羥基戊酸｝單鈣鹽（簡稱閉環(huán)體，2）。匹伐他汀鈣及其光降解雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 匹伐他汀鈣及其降解雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of pitavastatin calcium and its photodegradable impurities

由于匹伐他汀鈣對光照比較敏感，因此在工藝開發(fā)和處方研究時，需要考察光照對匹伐他汀鈣及有關(guān)物質(zhì)的影響。高效液相色譜（HPLC）法可以準(zhǔn)確直觀地反映各雜質(zhì)的變化情況，是目前用于控制藥物有關(guān)物質(zhì)的主要方法，但其前提是獲得被測雜質(zhì)的對照品。本文主要研究了匹伐他汀鈣光降解產(chǎn)物1和2的制備方法，可以為匹伐他汀鈣原料藥及制劑工藝研究、篩選合適的遮光劑和包裝材料提供雜質(zhì)對照品。

本課題組前期以匹伐他汀鈣為原料，經(jīng)2，3-二氯-5，6-二氰對苯醌（DDQ）氧化，再經(jīng)柱層析分離得到化合物1，總收率為28%。但該方法通過飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng)，易析出大量固體，包裹產(chǎn)物，造成產(chǎn)物損失。DDQ氧化性較強(qiáng)，選擇性較差，除了氧化C-5位羥基外，還會繼續(xù)氧化C-3位羥基，生成副產(chǎn)物3，5-二酮體。DDQ在萃取或者柱層析工序中均不易去除，從而在產(chǎn)物中殘留。產(chǎn)物極性大，柱層析分離純化效果差，產(chǎn)物純度僅96.0%。本研究最初參照文獻(xiàn)方法，以二甲基亞砜為溶劑，采用二氧化錳（MnO）氧化匹伐他汀鈣制備化合物1，但HPLC檢測顯示無目標(biāo)產(chǎn)物1產(chǎn)生。后嘗試采用鉻氧化物、高錳酸鹽、金屬銠絡(luò)合物和高價碘試劑氧化匹伐他汀鈣，但這些氧化劑選擇性差，副產(chǎn)物多，后處理復(fù)雜，產(chǎn)物難分離純化。本研究在文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，選擇活性MnO氧化匹伐他汀游離酸得5-氧代匹伐他?。?），再在堿性條件下成鈣鹽制得化合物1。合成路線如圖2所示。該路線反應(yīng)條件溫和，可選擇性氧化C-5位烯丙醇，不會引起雙鍵的異構(gòu)化，反應(yīng)收率高；反應(yīng)液為非均相，后處理只需簡單地過濾；底物和產(chǎn)物為羧酸形式，產(chǎn)物易通過柱層析或者重結(jié)晶的方式分離純化。

Grobelny等將匹伐他汀鈣樣品溶液暴露于紫外光中，HPLC檢測到包含化合物2在內(nèi)的4種光降解產(chǎn)物。文獻(xiàn)報道了其他他汀類結(jié)構(gòu)如氟伐他汀鈣和瑞舒伐他汀鈣在水中通過陽光或紫外光照射發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，產(chǎn)生非對映異構(gòu)體二氫苯并咔唑和二氫苯并喹唑啉結(jié)構(gòu)，并通過制備HPLC分離出毫克級樣品用于結(jié)構(gòu)確證。以上3種他汀類化合物均含鄰乙烯基聯(lián)苯結(jié)構(gòu)，易發(fā)生光環(huán)化反應(yīng)，生成穩(wěn)定的類二氫菲結(jié)構(gòu)，因此，本研究選擇光環(huán)化的方法制備化合物2，最初采用匹伐他汀鈣或匹伐他汀游離酸進(jìn)行光環(huán)化，由于產(chǎn)物極性過大，柱層析分離純化效果差。Cermola等利用重氮甲烷進(jìn)行甲基化制得甲酯，降低光降解產(chǎn)物的極性，再經(jīng)制備HPLC分離純化。本研究參考上述方法，將匹伐他汀經(jīng)對甲苯磺酸催化，分子內(nèi)脫水內(nèi)酯化得到匹伐他汀內(nèi)酯（4），化合物4在光照條件下發(fā)生光環(huán)化反應(yīng)制得內(nèi)酯閉環(huán)體非對映異構(gòu)體（5），再在堿性條件下水解、成鹽轉(zhuǎn)化為化合物2。合成路線如圖2所示。該路線選擇內(nèi)酯結(jié)構(gòu)作為底物進(jìn)行光降解反應(yīng)，產(chǎn)物極性降低，易分離純化；底物溶解度更高，溶液狀態(tài)有利于光環(huán)化反應(yīng)。

圖2 匹伐他汀鈣5-酮體和閉環(huán)體的合成Fig 2 Synthetic routes of pitavastatin calcium 5-keto form and ring-closed form

1 儀器與試藥

7890型高效液相色譜儀、6200 Q-TOF型質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；AV-500型核磁共振儀、AV-400型核磁共振儀（德國Bruker公司）；ZF-1型三用紫外分析儀（上海光豪）。柱層析使用100～200目硅膠（青島海洋化工五廠，試劑級）。匹伐他汀鈣（江蘇天晟藥業(yè)有限公司，藥用級）；活性MnO（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1 匹伐他汀的合成

在反應(yīng)瓶中加入匹伐他汀鈣（80.0 g）、乙酸乙酯（400 mL）和水（200 mL），室溫下攪拌15 min。用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH 3，繼續(xù)攪拌10 min，分液。水層用乙酸乙酯（100 mL×3）萃取。合并有機(jī)層用飽和氯化鈉溶液（200 mL）洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后抽濾，濾液減壓蒸除溶劑，得無色油狀物匹伐他汀（72.1 g，以匹伐他汀鈣計收率為94.2%）。

2.2 匹伐他汀鈣5-酮體（1）的合成

將匹伐他?。?0.0 g，71.18 mmol）溶于干燥二氯甲烷（300 mL）中分批加入活性MnO（116.3 g，1.07 mol），回流攪拌10 h。用硅藻土填充的漏斗抽濾，濾餅用二氯甲烷（50 mL×3）洗滌，合并濾液，減壓蒸除溶劑。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜[洗脫液為二氯甲烷-甲醇（80～20∶1）]純化剩余物得淺棕色油狀物3。加入水（180 mL），用1 mol·L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為9。冰浴冷卻，滴加1 mol·L乙酸鈣（29 mL），攪拌1 h。抽濾，濾餅水洗滌，烘干，得淺黃色固體1（17.1 g，以匹伐他汀計收率為54.8%），純度為99.0%[HPLC歸一化法：色譜柱C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為pH 3.8醋酸鈉緩沖溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0→20 min：60%A，20→40 min：60%→30%A，40→65 min：30%A）；檢測波長245 nm；柱溫40℃；流速1.0 mL·min。相對保留時間1.3（相對于匹伐他汀鈣）]。mp. 139.6～140.6℃；H NMR（500 MHz，DMSO-

d

）

δ

：7.89（d，

J

＝8.35 Hz，1H，Ar-H），7.68（t，

J

＝7.45 Hz，1H，Ar-H），7.57（d，

J

＝16.5 Hz，1H，＝CH），7.31～7.43（m，6H，Ar-H），6.34（d，

J

＝16.5 Hz，1H， ＝CH），5.61（br，1H，CHOH），4.16（s，1H，CH），2.53～2.63（m，1H，CH），2.40～2.45（m，1H，CH），2.15～2.19（m，1H，CH），2.05～2.10（m，1H，CH），1.26（s，2H，CH），1.09～1.10（m，3H，CH）；C NMR（125 MHz，DMSO-

d

）

δ

：198.13（C＝O），177.90，162.81，160.86，159.68，146.49，145.34，138.41，134.43，132.04，131.88，129.74，128.38，127.31，125.99，125.83，125.14，115.50，115.33，64.97，55.98，47.85，43.78，18.48，15.86，10.69，10.66；HRMS-ESI calcd for CHFNO[M-Ca ＋2H]420.1606，found 420.1609。

2.3 匹伐他汀內(nèi)酯（4）的合成

將匹伐他?。?0.0 g，23.73 mmol）溶于二氯甲烷（100 mL）中，加入一水對甲苯磺酸（0.5 g），回流攪拌4 h。冰浴冷卻，加入飽和碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH為7，分液。有機(jī)層用飽和氯化鈉溶液（50 mL）洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后抽濾，濾液減壓蒸除溶劑。剩余物用乙酸乙酯-正己烷重結(jié)晶，得類白色固體4（8.4 g，以匹伐他汀計收率為87.8%）。mp. 127.1～127.9℃；H NMR（500 MHz，CDCl）

δ

：8.05（d，

J

＝6.65 Hz，1H，Ar-H），7.67（t，

J

＝7.35 Hz，1H，Ar-H），7.31～7.45（m，2H，Ar-H），7.21～7.26（m，4H，Ar-H），6.77（d，

J

＝16.15 Hz，1H， ＝CH），5.69（dd，

J

＝1.65，16.15 Hz，1H，＝CH），5.22（m，1H，CH），4.28～4.30（s，1H，CHOH），2.72～2.76（m，1H，CH），2.62～2.66（m，1H，CH），2.40～2.45（m，1H，CH），2.2（br，1H，CHOH），1.84（d，

J

＝14.25 Hz，1H，CH），1.66（dd，

J

＝2.4，13.4 Hz，1H，CH），1.40～1.42（m，2H，CH），1.11（d，

J

＝7.9 Hz，2H，CH）；HRMS-ESI calcd for CHFNO[M＋H]404.1656，found 404.1663。

2.4 匹伐他汀鈣閉環(huán)體（2）的合成

將4（5.0 g，12.39 mmol）溶于二氯甲烷（1000 mL）中。將溶液裝入透明玻璃量瓶中，置于紫外燈下，365 nm波長照射5 d，減壓蒸除溶劑。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜[洗脫液為正己烷-乙酸乙酯（1∶1～2）]純化，得黃色油狀物5。將5（3.5 g，8.68 mmol）溶于乙腈（35 mL），加入1 mol·L氫氧化鈉（9 mL），室溫攪拌3 h，減壓蒸除溶劑。剩余物加入水（35 mL）稀釋，冰浴冷卻，滴加1 mol·L乙酸鈣（5.2 mL，5.2 mmol），攪 拌2 h，抽 濾，濾餅水洗滌，烘干，得黃色固體2（2.9 g，以4計收率為52.7%），純度為99.7%[HPLC歸一化法：色譜條件同1，兩個非對映異構(gòu)體相對保留時間分別為0.53，0.55（相對于匹伐他汀鈣），以兩個非對映異構(gòu)體峰面積總和計]。mp. 148.8～151.5℃；H NMR（500 MHz，MeOH-

d

）

δ

：8.39（t，

J

＝9.45 Hz，2H，Ar-H），7.95～8.00（m，4H，Ar-H），7.68（t，

J

＝7.1 Hz，2H，Ar-H），7.51～7.54（m，2H，Ar-H），7.32（d，

J

＝9.2 Hz，2H，Ar-H），7.17～7.21（m，2H，Ar-H），4.04～4.09（m，1H，CH），3.90～3.96（m，2H，CHOH），3.62～3.65（m，1H，CH），3.55～3.56（m，2H，CHOH），2.88～3.08（m，4H，CH），2.43～2.50（m，2H，CH），2.05～2.18（m，4H，CH），1.63～1.80（m，4H，CH），1.42～1.44（m，1H，CH），1.26～1.27（m，1H，CH），1.12～1.20（m，3H，CH），1.02～1.11（m，3H，CH）；C NMR，DEPT（125 MHz，MeOH-

d

）

δ

：180.22，180.19，164.92，164.83，162.25，161.43，149.01，148.85，145.55，144.78139.91，139.67，139.91，132.67，132.37，129.96，129.80，129.61，129.42，129.35，129.32，128.82，126.75，126.70，126.18，126.12，124.25，124.17，118.03，117.56，114.70，114.30，71.01（CH），69.70（CH），69.51（CH），69.00（CH），46.71（CH），45.06（2C，CH，CH），45.03（CH），43.00（CH），42.47（CH），26.71（CH），27.61（CH），15.87（CH），9.27（CH），9.89（CH），8.26（CH），7.73（CH）；F NMR（376 MHz，MeOH-

d

）

δ

： －114.1（s，Ar-F）， －114.7（s，Ar-F）；歸屬于其中信號較弱的異構(gòu)體。HRMS-ESI calcd for CHFNO[M-Ca＋2H]422.1762，found 422.1758。

3 結(jié)果與討論

本文在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上對化合物1的合成方法進(jìn)行了改進(jìn)。原料使用匹伐他汀游離酸代替鈣鹽，降低了底物和產(chǎn)物的極性，容易通過柱層析分離純化，產(chǎn)物純度提高到99.0%（文獻(xiàn)為96.0%）。氧化反應(yīng)氧化劑用MnO代替DDQ，反應(yīng)選擇性更高，反應(yīng)后處理簡單。工藝優(yōu)化發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度、MnO的用量和加入方式對反應(yīng)速率、副產(chǎn)物含量和反應(yīng)收率影響較大，反應(yīng)溫度由室溫提高至40～50℃，大大縮短了反應(yīng)時間；優(yōu)化MnO的用量為15當(dāng)量（以匹伐他汀計），通過分批加入MnO的方式，可減少副產(chǎn)物4的生成。市售MnO粒度較小，過濾時加入硅藻土助濾，可以提升過濾速度。合成總收率提高至52%（文獻(xiàn)為28%，以匹伐他汀鈣計）。

化合物1的高分辨率質(zhì)譜（HRMS）實測值和計算值誤差在±0.0030之內(nèi)，核磁共振氫譜（H NMR）和碳譜（C NMR）測試數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致。

本文從匹伐他汀鈣光降解機(jī)制出發(fā)，首次報道采用光環(huán)化方法成功合成克級化合物2，總收率為44%，產(chǎn)物純度為99.7%。4的光環(huán)化反應(yīng)遵循鄰乙烯基聯(lián)苯類化合物的光環(huán)化反應(yīng)機(jī)制：第一步底物4經(jīng)光照射發(fā)生環(huán)化，產(chǎn)生不穩(wěn)定非對映異構(gòu)體混合物4'；第二步，中間體4'由于失去芳香性，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會發(fā)生1，5-氫遷移反應(yīng)，生成穩(wěn)定的二氫苯并[k]菲啶結(jié)構(gòu)5。反應(yīng)機(jī)制如圖3所示。

圖3 化合物4光環(huán)化反應(yīng)機(jī)制Fig 3 Mechanism of compound 4 photocyclization

化合物2的HRMS實測值和計算值誤差在±0.0030之內(nèi)，HPLC和核磁共振氟譜（F NMR）分別顯示兩組峰，表明2為非對映體混合物，HPLC的紫外峰積分比例約1∶1，與文獻(xiàn)報道一致。徐敏等研究苯醚甲環(huán)唑非對映異構(gòu)體發(fā)現(xiàn)，在核磁共振譜中非對映異構(gòu)體相應(yīng)的信號存在差別，特別是C NMR譜信號峰成對出現(xiàn)。2的H NMR譜中兩種構(gòu)型C-6位碳原子上的質(zhì)子化學(xué)位移分別為

δ

4.04～4.09和

δ

3.90～3.96，積分比例約1∶1，與HPLC的UV峰積分一致。C NMR譜顯示了50個信號，其中24組峰成對出現(xiàn)（一強(qiáng)一弱），2個重疊峰，分別對應(yīng)非對映異構(gòu)體中25個碳原子。DEPT譜顯示分子中含 5組仲碳、11組叔碳和9組季碳，符合2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。與匹伐他汀鈣的NMR數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)其新增了一個附加環(huán)，少了一個烯鍵和一個芳香質(zhì)子。

4 結(jié)論

本研究成功合成了匹伐他汀鈣5-酮體（1）和閉環(huán)體（2）兩種光降解雜質(zhì)，并經(jīng)核磁共振氫譜、碳譜、氟譜、DEPT譜和HRMS等確證結(jié)構(gòu)，純度經(jīng)HPLC檢測均在99.0%以上，可以作為匹伐他汀鈣原料藥及其制劑質(zhì)量控制的對照品。