大麻素受體1抑制劑促進線粒體生物發(fā)生改善膿毒癥小鼠腸麻痹的機制研究

楊亞男 劉 英 馮安琪 馬 磊 殷 敏

膿毒癥是臨床上手術(shù)、創(chuàng)傷、燒傷以及休克等疾病的常見并發(fā)癥，往往合并多器官衰竭導致患者死亡。腸道是嚴重膿毒癥受累最早和最嚴重的器官之一[1]。膿毒癥誘發(fā)腸道運動功能障礙及腸黏膜屏障損傷，使細菌和毒素侵入循環(huán)系統(tǒng)向全身轉(zhuǎn)移，形成第二次感染(腸源性感染)，是啟動多器官功能障礙綜合征的重要因素[2，3]。因此，改善膿毒癥合并腸麻痹是治療該類患者的重要手段。研究表明，膿毒癥時機體釋放大量內(nèi)源性大麻素，通過刺激大麻素受體1(cannabinoid receptor 1，CB1)抑制腸道動力而引起腸麻痹[4]。CB1受體抑制劑可促進腸道運動功能，但其作用機制尚不明確。本研究擬探索CB1受體抑制劑是否通過促進腸神經(jīng)元線粒體生物發(fā)生改善膿毒癥小鼠腸動力。

材料與方法

1.實驗材料：(1)動物：雄性C57小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為18～25g，由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，在空軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學部神經(jīng)生物研究所動物房統(tǒng)一喂養(yǎng)，每籠3～4只，將飼養(yǎng)環(huán)境的溫度調(diào)節(jié)至19～23℃，濕度調(diào)節(jié)在61%～71%，模擬正常白天黑夜。(2)試劑：LPS、AM251、伊文思藍、甲基纖維素試劑購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，Nrf-1抗體、TFAM抗體、COX-Ⅳ抗體和HRP山羊抗兔IgG購自深圳欣博盛生物科技有限公司，ACTIN抗體購自上海佰曄生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

2.LPS動物模型制備：依據(jù)既往文獻報道，選擇腹腔注射脂多糖(LPS)30 mg/kg建立小鼠膿毒癥模型[5]。造模后小鼠逐漸出現(xiàn)豎毛、閉眼、眼角出現(xiàn)分泌物、腹瀉、濃尿，表現(xiàn)出飲水、進食及活動次數(shù)明顯減少、嗜睡，解剖后腸道表現(xiàn)為膿性糜爛狀。

3.動物分組：C57小鼠隨機分為3組，每組20只。sham組，腹腔注射LPS等量0.9%NaCl注射液，30min后再注射AM251等量0.9%NaCl注射液。LPS組，腹腔注射LPS 30mg/kg，30min后注射AM251等量0.9%NaCl注射液。AM251組，腹腔注射LPS 30mg/kg，30min后腹腔注射AM251 3mg/kg。48h后按組別分別測定小鼠腸動力變化、檢測線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白的變化及結(jié)腸神經(jīng)元線粒體數(shù)量和體積的變化。

4.腸動力實驗：(1)腸運輸時間實驗：前一天晚上禁食、自由飲水，每只小鼠灌胃100μl伊文思藍甲基纖維素溶液，將小鼠分籠飼養(yǎng)，籠中鋪白布觀察藍色物質(zhì)排出時間。以第1次出現(xiàn)藍色糞便為終點，每只小鼠觀察8h。(2)結(jié)腸排珠時間實驗：前一天晚上禁食、自由飲水，小鼠用異氟醚麻醉，將直徑為2mm的玻璃通過肛門插入，用定制的覆蓋硅管的套管輕輕推入2cm。退出套管，等待小鼠蘇醒，觀察玻璃珠排出時間。(3)小腸推進率實驗：前一天晚上禁食自由飲水，每個小鼠灌胃100μl伊文思藍甲基纖維素溶液，20min后脫頸處死小鼠，輕輕剝離后取出整個消化道賁門至結(jié)腸末端，測量小腸全長及推進距離。計算小腸推進率(%)=推進距離/小腸全長×100%。

5.Western blot法檢測：取整個結(jié)腸組織用0.9%NaCl注射液沖洗組織，濾紙吸干凈水后稱重、標記并置于干凈的EP管中放至-80℃冰箱，以備提蛋白所用；使用RIPA裂解液經(jīng)研磨、超聲震蕩、冰上靜置、離心后取上清即為提取的結(jié)腸組織蛋白，使用BCA 試劑盒進行蛋白定量，然后制樣、煮樣；使用碧云天試劑盒，按照配方配置SDS-PAGE凝膠(12%凝膠)，每孔加入100μg蛋白，根據(jù)目的蛋白電泳位置停止電泳，電泳完轉(zhuǎn)膜，在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將帶有目的蛋白的PVDF膜浸入封閉液中封閉2h，后將PVDF膜放入一抗孵育袋中(Nrf-1:1∶500；TFAM:1∶2000；COX-Ⅳ:1∶3000；β-actin:1∶5000)，4℃搖床中孵育過夜。山羊抗兔二抗(1∶1000)，室溫在搖床上孵育2h，準備發(fā)光液，A∶B=1∶1，混勻，避光，將發(fā)光液均勻滴在PVDF膜上，盡量去除殘夜，將 PVDF 膜置于凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光成像，并分析條帶灰度值。

6.透射電鏡觀察線粒體數(shù)量和體積：取材方法如上，后浸泡于空軍軍醫(yī)大學電鏡室專用固定液固定，并由其做后續(xù)處理并拍攝電鏡圖片。

結(jié) 果

1.AM251能夠促進腸麻痹小鼠腸動力恢復:與sham組比較，C57小鼠腹腔注射LPS 30mg/kg 30min后48h，腸運輸時間延長(192s vs 325s，P=0.006)；小腸推進率降低(68% vs 47%，P<0.001)，結(jié)腸排珠時間延長(71s vs 375s，P<0.001)；與LPS組比較， AM251組可縮短腸運輸時間(325.0s vs 187.5s，P=0.006)，增加小腸推進率(47% vs 70%，P<0.001)，降低結(jié)腸排珠時間(375s vs 82s，P<0.001)，差異有統(tǒng)計學意義，詳見圖1。

圖1 AM251對腸麻痹小鼠腸動力的影響(n=5)與sham組比較， *P<0.01；與LPS組比較，#P<0.01

2.CB1受體抑制劑能夠促進腸麻痹小鼠線粒體的生物發(fā)生:與sham組比較，C57小鼠腹腔注射LPS 30mg/kg 30min后48h，線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白分子Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ蛋白表達明顯降低(Nrf-1：0.651 vs 0.414,P=0.028；TFAM：0.565 vs 0.332，P=0.009；COX-Ⅳ：0.846 vs 0.371，P=0.006), 與LPS組比較，給予AM251后可明顯增加線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白分子Nrf-1(0.414 vs 0.807，P=0.028)、TFAM(0.739 vs 0.332，P=0.0091)、COX-Ⅳ(0.371 vs 0.817，P=0.006)的表達，差異有統(tǒng)計學意義，詳見圖2。

圖2 AM251對腸麻痹小鼠線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白表達的影響(n=5)與sham組比較， *P<0.01；與LPS組比較，#P<0.01

3.CB1受體抑制劑能夠增加腸麻痹小鼠腸神經(jīng)元線粒體數(shù)量及質(zhì)量:通過透射電鏡觀察小鼠腸神經(jīng)元線粒體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)sham組線粒體的大小基本正常，基質(zhì)均勻，邊界及結(jié)構(gòu)清晰，線粒體的嵴致密飽滿； LPS組小鼠腸神經(jīng)元線粒體的數(shù)量明顯減少，大小不一無規(guī)律，形態(tài)不規(guī)整，邊界不清，線粒體大部分有明顯的腫脹和空泡樣變性，基質(zhì)不均勻，結(jié)構(gòu)模糊，腫脹的線粒體嵴有較明顯的斷裂。給予CB1受體抑制劑AM251后，形態(tài)學上可以看出，線粒體的損傷明顯被改善，詳見圖3A。利用透射電鏡觀察腸麻痹小鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢腸神經(jīng)元線粒體數(shù)量和體積，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與正常組比較，LPS組小鼠線粒體數(shù)量明顯降低，線粒體體積也有所降低，給予CB1受體抑制劑AM251后可明顯增加LPS小鼠線粒體的數(shù)量(P=0.015)和體積(P=0.004)，詳見圖3B、C。

圖3 腸神經(jīng)元及其線粒體形態(tài)及數(shù)目變化(n=5)

討 論

膿毒癥是細菌、真菌、病毒等感染因素誘發(fā)的傷害性炎性反應(yīng)，嚴重膿毒癥影響的首要器官之一就是腸道。大麻素是胃腸道運動的重要調(diào)節(jié)劑，近年來，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在腸道病理生理中的作用，尤其是對胃腸道炎癥及動力變化的調(diào)節(jié)作用越來越被重視。調(diào)節(jié)內(nèi)源性大麻素的生物合成和降解可用于短期治療腸易激綜合征和其他功能性腸病[6，7]。有研究表明，膿毒癥時腸道炎癥刺激會促進大量內(nèi)源性大麻素的釋放，給予CB1受體抑制劑會促進腸動力恢復[8，9]。因此，早期改善膿毒癥患者胃腸道功能是防止膿毒癥發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是提高此類患者治療及預后效果的重要途徑。

腸神經(jīng)系統(tǒng)是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)表達的主要部位，腸神經(jīng)系統(tǒng)單獨或與外源性神經(jīng)元(如交感神經(jīng)或非交感神經(jīng))共同作用，調(diào)整幾乎全部的腸道功能，包含營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與分泌、腸道運輸功能、血運以及免疫反應(yīng)等[10，11]。腸道神經(jīng)元在其中有著至關(guān)重要的作用，大量研究表明，腸道神經(jīng)元損傷、功能缺失將嚴重影響胃腸道動力功能，包括胃排空時間、小腸運輸時間及結(jié)腸運動功能[12]。在嚙齒動物中給予CB1受體抑制劑可增加胃腸道動力，而給予CB1受體激動劑可抑制胃腸道動力[13]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除CB1受體的小鼠胃腸動力明顯增強。CB1受體的抑制劑可分別用于治療由乙酸和LPS誘導的麻痹性腸梗阻，CB1受體抑制劑AM251，也能減輕長春新堿引起的麻痹性腸梗阻[14]。和本研究結(jié)論AM251能夠促進腸麻痹小鼠腸動力恢復的結(jié)論一致。

線粒體是真核生物細胞有氧呼吸、氧化代謝的關(guān)鍵部位，為細胞制造能量。維持線粒體活力是細胞應(yīng)對外界生物反應(yīng)的基礎(chǔ)，對神經(jīng)元完成其正常功能至關(guān)重要。線粒體作為高度動態(tài)變化的細胞器，通過調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)、數(shù)量及功能結(jié)構(gòu)與功能的完整對于維持腸神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理學功能至關(guān)重要[15]。研究發(fā)現(xiàn)，腸神經(jīng)系統(tǒng)對線粒體功能障礙特別敏感，小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)的線粒體代謝障礙會導致顯著的胃腸功能障礙和運動障礙，破壞Tfam-ENSKO小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)的線粒體代謝導致顯著的胃腸功能障礙和運動障礙[16]。

透射電鏡對線粒體的形態(tài)及數(shù)目進行觀察和計數(shù)發(fā)現(xiàn)，正常小鼠腸神經(jīng)元線粒體的大小基本正常，基質(zhì)均勻，邊界及結(jié)構(gòu)清晰，線粒體的嵴致密飽滿，未見明顯的線粒體腫脹及空泡樣改變，而膿毒癥腸麻痹小鼠腸神經(jīng)元線粒體的數(shù)量明顯減少，大小不一，形態(tài)不規(guī)整，邊界不清，排列不規(guī)則，線粒體大部分有明顯的腫脹和空泡樣變性，基質(zhì)不均勻，結(jié)構(gòu)模糊，腫脹的線粒體嵴有較明顯的斷裂，給予CB1受體抑制劑AM251后，形態(tài)學上可以看出，線粒體的損傷明顯被改善。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，腸麻痹小鼠線粒體數(shù)量及體積均明顯降低，而給予CB1受體抑制劑AM251后可增加線粒體的數(shù)量及體積。

本研究認為，膿毒癥小鼠腸麻痹可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)線粒體損傷有關(guān)。線粒體在生理過程中不斷進行著生物發(fā)生、自噬、分裂和融合等變化，線粒體的動態(tài)變化在腸道的多種損傷與修復階段起到重要作用，線粒體在多種傷害性因素的刺激下，為維持原來的能量供應(yīng)，會增加線粒體數(shù)量和質(zhì)量，將需氧調(diào)定點增加到原來的水平，也就是線粒體生物發(fā)生。Nrf-1有誘導線粒體基因轉(zhuǎn)錄的作用，與編碼呼吸亞基的基因啟動子、線粒體轉(zhuǎn)錄因子TFAM和TFBs結(jié)合，共同調(diào)節(jié)線粒體轉(zhuǎn)錄，是線粒體電子傳遞鏈功能正常發(fā)揮的關(guān)鍵因子所在[17]。TFAM是線粒體基因開始轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)控因子，決定著線粒體基因是否開始轉(zhuǎn)錄，對線粒體生物發(fā)生和胚胎發(fā)育至關(guān)重要，并對線粒體 DNA 復制的數(shù)量、組裝等過程起著調(diào)節(jié)作用[18]。也就是說，上調(diào) Nrf-1和TFAM是線粒體的生物發(fā)生的標志。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥腸麻痹小鼠生物發(fā)生相關(guān)蛋白Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ的表達明顯降低，給于CB1受體抑制劑可增加Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ的表達。因此，筆者認為保持腸神經(jīng)元線粒體的結(jié)構(gòu)完整和功能完善，促進其生物發(fā)生，是外源性CB1受體抑制劑保護腸麻痹小鼠腸道運動功能的重要機制，也是改善膿毒癥預后的有效途徑。