月季無菌材料的獲得及不定芽的誘導

苗衛(wèi)東 高換超 李俊濤 王宇揚 李凱薇

摘要：月季花大而香，是名貴的觀賞植物，但采用常規(guī)的扦插和嫁接繁殖方法進行繁殖成活率不高。采用霍爾恩月季一年生枝條為外植體進行離體培養(yǎng)以擴大繁殖系數(shù)，試驗首先以WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑對月季萌芽率及生長情況的影響，然后用獲得的月季無菌苗葉片為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑及暗培養(yǎng)時間等多種因素對霍爾恩月季葉片不定芽誘導再生的影響。結(jié)果表明，月季腋芽萌發(fā)較適合的培養(yǎng)基為WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂粉;繼代培養(yǎng)較適合的培養(yǎng)基為WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂粉;TDZ對葉片不定芽再生有誘導作用。最適的培養(yǎng)基為MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂粉，暗培養(yǎng)時間為7 d，葉片的不定芽最高誘導率為9.70%。

關(guān)鍵詞：霍爾恩月季;無菌苗;葉片;植物生長調(diào)節(jié)劑;不定芽

中圖分類號：S685.120.4+3 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）18-0048-06

收稿日期：2021-05-16

作者簡介：苗衛(wèi)東（1968—），男，河南遂平人，副教授，主要從事園藝植物資源評價與利用研究。E-mail：ligrapes@hist.edu.cn。

月季被譽為“花中皇后”，是世界上最重要的觀賞植物之一，以其花朵美麗、四季常開、花色豐富和香色濃郁，一直被大眾所喜歡，并且它還有非常廣泛的應用價值，是城市綠化的主要材料。月季的自然花期為5月至11月，花大型，有香氣，廣泛用于園藝栽培和切花生產(chǎn)。中國是月季的原產(chǎn)地之一。中國有52個城市把它作為市花?；魻柖髟录臼秦S花月季的一個品種，長勢強健、分枝旺盛、株形優(yōu)美、主干及側(cè)分支不明顯，為灌叢生長，其葉片刺體與雜種茶香月季相比略小，植株偏矮，通常在 30～70 cm?；魻柖髟录净ǘ漕伾噬蠲导t色，重瓣，花朵直徑4 cm，香氣宜人，霍爾恩月季花期不斷，群體栽植觀賞性較高?，F(xiàn)代月季品種有35 000多個[1]，月季傳統(tǒng)的繁育方法如扦插、嫁接等具有一定的局限性，繁殖速度慢、種苗容易退化，對月季進行離體培養(yǎng)，可以在短時間內(nèi)獲得優(yōu)質(zhì)苗，而且可以周年進行生產(chǎn)。目前，對月季組培的研究主要集中在離體快繁方面[2]，關(guān)于植株再生體系的建立報道較少，建立高效的月季再生體系是開展月季基因工程育種的前提。有關(guān)建立月季再生體系有2條途徑，即器官發(fā)生途徑和體細胞胚途徑。本試驗采用離體快繁的方法獲得大量的月季無菌材料，用其無菌材料的葉片作為外植體，通過器官發(fā)生途徑建立了月季不定芽再生的體系，為月季的轉(zhuǎn)基因奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2020年2—6月開展，材料采自河南新鄉(xiāng)河南科技學院月季種質(zhì)資源圃，采摘的月季品種為霍爾恩。于10：00左右選擇生長健壯的植株取1年生長勢好、無病蟲害、芽體飽滿的月季中部枝條。誘導不定芽再生的材料是在河南科技學院園藝植物組培實驗室經(jīng)過繼代培養(yǎng)35 d的無菌苗，取其葉片。

1.2 方法

1.2.1 月季腋芽初代培養(yǎng) 取1年生長勢好、無病蟲害、芽體飽滿的月季中部枝條。從大田取回后，除去葉片與莖刺，然后在流水下沖洗10 min洗去灰塵，然后加入適量洗潔精沖洗2 h后剪成帶1個芽體的莖段。在超凈工作臺上用0.1%氯化汞消毒 8 min，然后使用無菌水沖洗4次，每次沖洗5 min并不斷搖晃徹底沖洗殘留的氯化汞，用無菌濾紙把接種材料上的水吸干，把處理好的材料接種于以WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的BA和NAA組合的9種初代培養(yǎng)基上，設(shè)置的培養(yǎng)基分別為：（1）C1：WPM+BA 0.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L;（2）C2：WPM+BA 0.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（3）C3：WPM+BA 0.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L;（4）C4：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L;（5）C5：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（6）C6：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L;（7）C7：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L;（8）C8：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（9）C9：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L。蔗糖20 g/L，瓊脂粉 6 g/L，pH值5.8[3-4]。每種培養(yǎng)基接種15瓶，每瓶接種3個外植體，重復3次，共45瓶，接種好外植體后放在培養(yǎng)室進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（24±2） ℃，光照度為2 000～3 000 lx。

1.2.2 月季腋芽繼代培養(yǎng) 培養(yǎng)14 d后，由于初代培養(yǎng)時材料帶莖段容易污染，所以把初代培養(yǎng)生長良好的腋芽剪下，進行轉(zhuǎn)接至以WPM為基本培養(yǎng)基、添加不同濃度BA和NAA組合的9種繼代培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基分別（1）J1：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（2）J2：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L;（3）J3：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.25 mg/L;（4）J4：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（5）J5：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L;（6）J6：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L;（7）J7：WPM+BA 2.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（8）J8：WPM+BA 2.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L;（9）J9：WPM+BA 2.0 mg/L+NAA 0.25 mg/L。蔗糖20 g/L，瓊脂粉6 g/L，pH值5.8。在培養(yǎng)過程中一旦發(fā)現(xiàn)污染要及時處理，在培養(yǎng)過程中要不斷觀察其生長情況。

1.2.3 月季無菌苗葉片愈傷組織的誘導 選擇生長勢良好，無污染的繼代培養(yǎng)35 d的無菌苗，將無菌苗葉片剪成適當大小，在葉脈中部橫切幾下進行刻傷，葉背向下分散接種到以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度2，4-D的5種愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基分別為（1）Y1：MS+2，4-D0.0 mg/L;（2）Y2：MS+2，4-D1.0 mg/L;（3）Y3：MS+2，4-D 2.0 mg/L;（4）Y4：MS+2，4-D 4.0 mg/L;（5）Y5：MS+2，4-D 8.0 mg/L。蔗糖為20 g/L，瓊脂粉為 6 g/L，pH值為5.8。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接3個外植體，重復3次，共30瓶，培養(yǎng)溫度為（24±2） ℃，光照度為2 000～3 000 lx，14 h光照。接種25 d后觀察愈傷組織的狀態(tài)變化，統(tǒng)計愈傷組織誘導率。愈傷組織誘導率=產(chǎn)生愈傷的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.4 月季無菌苗不定芽的誘導 將培養(yǎng)30 d生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至以MS為基本培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)劑TDZ與NAA不同濃度組合10種不定芽誘導培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基分別為：（1）B1：MS+NAA 0.1 mg/L;（2）B2：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;（3）B3：MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;（4）B4：MS+TDZ 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;（5）B5：MS+TDZ 8.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;（6）B6：MS+NAA 0.2 mg/L;（7）B7：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;（8）B8：MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;（9）B9：MS+TDZ 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;（10）B10：MS+TDZ 8.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;對照CK：MS0。蔗糖為20 g/L，瓊脂粉為6 g/L，pH值為5.8。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接20塊愈傷組織，每個組合分別暗培養(yǎng)0、7、14、21 d，重復3次，共30瓶。然后放置在培養(yǎng)溫度為（24±2） ℃，光照度為2 000～3 000 lx，14 h光照下培養(yǎng)，及時觀察不定芽誘導情況并在培養(yǎng)31 d后統(tǒng)計不定芽誘導率。不定芽誘導率=誘導出不定芽的愈傷數(shù)/接種的愈傷數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，試驗數(shù)據(jù)為3次重復的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對月季腋芽萌發(fā)率的影響

通過試驗觀察發(fā)現(xiàn)莖段培養(yǎng)3 d后，腋芽開始萌動膨大0.2～0.3 cm，培養(yǎng)7 d后芽體高達0.9～1.0 cm，初代培養(yǎng)14 d后芽體長度達1.6～1.7 cm，此時開始統(tǒng)計萌發(fā)個數(shù)，然后把生長良好的芽體切下轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上。

從表1可以看出，這9種組合都能使莖段腋芽萌發(fā)，培養(yǎng)基C4較適合腋芽萌發(fā)，萌發(fā)率為86.0%，長勢好（圖1-A）。C7培養(yǎng)基腋芽萌發(fā)率最低，萌發(fā)率為40.0%，長勢慢（圖1-B）。培養(yǎng)基C1、C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9與培養(yǎng)基C4差異顯著，培養(yǎng)基C1、C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9之間差異不顯著。

2.2 不同培養(yǎng)基對月季繼代培養(yǎng)的影響

通過試驗發(fā)現(xiàn)，腋芽莖段在初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后把其切下轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上7 d，生長良好，葉片開始展開（圖2-A）。在J5培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d后植株高度達2.5～2.7 cm（圖2-B），培養(yǎng) 35 d 后植株高度達4.2～4.7 cm （圖2-C）。

從表2可以看出，培養(yǎng)基J5較適合月季繼代生長，培養(yǎng)基J5與培養(yǎng)基J9之間差異不顯著，都適合其生長，但是J9培養(yǎng)基最初植株生長較快，但是在繼代培養(yǎng)了25 d后葉片開始變黃，植株質(zhì)量較差，所以只有培養(yǎng)基J5最適合月季繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)基J1最不適合月季的繼代培養(yǎng)。

2.3 不同培養(yǎng)基對月季無菌苗葉片愈傷組織誘導的影響

從表3可以看出，培養(yǎng)基中不加2，4-D時無法誘導出愈傷組織，最適合誘導愈傷組織的培養(yǎng)基為Y3，誘導率最高，為83.0%。培養(yǎng)基Y4，誘導率為75.0%， Y3與Y4之間差異不顯著， 說明這2種培養(yǎng)基都較適合月季愈傷組織的誘導。Y3、Y4與組合Y1、Y2、Y5之間差異顯著，其中Y3、Y4與Y2之間差異顯著性較小;與Y5之間差異顯著性較大;與Y1差異顯著性最大。

通過試驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度的2，4-D對愈傷組織發(fā)生的時間、愈傷組織生長質(zhì)量有很大影響。從圖3可以看出，當不加2，4-D時不能產(chǎn)生愈傷組織，材料培養(yǎng)40 d后全部變褐死亡（圖3-A）;當加1 mg/L 2，4-D，葉塊在培養(yǎng)25 d后在靠近切口卷曲處長出少許的淡綠色愈傷組織，在后期的觀察中愈傷組織膨大生長緩慢，愈傷組織質(zhì)地緊密（圖3-B）;當加入2 mg/L 2，4-D，在培養(yǎng)10 d后葉柄切口長出少許的綠色愈傷組織，葉塊開始卷曲上翹長出少量愈傷組織，15 d后愈傷組織繼續(xù)膨大，25 d后葉塊幾乎長出全部鮮綠色愈傷組織（圖3-C）;當加4 mg/L 2，4-D，在培養(yǎng)初期愈傷組織長得很快，但生長約25 d后長出的綠色愈傷組織開始變黃綠色（圖3-D）;當加入8 mg/L 2，4-D，在生長 15 d 時葉塊切口處開始膨大，但是有很多材料開始變褐，后期長出的少許愈傷組織不再繼續(xù)膨大，最后幾乎全部變褐死亡（圖3-E）。

2.4 暗培養(yǎng)天數(shù)和不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對月季不定芽誘導率的影響

從表4可以看出，霍爾恩月季誘導不定芽最適的培養(yǎng)基為B8（MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L），誘導率最高，B1與B6誘導率最低，說明TDZ在月季不定芽誘導中起決定性作用，不添加TDZ無法誘導出不定芽。B8和其他9個組合差異顯著，B8和B3差異顯著性較小，說明NAA濃度對不定芽誘導率影響不大;B8和B7差異顯著，說明TDZ濃度對不定芽誘導有很大影響;B8和其他7個組合差異顯著。在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，月季無菌苗葉片主要在主脈切口處產(chǎn)生愈傷組織，月季不定芽誘導率很低，最高誘導率僅為9.70%，由圖4可以看出，在B8培養(yǎng)基培養(yǎng)25 d后有芽將要長出，30 d后長出少許的不定芽。

3 討論與結(jié)論

3.1 TDZ對月季不定芽誘導的影響

TDZ是一種新型的細胞分裂素類似物，它不但具有很強的細胞分裂素活性，而且還具有生長素的功能，在基本培養(yǎng)基MS上只加TDZ就能誘導赤霞珠葉片離體再生[5]。TDZ對薔薇科植物誘導不定芽有促進效果[6]。相關(guān)報道表明，TDZ對體胚發(fā)生的作用因植物種類而異，它對體胚發(fā)生的促進作用與使用濃度和處理時間有關(guān)[7]。眾多研究指出，TDZ通過調(diào)節(jié)內(nèi)源植物生長激素起作用。TDZ的誘導能力雖然很強，但是它也有一定的缺陷[8]。有研究指出，高濃度的TDZ能誘導愈傷組織形成和體胚的誘導，但抑制芽的生長不利于伸長，再生芽數(shù)也減少。高麗萍等在建立月季再生體系的研究中，分別采用直接及間接的誘導途徑，建立了薩曼莎月季的再生體系[9]。生長素促進細胞伸長和細胞分裂，細胞分裂素誘導芽分化、促進側(cè)芽萌發(fā)生長，細胞分裂素配合一定的生長素可共同促進月季側(cè)芽的萌發(fā)與生長。本研究發(fā)現(xiàn)，TDZ對不定芽誘導有明顯影響，低濃度有利于不定芽的誘導?；魻柖髟录居鷤M織在誘導愈傷培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后轉(zhuǎn)到MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L分化培養(yǎng)基上，得到不定芽，證明TDZ對不定芽誘導有促進作用。

3.2 材料繼代時間對月季不定芽誘導的影響

通過試驗發(fā)現(xiàn)，繼代35 d左右的植株較適合誘導出愈傷組織，繼代時間超過50 d，幾乎無法誘導出愈傷組織，長出的少許愈傷組織變褐嚴重，無法誘導出不定芽。說明葉片的幼嫩程度對其有一定的影響。參考相關(guān)資料取繼代35d的植株小葉，愈傷組織誘導率較高[10]。同時有研究指出，隨著愈傷組織繼代次數(shù)的增加，愈傷組織分化的能力也不斷下降，當繼代次數(shù)超過5次，大部分的愈傷組織就幾乎沒有增殖的能力[11]。本試驗也發(fā)現(xiàn)愈傷組織不能進行多次繼代，即使此試驗繼代次數(shù)較少，其分化情況依然不理想。

3.3 暗培養(yǎng)時間對月季不定芽誘導的影響

在植物離體再生研究中，暗培養(yǎng)時間對再生效率有著非常重要的作用。暗培養(yǎng)時間過短不能誘導再生出不定芽，過長植物材料幾乎變褐死亡。通過試驗發(fā)現(xiàn)，不進行暗培養(yǎng)不能產(chǎn)生不定芽，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)當暗培養(yǎng)時間為7 d時鮮綠色的愈傷組織開始轉(zhuǎn)為淡綠色，質(zhì)地開始變得稍疏松;當暗培養(yǎng)時間為14 d時愈傷組織過于結(jié)實，開始變黃褐色，愈傷組織膨大緩慢，暗培養(yǎng)21 d長出的愈傷組織不再膨大，開始變黃變褐死亡。所以在不定芽誘導過程中采用7 d暗培養(yǎng)然后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同月季初代培養(yǎng)）。月季的再生培養(yǎng)中不同TDZ和NAA的濃度組合對不定芽誘導有一定影響。在誘導不定芽階段，暗培養(yǎng)時間起著決定性的作用。有研究表明，適當?shù)陌蹬囵B(yǎng)時間能促進月季植株再生[12-13]。本試驗也發(fā)現(xiàn)適當?shù)陌蹬囵B(yǎng)有助于不定芽的誘導，霍爾恩月季不定芽誘導暗培養(yǎng)的最佳時間是7 d，不定芽在產(chǎn)生愈傷組織的切口處產(chǎn)生，相關(guān)研究指出，暗培養(yǎng)15 d以上不定芽的再生率可達到95.0%以上，植株的再生率達到60.0%以上[14]，本試驗發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)時間達到14 d時愈傷組織幾乎全變褐，無法誘導出不定芽。

3.4 碳源濃度對月季不定芽誘導的影響

碳源的種類對植株再生有很大的影響，它除為細胞生命活動提供能源外，在培養(yǎng)基中還起著維持一定滲透壓的作用，果糖和乳糖抑制植株再生，蔗糖和葡萄糖能提高不定芽的誘導率使植株獲得較高的轉(zhuǎn)化效率[15]。通過試驗發(fā)現(xiàn)，低濃度的蔗糖更有利于月季無菌體系的建立與不定芽的再生。

3.5 NAA對月季不定芽誘導的影響

相關(guān)研究指出，不同濃度的細胞分裂素與生長素組合使用，植株再生效果有很大差異[16]。有研究表明TDZ與NAA組合使用時，薔薇植物的再生率較高。月季愈傷組織在NAA濃度為0.1 mg/L時分化出不定芽緩慢而且質(zhì)量差;NAA濃度為0.2 mg/L時，在愈傷組織中誘導出不定芽的時間短、質(zhì)量好，但是也發(fā)現(xiàn)在此濃度時愈傷組織有時無法誘導出不定芽而會誘導出多條根，說明生長素濃度高時有利于生長出根，但是卻無法在不定芽上誘導出根，所以對于建立霍爾恩月季不定芽再生體系還要進一步研究。

3.6 褐化現(xiàn)象對月季不定芽誘導的影響

相關(guān)研究認為，植株必須具有80%以上的再生頻率，每個植物材料都能誘導出叢生芽，只有這樣才具有能成功轉(zhuǎn)化的可能[17]。雖然本試驗做了很多對比研究，但是不定芽誘導率還是很低，原因主要是月季葉片在誘導愈傷組織的過程中容易褐化無法得到不定芽，得到的少數(shù)不定芽無法生根長成完整植株，相關(guān)研究指出，在植物組織培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象的發(fā)生也會影響根的生成[18]。所以，在今后的工作中應該考慮如何控制褐化現(xiàn)象的發(fā)生，提高植株不定芽誘導率并使其長成完整植株。

本試驗中選用月季無菌苗葉片為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，采用離體快繁技術(shù)研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑及暗培養(yǎng)時間等多種因素對霍爾恩月季葉片不定芽誘導再生的影響。研究得出最適的培養(yǎng)基為MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+20 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂粉，暗培養(yǎng)時間為7 d，葉片的不定芽最高誘導率為9.70%。

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