甜瓜“芝麻酥”的葉片愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)研究

侯嬌嬌，張江波，張?jiān)铝?/p>

(1.焦作市中站區(qū)龍翔街道辦事處，河南 焦作 454000；2.濟(jì)源市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 濟(jì)源 459000)

甜 瓜(Cucumis melo L．)是 葫 蘆 科(Cucurbitaceae)甜瓜屬植物中的一種重要的瓜類作物，在我國(guó)瓜類作物栽培中占有較大種植面積。近10年來(lái)，隨著植物基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的基因?qū)胩鸸峡梢杂行Э旖莸靥岣咛鸸系目鼓嫘圆⒏牧计淦焚|(zhì)。在甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化的方法中，除花粉管通道法之外，其他方法均建立在組織和細(xì)胞再生完整植株的基礎(chǔ)上。在組織培養(yǎng)方面，目前已能夠通過(guò)子葉、真葉等外植體再生完整植株。1989年Dirks等以子葉和真葉為外植體，成功得到了5個(gè)甜瓜雜交種的再生體系[1]；同年，Niedz等以甜瓜幼齡子葉為外植體獲得了4個(gè)厚皮甜瓜基因型的再生體系[2]；之后，Homma Y.等、Kathal R.等的研究涉及了更多的甜瓜基因型[3-4]。在國(guó)內(nèi)，多以甜瓜子葉作為外植體進(jìn)行再生體系的建立。王建設(shè)等建立了伊麗莎白主栽品種的再生體系[5]；肖守華等、師桂英等建立了黃河蜜甜瓜等幾個(gè)厚皮甜瓜品種的高效再生體系[6-7]。在真葉方面，2009年王福蘭以甜瓜薄皮品種“甘甜一號(hào)”為材料，成功得到了甜瓜真葉再生體系[8]。但未見(jiàn)對(duì)芝麻酥甜瓜品種再生研究的報(bào)道。由于不同部位的外植體再生潛力不同[9]，不同培養(yǎng)條件下外植體的再生潛力、頻率存在很大差異[10]，不同甜瓜品種的組培再生潛力因基因型不同而表現(xiàn)出明顯差異，而且不同培養(yǎng)基種類，尤其是添加的植物激素種類及其配比對(duì)甜瓜組培再生潛力的影響也不同[11]。

甜瓜果實(shí)香甜，營(yíng)養(yǎng)豐富。隨著生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越注重其品質(zhì)和產(chǎn)量。運(yùn)用生物技術(shù)手段進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，培育出高產(chǎn)且優(yōu)質(zhì)的甜瓜新品種成為甜瓜遺傳育種研究的新熱點(diǎn)。甜瓜高效再生體系的建立，對(duì)于進(jìn)一步進(jìn)行甜瓜轉(zhuǎn)基因等方面的研究十分必要，目前，已能夠利用胚軸、胚根和子葉等外植體通過(guò)器官發(fā)生途徑或體細(xì)胞胚途徑再生完整植株。但國(guó)內(nèi)關(guān)于葉片再生的報(bào)道較少，研究者多以甜瓜子葉作為外植體。因?yàn)槔萌~片作為外植體，材料來(lái)源容易，可通過(guò)不斷繼代培養(yǎng)組培苗得到，尤其對(duì)于珍貴稀少的品種其意義更大。本文研究了不同激素組合、不同取材方式、不同光照條件等影響甜瓜葉片不定芽分化的因素，為應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良甜瓜性狀奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

甜瓜品種“芝麻酥”的成熟種子。MS培養(yǎng)基、6-BA、IAA。人工氣候箱（MGC-250BP-2），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F），高壓滅菌鍋，微波爐，電子天平（BL210S北京賽多利斯天平有限公司），冰箱，烘箱，量筒，手術(shù)刀，鑷子，封口膜，燒杯，移液管，酒精燈等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制。MS培養(yǎng)基的配制。以配制400 mL MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配制方式如下：依次量取40 mL母液Ⅰ，4 mL母液Ⅱ，4 mL母液Ⅲ，4 mL母液Ⅳ于燒杯中，加入少量蒸餾水混勻，然后再加入稱好的12 g蔗糖和3.2 g瓊脂粉，攪拌混勻最后加蒸餾水定容至400 mL。用1 mol/L NaOH將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.8左右，放入微波爐中加熱融化瓊脂。最后分裝到三角瓶中，每瓶大約50 mL。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制。在MS培養(yǎng)基上設(shè)置20種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合(表1)，分別對(duì)外植體進(jìn)行分化培養(yǎng)。

表1 20種誘導(dǎo)不定芽分化培養(yǎng)基

1.2.2 種子的接種。將甜瓜種子剝?nèi)ず螅?.1%的升汞表面滅菌5 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，然后取出種子接種于MS固體培養(yǎng)基上。

1.2.3 預(yù)培養(yǎng)及不定芽誘導(dǎo)。（1）預(yù)培養(yǎng)：將接種好的種子放入條件為溫度（25±1）℃光周期為16 h光照/8 h黑暗（正常光周期）的光照培養(yǎng)箱中，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)10 d，以期獲得下一步試驗(yàn)所需的材料，即葉片。（2）不定芽的誘導(dǎo):在無(wú)菌條件下，取預(yù)培養(yǎng)獲得的，新梢頂端未完全展開(kāi)的葉片（不帶葉柄），切成大約0.4 cm×0.4 cm甜瓜葉外植體小塊，接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。然后轉(zhuǎn)入溫度（25±1）℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗（正常光周期）的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織及不定芽的發(fā)生情況。

在葉片（不帶葉柄）最佳激素條件下，取10 d苗齡新梢頂端未完全展開(kāi)的葉片，不帶葉柄、帶葉柄（0.5 mm）兩種取材方式，直接轉(zhuǎn)入溫度（25±1）℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗（正常光周期）的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織及不定芽的發(fā)生情況。

在最適取材方式和最佳激素條件下選取試管苗幼嫩未完全展開(kāi)葉片，接種于分化培養(yǎng)基上，設(shè)計(jì)前期暗培養(yǎng)時(shí)間為5 d，然后移至正常條件下培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)葉片不定芽的發(fā)生情況。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法及數(shù)據(jù)分析方法。接種30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的發(fā)生情況。統(tǒng)計(jì)方法為:外植體不定芽分化率(簡(jiǎn)稱“分化率”)=再生不定芽葉塊數(shù)/接種葉塊數(shù)×100%；外植體平均出芽數(shù)=再生不定芽總數(shù)/再生不定芽的葉塊數(shù)；愈傷組織誘導(dǎo)率（愈傷誘導(dǎo)率）=愈傷塊數(shù)/接種葉塊數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜葉片不定芽誘導(dǎo)最佳激素組合的摸索

預(yù)培養(yǎng)10 d甜瓜葉外植體（不帶葉柄）在不同濃度6-BA與IAA配比的MS培養(yǎng)基上大部分均能誘導(dǎo)出愈傷組織或不定芽叢（表2）。外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上接種后不斷擴(kuò)大，8 d左右，在外植體切口處長(zhǎng)出細(xì)小、嫩綠的愈傷組織，17 d左右，在愈傷組織處長(zhǎng)出芽叢。

表2 6-BA與IAA對(duì)甜瓜葉片外植體發(fā)生不定芽和愈傷組織的影響（單位：%）

由圖1可以看出，在6-BA 0.2 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L分別與IAA 0、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L配比時(shí)，隨著IAA濃度的增加，不定芽發(fā)生頻率都呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢(shì)；其中6-BA 1.0 mg/L與IAA 0 mg/L配比時(shí)不定芽發(fā)生頻率最高，達(dá)到50%，平均每個(gè)外植體上可誘導(dǎo)出1.6個(gè)健壯小芽，顯著高于其他組合。

在不同濃度組合的6-BA與IAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，葉片分化率和平均出芽數(shù)差異很大。在MS+6-BA 1.0 mg/L(含瓊脂0.8%、蔗糖3%)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上不僅分化率較高，而且玻璃化程度低，再生芽生長(zhǎng)健壯，再生芽數(shù)多（圖2）。隨著IAA濃度的增加，外植體的分化率下降，且玻璃化現(xiàn)象也有加重的趨勢(shì)。這是因?yàn)闈舛冗^(guò)高的IAA含量促進(jìn)了愈傷組織的形成，從而影響了不定芽的分化。6-BA對(duì)甜瓜的不定芽分化起著關(guān)鍵性作用，濃度過(guò)低產(chǎn)生芽叢較少，甚至沒(méi)有芽叢產(chǎn)生，但是濃度過(guò)高，就會(huì)引起玻璃化苗的產(chǎn)生，芽叢減少（圖3）。有研究表明，子葉塊再生存在明顯的極性，多在近軸端產(chǎn)生芽叢。葉片的再生，極性不像子葉塊那樣明顯，所劃傷口處能夠較均勻產(chǎn)生芽叢。

2.2 不同外植體不定芽的誘導(dǎo)比較

在葉片外植體（不帶葉柄）最佳激素濃度條件下，帶葉柄的葉片切塊不定芽誘導(dǎo)率較高，誘導(dǎo)率達(dá)65%，平均出芽數(shù)2.77個(gè)（表3），最早一批不定芽主要以直接出芽方式發(fā)生，沒(méi)有明顯的愈傷化過(guò)程。繼續(xù)培養(yǎng)后，從外植體切口和與培養(yǎng)基貼近的一面長(zhǎng)出愈傷組織，但愈傷組織多呈疏松霜花狀，白色或淡綠色，少數(shù)疏松愈傷組織中長(zhǎng)出綠色小瘤狀物，小瘤狀物以后可分化出不定芽（圖4）。而葉片一般8 d左右，在近軸端長(zhǎng)出鮮綠的愈傷組織。17 d左右在外植體愈傷組織處開(kāi)始長(zhǎng)芽叢。

表3 不同外植體不定芽的誘導(dǎo)比較

2.3 不同光照條件對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

光照對(duì)帶葉柄外植體的分化率、平均出芽數(shù)和出現(xiàn)不定芽所用時(shí)間有很大影響。直接轉(zhuǎn)入正常光周期(光/暗培養(yǎng)時(shí)間為16 h/8 h)下培養(yǎng)的外植體，其不定芽的分化率最高為65%(再生培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L)，而且出現(xiàn)不定芽所用時(shí)間較短，外植體在接種后3～4 d就有所反應(yīng)。暗培養(yǎng)，不定芽的再生率明顯下降。這可能由于黑暗條件下，外植體內(nèi)積累的生長(zhǎng)素多，促進(jìn)了愈傷組織的形成和生長(zhǎng)。而激素平衡的改變和愈傷組織對(duì)養(yǎng)分的競(jìng)爭(zhēng)不利于不定芽的分化，結(jié)果導(dǎo)致暗培養(yǎng)條件下外植體上的不定芽數(shù)明顯少于正常光周期下培養(yǎng)的外植體上的不定芽數(shù)。而且暗培養(yǎng)后，外植體上的不定芽數(shù)明顯少于正常光周期下培養(yǎng)的外植體上的不定芽數(shù)，葉片有不同程度的發(fā)黃，生長(zhǎng)不健壯，所以出現(xiàn)不定芽所用的時(shí)間較長(zhǎng)。因此，直接轉(zhuǎn)入正常光周期下培養(yǎng)，對(duì)甜瓜離體外植體再生不定芽較為適宜。

3 討論

3.1 植物激素的濃度

表4 不同光照條件對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

植物的組織培養(yǎng)中確立最佳誘導(dǎo)條件是十分必要的，尤其是植物激素的濃度。本研究發(fā)現(xiàn)芝麻酥甜瓜品種的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L，不需要IAA，這與陶興林等[12]的試驗(yàn)結(jié)果基本相符。他們的研究也表明，在甜瓜不定芽誘導(dǎo)中，生長(zhǎng)素是非必要的。這可能是由于甜瓜本身的內(nèi)源生長(zhǎng)素的含量比較高，如果再人為添加就會(huì)引起愈傷組織的發(fā)生，不利于不定芽的誘導(dǎo)。

細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例是組織培養(yǎng)中激素使用的關(guān)鍵，應(yīng)該根據(jù)培養(yǎng)的目的進(jìn)行調(diào)節(jié)。原則上是生長(zhǎng)素濃度明顯高于細(xì)胞分裂素，則促進(jìn)細(xì)胞脫分化，誘導(dǎo)愈傷組織，反之則促進(jìn)細(xì)胞分化，但是我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的種類對(duì)不同植物的敏感性差異很大，因此激素種類的選擇應(yīng)以植物種類不同而異。還發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)不定芽的增殖生長(zhǎng)中，為了使不定芽的分化保持較高的頻率，加入較高濃度范圍的6-BA對(duì)芽的分化有促進(jìn)作用，但若6-BA濃度太高則明顯抑制芽的分化，且再生芽多畸形玻璃化加重，難以發(fā)育成正常植株。此外，當(dāng)6-BA濃度較高時(shí)，由于其后效應(yīng)，常會(huì)抑制根的誘導(dǎo)，因此芽增殖后期逐漸降低細(xì)胞分裂素濃度對(duì)根的誘導(dǎo)是有利的。但降低幅度也不能太大，否則會(huì)抑制芽叢的生長(zhǎng)，并且外植體有黃化現(xiàn)象。我們還發(fā)現(xiàn)同一處理中，在有的外植體表面上，僅僅維持在原來(lái)的狀態(tài)，對(duì)誘導(dǎo)幾乎沒(méi)有反應(yīng)；有的外植體已經(jīng)形成很密的不定芽叢；而有的外植體只出現(xiàn)疏松愈傷組織，呈霜狀或顆粒狀，顏色為白色或褐色；有的外植體則同時(shí)誘導(dǎo)出愈傷組織和不定芽。這說(shuō)明外植體對(duì)不定芽誘導(dǎo)有很大的影響，分析認(rèn)為，同一處理中外植體表現(xiàn)的差異主要是由于不同外植體的自身狀況導(dǎo)致的，包括外植體中的內(nèi)源激素水平、營(yíng)養(yǎng)水平等的差異而造成，所以在試驗(yàn)中，為了保持試驗(yàn)的準(zhǔn)確性應(yīng)該對(duì)外植體進(jìn)行必要的選擇，盡量保持一致。

在試驗(yàn)中，葉柄處誘導(dǎo)率較高，可能是由于葉外植體吸收培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素主要是通過(guò)葉脈中的維管束進(jìn)行的，而葉柄有較大維管束，有利于激素向葉片的運(yùn)輸，從而導(dǎo)致葉片激素濃度過(guò)高，利于愈傷組織的形成，而不利于形成不定芽，但是葉柄與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)基中的激素濃度有利于葉柄不定芽的形成。暗處理對(duì)許多植物的再生有促進(jìn)作用，暗處理可減少外植體酚類物質(zhì)的溢出，利于不定芽的分化。但是，同時(shí)黑暗條件下，有些植物外植體內(nèi)積累的生長(zhǎng)素多，促進(jìn)了愈傷組織的形成和生長(zhǎng)。而激素水平的改變和愈傷組織對(duì)養(yǎng)分的競(jìng)爭(zhēng)不利于不定芽的分化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，直接轉(zhuǎn)入正常光周期下培養(yǎng)有利于外植體的再生。由于暗培養(yǎng)的作用比較復(fù)雜，暗處理對(duì)外植體再生芽誘導(dǎo)的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3.2 甜瓜不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中的玻璃化與褐化

在組培過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)的兩個(gè)問(wèn)題，一個(gè)是玻璃化，一個(gè)是褐化。玻璃化是組培中常見(jiàn)的現(xiàn)象，現(xiàn)在大多數(shù)學(xué)者的試驗(yàn)結(jié)果表明，玻璃化的形成與培養(yǎng)器皿內(nèi)的水分、營(yíng)養(yǎng)、激素有關(guān)。我們的試驗(yàn)中，上述所提到的玻璃化成因中只有激素水平的差異，所以出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象可能是由于激素原因造成，試驗(yàn)得出的結(jié)果與上述一致。激素配比不同，細(xì)胞分裂素水平高的組合出現(xiàn)了不同程度的玻璃化。這也就再一次證明了激素是造成玻璃化的主要原因之一。

褐化的原因主要是植物組織經(jīng)創(chuàng)傷后產(chǎn)生大量的酚類化合物，氧化后褐化造成。試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的6-BA不但利于不定芽的誘導(dǎo)，而且畸形芽少，還可以減緩褐化程度；隨著6-BA濃度的升高，褐化組織數(shù)目增加，褐化程度越重。可能是細(xì)胞分裂素刺激了多酚氧化酶的活性所致。所以，在甜瓜的組織培養(yǎng)過(guò)程中，在篩選了高效誘導(dǎo)再生的激素后，發(fā)現(xiàn)玻璃化、褐化現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)及時(shí)降低激素濃度、換用較弱的激素，既可減少褐化程度又可以減少玻璃化程度。

4 結(jié)論

在設(shè)定的20個(gè)激素組合誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，以預(yù)培養(yǎng)10 d的甜瓜品種“芝麻酥”幼葉（不帶葉柄）為外植體，培養(yǎng)在MS+6-BA 1.0 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為溫度25℃，光照16 h/8 h光/暗周期，能夠獲得最佳不定芽誘導(dǎo)率，為50%。

在相同的激素組合、培養(yǎng)條件下，外植體取材方式對(duì)不定芽誘導(dǎo)率有一定影響，帶0.5 mm葉柄的葉外植體不定芽誘導(dǎo)頻率要高于不帶葉柄的葉外植體（65%vs 50%）。

光照有利于甜瓜不定芽的誘導(dǎo)，前期黑暗培養(yǎng)則抑制不定芽的發(fā)生。

6-BA與IAA配合使用有利于甜瓜葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，本研究中在MS+6-BA1.0 mg/L+IAA0.1 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可達(dá)95%。