邊惠琴,武曉玉,2,3*,夏鵬飛,2,3,段文達(dá),楊飛霞,李嬌嬌,趙 磊,2,3*
1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省道地藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究與推廣工程實(shí)驗(yàn)室,蘭州730000
傳統(tǒng)中藥活性成分篩選以活性追蹤為主,其以單體組分為篩選對(duì)象,存在工作量大、操作繁瑣、效率低等缺點(diǎn)。而與傳統(tǒng)活性追蹤法相比,細(xì)胞膜色譜(cell membrane chromatography,CMC)是近年發(fā)展迅速的一種生物親和色譜技術(shù),具有特異性識(shí)別和高效分離的特性。CMC基本原理是將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠載體表面制成固定相,細(xì)胞膜受體可與藥物分子產(chǎn)生特異性結(jié)合,利用色譜分析法研究藥物分子與細(xì)胞膜受體的相互作用規(guī)律[1,2]。CMC集合了色譜技術(shù)、細(xì)胞分子生物學(xué)及受體藥理學(xué)的優(yōu)點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了色譜柱內(nèi)近似動(dòng)態(tài)地模擬藥物活性成分在體內(nèi)的作用過程;相比于常用吸附劑(如:離子交換樹脂、大孔吸附樹脂等),CMC具有色譜分離與活性篩選相結(jié)合的優(yōu)勢(shì),且操作方便、快速穩(wěn)定、靈敏度高,尤其適用于中藥等復(fù)雜體系的活性成分篩選。
細(xì)胞膜色譜制備時(shí),根據(jù)細(xì)胞膜與硅膠載體的不同結(jié)合形式,可將其分為:物理吸附和化學(xué)修飾。物理吸附細(xì)胞膜生物親和色譜是利用細(xì)胞膜自身的融合作用和硅膠表面硅羥基的吸附作用制備而成;這種作用力比較弱,細(xì)胞膜易從載體上脫落,導(dǎo)致色譜柱壽命短[3,4]?;瘜W(xué)修飾細(xì)胞膜生物親和色譜是硅膠和細(xì)胞膜以共價(jià)鍵結(jié)合;硅膠的硅醇基與硅烷偶聯(lián)劑發(fā)生縮合反應(yīng)引入氨基,氨基與戊二醛分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),硅膠表面即可得到一端游離的醛基官能團(tuán);細(xì)胞膜上含有大量氨基基團(tuán),在室溫環(huán)境中易發(fā)生醛氨縮合反應(yīng),從而達(dá)到硅膠和細(xì)胞膜共價(jià)連接的目的?;瘜W(xué)修飾細(xì)胞膜生物親和色譜中載體硅膠與細(xì)胞膜共價(jià)鍵連接、比較穩(wěn)定、細(xì)胞膜不易脫落,可延長色譜柱壽命[5,6]。
大黃是甘肅道地藥材,為臨床常用中藥之一;具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血脂等藥理作用[7-9]。許多學(xué)者及課題組前期研究均證實(shí)了大黃降血脂作用,且本課題組利用高脂血癥大鼠篩選出降血脂有效部位為30%乙醇提取液,但其具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確[10-12];課題組也制備了物理吸附L02肝細(xì)胞膜生物親和色譜材料,但其細(xì)胞膜脫落較嚴(yán)重,使用次數(shù)有限。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)制備APTES修飾硅膠為載體的L02肝細(xì)胞膜生物親和色譜材料,利用細(xì)胞膜表面的靶點(diǎn)對(duì)大黃30%乙醇提取液中化學(xué)成分進(jìn)行特異性吸附,HPLC分析吸附前后各化學(xué)成分色譜峰變化,以色譜峰峰面積變化率為依據(jù),快速篩選大黃降血脂活性成分;并考察該材料的重復(fù)使用性能,為高通量篩選大黃降血脂藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供新思路。
85-2型恒溫磁力攪拌器(海司樂儀器有限公司);BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);Waters Alliance型高效液相色譜儀(四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器);IMARK酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司);ALPHA-T紅外光譜儀(布魯克儀器有限公司);高速冷凍離心機(jī)(美國Beck-man-Coulter公司);JY92-ⅡDN細(xì)胞破碎儀(寧波新芝科技股份有限公司);DGX-9143BC-1型電熱恒溫干燥箱(上海?,斣囼?yàn)設(shè)備有限公司)。
硅膠(5 μm,批號(hào):20190316,中國青島美高化工有限公司);3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES,批號(hào):SLBB5978V)、油酸(批號(hào):SLBRI87V)均購自SIGMA公司;磷酸鹽緩沖溶液(批號(hào):AQ29629583)、鏈霉素/青霉素(批號(hào):20201116)、胰酶(批號(hào):20210629)、1640培養(yǎng)液(批號(hào):AG29643109)、胎牛血清(批號(hào):21040702)、1M Tris-HCl溶液(批號(hào):20190821)、BCA蛋白試劑盒(批號(hào):20191022)、Na+、K+-ATP酶試劑盒(批號(hào):20200629)均購于Solarbio公司;BSA蛋白粉(批號(hào):3131053,購于YESEN公司);戊二醛(批號(hào):EU2RDH1X,薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司);甲醇、乙腈均為色譜純(Merk公司);人L02肝細(xì)胞(普諾賽生命科技有限公司)。
0.5 mmoL/L油酸刺激L02肝細(xì)胞,建立脂肪變性模型;利用差速離心法提取細(xì)胞膜,具體步驟如下:1 mL PBS洗滌L02肝脂肪變性細(xì)胞,棄去PBS;加1 mL 0.25%胰酶消化,輕輕吹打混勻,在鏡下觀察細(xì)胞全部脫落;再加1 mL PBS終止消化,160 × g、4 ℃下離心10 min,保留細(xì)胞沉淀;用1 mL PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次。細(xì)胞沉淀在50 mM Tris-HCl溶液中溶脹30 min,在破碎功率720 W、破碎時(shí)間2 s,冷卻間隔2 s的冰浴條件下,破碎3 min;細(xì)胞碎片混懸液在1 000 × g、4 ℃下離心10 min,保留上清液;上清液進(jìn)一步在12 000 × g、4 ℃下離心20 min,即得細(xì)胞膜沉淀。
稱取硅膠2 g,在105 ℃活化2 h。
精密稱取活化硅膠1 g,加100 mL甲苯、1 mL APTES,N2保護(hù)、110 ℃條件下加熱回流12 h;反應(yīng)結(jié)束后,5 000 × g離心3 min,甲苯?jīng)_洗沉淀;沉淀加50 mL 5%戊二醛甲醇溶液,常溫下攪拌反應(yīng)2 h,反應(yīng)結(jié)束后,5 000 × g離心3 min,甲醇沖洗沉淀;50 ℃真空干燥,得APTES修飾硅膠。
取APTES修飾硅膠0.1 g置于圓底燒瓶中,加5 mL L02肝脂肪變性細(xì)胞膜混懸液,渦旋3 min, 10 Mbar、0 ℃條件下攪拌反應(yīng)1 h;然后放入4 ℃冰箱中反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后,1 000 × g、4 ℃條件下離心10 min,保留沉淀;PBS洗滌沉淀,1 000 × g,4 ℃條件下離心10 min,即得化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料。采用掃描電鏡和紅外光譜對(duì)其表征,并測(cè)定細(xì)胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力。
化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料加1 mL大黃30%乙醇提取液,輕輕吹打并渦旋震蕩1 min,37 ℃孵育8 h;孵育液在1 000 × g,4 ℃下離心10 min,上清液即共孵育殘液。
化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料加1 mL蒸餾水,輕輕吹打并渦旋震蕩1 min,1 000 × g,4 ℃下離心10 min,上清液即洗滌液。
化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料加1 mL PBS溶液,37 ℃孵育6 h,孵育液在1 000 × g,4 ℃下離心10 min,上清液即解離液。
HPLC分析條件:ODS柱(15 mm ( 4.6 mm,μm);流動(dòng)相:0.05%甲酸水(A),乙腈(B);梯度洗脫程序:0~10 min,5%→0% B;10~15 min,20% B;15~30 min,20%→30% B;30~50 min,30%→50% B;50~60 min,50%→85% B;60~65 min,100% B;柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長:254 nm;進(jìn)樣量:10 μL。
為了考察該材料的重復(fù)使用性能,對(duì)化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料進(jìn)行6次吸附、解吸附實(shí)驗(yàn),用細(xì)胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力來評(píng)價(jià)重復(fù)使用性能。具體過程如下:該材料加1 mL大黃30%乙醇提取液,渦旋混勻,37 ℃孵育8 h;孵育液1 000 × g,4 ℃下離心10 min,保留沉淀;沉淀加1 mL PBS溶液,37 ℃孵育6 h,孵育液在1 000 × g,4 ℃下離心10 min,保留沉淀;測(cè)定沉淀(解吸附后)的細(xì)胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力;重復(fù)測(cè)定6次。
硅膠、APTES修飾硅膠、化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料掃描電鏡圖見圖1。
圖1 掃描電鏡圖(×10 000)Fig.1 SEM images of silica gel (×10 000)注:a.硅膠;b.APTES修飾硅膠;c.化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料。Note:a.The silica gel;b.APTES modified silica gel;C.Chemical modification L02 liver membrane bioaffinity material.
圖1a中硅膠表面光滑,APTES修飾硅膠(圖1b)表面有一層絮狀物,較圖1a硅膠表面粗糙,推測(cè)為APTES烷氧基與硅膠硅羥基反應(yīng)所致。圖1c表面明顯覆蓋有一層細(xì)胞膜,說明APTES修飾硅膠上的游離醛基與細(xì)胞膜表面氨基發(fā)生醛氨縮合反應(yīng),細(xì)胞膜鍵合到硅膠表面,推斷化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料制備成功。硅膠、APTES修飾硅膠、化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料紅外光譜圖見圖2。
圖2 紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectrum 注:a.硅膠;b.APTES修飾硅膠;c.化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料。Note:a.The silica gel;b.APTES modified silica gel;C.chemical modification L02 liver membrane bioaffinity material.
圖2a中3 434 cm-1處為Si-OH特征吸收峰,1 114 cm-1是Si-O-Si的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰,802 cm-1和466 cm-1為Si-O-Si搖擺振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰。APTES修飾硅膠(圖2b)在2 942 cm-1處出現(xiàn)氨基硅烷的N-H伸縮振動(dòng)特征吸收峰,1 884 cm-1處出現(xiàn)N-H變形振動(dòng)吸收峰[14]。圖2c中3 442 cm-1吸收峰變寬,推測(cè)是Si-OH與細(xì)胞膜上-NH2蒂合所致,且802 cm-1和466 cm-1處Si-O-Si搖擺振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰也消失,說明硅膠與細(xì)胞膜上氨基發(fā)生反應(yīng),所以化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料成功制備。
將硅膠、APTES修飾硅膠、化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料分別混懸于1 mL生理鹽水中,利用細(xì)胞膜蛋白試劑盒及Na+、K+-ATP酶試劑盒測(cè)定細(xì)胞膜蛋白含量和Na+、K+-ATP酶活力,結(jié)果見表1。
表1 細(xì)胞膜蛋白含量和 Na+、K+-ATP酶活力結(jié)果表(n=3)Table 1 Results of membrane protein content and Na+,K+-ATP activity(n=3)
由表1可知,硅膠和APTES修飾硅膠細(xì)胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力均為0;化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料由于引入細(xì)胞膜,其細(xì)胞膜蛋白含量為0.385 2 mg/mL,Na+、K+-ATP酶活力為8.017 0 U/mgprot,表明化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料具有活性。
大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液、混合對(duì)照品溶液、洗滌液、解離液的HPLC圖見圖3。
由圖3a可知,大黃30%乙醇提取液中各化學(xué)成分色譜峰峰形對(duì)稱,分離度良好,說明優(yōu)化的色譜條件穩(wěn)定可行。圖3b可以看出化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料吸附后,部分化學(xué)成分色譜峰峰面積減小,說明該成分和材料發(fā)生了特異性吸附。通過與混合對(duì)照品溶液化學(xué)成分保留時(shí)間及紫外光譜學(xué)特征進(jìn)行對(duì)比,初步確定1、2、4、5、7、8、9、10、11號(hào)色譜峰分別為蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚;3、6號(hào)色譜峰為未知成分。圖3d洗滌液中沒有出現(xiàn)色譜峰,說明特異性吸附成分與化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料結(jié)合牢固。圖3e解離液中色譜峰極小,分析原因可能是特異性吸附成分和細(xì)胞膜上受體相結(jié)合,進(jìn)入到細(xì)胞膜內(nèi)部,進(jìn)而造成解離液中色譜峰較小。
將6份共孵育殘液進(jìn)樣分析,考察色譜峰峰面積的穩(wěn)定性,結(jié)果見表2。
由表2可知,共孵育殘液中11個(gè)色譜峰峰面積RSD值均小于1%,表明在優(yōu)化色譜條件下,化學(xué)成分峰面積大小穩(wěn)定。
通過測(cè)定大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液中各化學(xué)成分峰面積,按照公式1計(jì)算色譜峰峰面積變化率,以峰面積變化率大于15%為依據(jù),篩選特異性吸附成分,結(jié)果見表3。
圖3 HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms 注:a.大黃30%乙醇提取液;b.共孵育殘液;c.混合對(duì)照品溶液;d.洗滌液;e.解離液。 Note:a.30% ethanol extract of Rheum palmatum L.;b.Co-incubate residual liquid;c.Reference solution;d.Washing liquid;e.Desorption solution.
表2 共孵育殘液峰面積變化表(n=6)Table 2 Peak area change of co-incubate residual liquid (n=6)
續(xù)表2(Continued Tab.2)
表3 化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料吸附差異結(jié)果表 Table 3 Results of adsorption difference of chemically modified L02 liver membrane bioaffinity material
由表3可知,大黃30%乙醇提取液中有11個(gè)色譜峰峰面積變化率大于15%,說明化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料對(duì)11種化學(xué)成分發(fā)生特異性吸附,包括4個(gè)蒽醌糖苷、2個(gè)未知成分(3號(hào)和6號(hào)色譜峰)及5個(gè)蒽醌苷元。1~ 4號(hào)色譜峰變化率雖較7~11號(hào)小,但實(shí)際峰面積差值遠(yuǎn)比7~11號(hào)大;造成其變化率小的原因在于:峰面積變化率計(jì)算公式中,大黃30%乙醇溶液峰面積在分母位置,峰面積大進(jìn)而導(dǎo)致變化率小。結(jié)合峰面積變化率及峰面積差值,11種活性成分中1~4號(hào)色譜峰是主要的特異性成分,即蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷及未知成分1可作為潛在活性成分進(jìn)行降血脂活性驗(yàn)證。
為進(jìn)一步驗(yàn)證對(duì)解離液中特異性吸附成分進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)部的推測(cè),將化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料加1 mL PBS溶液,超聲10 min(超聲功率16 kHz),1 000 × g,4 ℃下離心10 min,收集上清液,HPLC色譜圖見圖4。
由圖4可看出,采用超聲法對(duì)化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料表面細(xì)胞膜進(jìn)行破碎后,PBS溶液中出現(xiàn)被特異性吸附的11個(gè)化學(xué)成分色譜峰,證實(shí)上述推斷合理性。
化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料進(jìn)行6次吸附實(shí)驗(yàn)后,細(xì)胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力結(jié)果見圖5。
圖4 化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料超聲破碎液HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of ultrasonic crushing solution of chemically modified L02 liver membrane bioaffinity material
圖5 化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料重復(fù)使用性能評(píng)價(jià)Fig.5 Effect of the regeneration cycles on the chemically modified L02 liver membrane bioaffinity material注:a.細(xì)胞膜蛋白含量;b.Na+、K+-ATP酶活力。Note:a.Cell membrane protein content;b.Na+,K+-ATP ezyme activity.
由圖5可知,化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料重復(fù)使用6次,細(xì)胞膜蛋白含量下降11.1%,Na+、K+-ATP酶活力下降12.1%,兩者均未發(fā)生顯著降低,說明該材料重復(fù)使用性能良好。
硅膠與APTES、戊二醛依次發(fā)生交聯(lián)、縮合反應(yīng),通過共價(jià)鍵將硅膠和細(xì)胞膜進(jìn)行連接,制備APTES修飾硅膠為載體的L02細(xì)胞膜生物親和材料,掃描電鏡和紅外光譜均證明制備成功。APTES修飾L02細(xì)胞膜生物親和材料對(duì)大黃30%乙醇提取液進(jìn)行吸附,結(jié)果顯示11個(gè)成分可被特異性結(jié)合;包括4個(gè)蒽醌糖苷、5個(gè)蒽醌苷元及2個(gè)未知成分,其中蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷及未知成分1是主要的特異性成分,可作為潛在活性成分進(jìn)行降血脂活性驗(yàn)證。但由于細(xì)胞膜表面靶點(diǎn)眾多,本材料僅適用于降血脂活性成分的初步篩選;且后期需要利用LC-MS/MS對(duì)2個(gè)未知成分進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)鑒定。相比于物理吸附L02細(xì)胞膜生物親和材料,該材料通過引入化學(xué)共價(jià)鍵,一定程度上避免了細(xì)胞膜的脫落,延長使用次數(shù),可用于大黃降血脂活性成分的快速篩選,該材料也可為其他降血脂活性成分的快速篩選提供參考。