蒙古蕕（Caryopteris mongholica Bunge）次生代謝物質(zhì)的驅(qū)蟲效果研究

單金園，董 馨，張 寶，李國(guó)婧，斯 琴，李龍梅,2*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物逆境生理與分子生物學(xué)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 薩拉齊 014109)

蒙古蕕(Caryopteris mongholica Bunge)是馬鞭科(Verbenaceae)蕕屬(Caryopteris)的一種旱生落葉小灌木，具有藥用和觀賞價(jià)值[1]，在我國(guó)內(nèi)蒙古牧區(qū)也是飼用價(jià)值較高的含氮牧草，其植株散發(fā)的特殊香氣，可作芳香油等其他經(jīng)濟(jì)價(jià)值使用[2]。目前人們對(duì)蒙古蕕進(jìn)行了傳粉育苗繁殖[3]，生態(tài)脅迫抗性[4]，植株的形態(tài)結(jié)構(gòu)[5]，及其揮發(fā)性花香進(jìn)行了成分分析等方面的研究[6]。

植物次生代謝是指植物經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化同生態(tài)環(huán)境相適應(yīng)而產(chǎn)生非必需代謝物質(zhì)的過程，其產(chǎn)物有生物堿、多糖類、黃酮類、蒽醌、萘醌、單萜、二萜、皂苷、蛋白質(zhì)等[2]。次生代謝產(chǎn)物本質(zhì)是一類植物內(nèi)源活性物質(zhì)，這類活性物質(zhì)對(duì)植物自身的生理作用不明顯，但對(duì)其他生物體具有生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤等[7]。有些植物次生代謝物對(duì)害蟲還有忌避和毒殺作用，如貓薄荷里的荊芥內(nèi)酯成分驅(qū)蚊的效果明顯[8]；提取含有特殊氣味的化合物制作成芳香精油，如丁香油、薄荷油、薰衣草油、樟腦油等可被用以驅(qū)蚊蟲的天然植物精油；植物中的萜類、酚類和生物堿類化合物則對(duì)昆蟲具有拒食活性[9]。還有一些成本高、產(chǎn)量低、需求量大的化合物被應(yīng)用在制藥工業(yè)中，例如紫杉醇、長(zhǎng)春堿、青蒿素等。因此，本研究將對(duì)蒙古蕕的次生代謝物進(jìn)行初步殺蟲（驅(qū)蟲）活性檢測(cè)，為尋找綠色環(huán)保殺蟲劑的前期篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

植物樣品：蒙古蕕采集于烏蘭察布市涼城縣，百里香采集于赤峰市林西縣，艾草采集于呼和浩特市五萬(wàn)畝森林公園。

供試害蟲：本試驗(yàn)使用的蛞蝓、菜蚜于內(nèi)蒙古呼和浩特市新城區(qū)溫室大棚收集，主要寄主為白菜、油麥菜。

1.2 樣品采集及處理方法

采集生長(zhǎng)狀態(tài)良好且無(wú)病蟲害的植株的莖、葉部分，自然陰干。用粉碎機(jī)將蒙古蕕和百里香粉碎并過40目篩，艾草粉碎，儲(chǔ)存于常溫干燥條件下備用。

冷浸-超聲提取法：稱取植物干粉10 g，加入100 mL 95%乙醇溶液，冷浸泡36 h后，超聲提?。?0 min,30℃），過濾；將殘?jiān)俅渭尤?00 mL 95%乙醇溶液，超聲提?。?0 min,30℃），過濾，合并兩次濾液，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成膏狀，將膏狀提取物用50%乙醇定容至10 mL，則植物提取物的質(zhì)量濃度為1 g/mL（即1 mL溶液中含有1 g植物干粉樣品），將溶液置于4℃低溫環(huán)境中避光保存。

使用前，需將3種供試植物提取液分別用體積分?jǐn)?shù)為0.3%的吐溫-80水溶液稀釋成0.05 g/mL的藥液，對(duì)照溶液為用0.3%吐溫-80稀釋的50%乙醇溶液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛞蝓的趨避試驗(yàn)設(shè)計(jì)

處理葉：將4×7（cm）的新鮮油麥菜葉片浸泡于0.05 g/mL的提取物溶液中3 min，取出后自然風(fēng)干。

對(duì)照葉：將4×7（cm）的新鮮油麥菜葉片浸泡于50%乙醇-0.3%吐溫-80的稀釋液中3 min，取出后自然風(fēng)干。

將處理葉和對(duì)照葉一同放入燒杯中（將干凈培養(yǎng)皿倒扣放入燒杯底部，加入20 mL蒸餾水，防止蛞蝓因環(huán)境干燥而死亡），然后將蟲齡相近的饑餓處理6 h的蛞蝓用鑷子夾入燒杯中。每組8只試蟲，重復(fù)15次。于處理12 h后觀察蛞蝓的取食結(jié)果，記錄試驗(yàn)前后葉片的重量差。

1.4 菜蚜的毒殺活性測(cè)定試驗(yàn)設(shè)計(jì)

浸蟲法：用細(xì)毛筆蘸取30只狀態(tài)正常的菜蚜若蟲，置于4 cm×3 cm的新鮮葉片上，將葉片放置在培養(yǎng)皿中，飼養(yǎng)1 h，使蟲體基本固定于葉片上。將帶蟲葉片分別在3種供試藥劑中完全浸泡，5 s后取出，用濾紙吸取葉片上多余的藥液，晾干后重新置于培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)（飼養(yǎng)溫度為25℃）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，于12、24 h后觀察試蟲的死亡情況并記錄。對(duì)照組試蟲用50%乙醇-0.3%吐溫-80的稀釋液浸泡。

1.5 成分分析方法

1.5.1 液相色譜-質(zhì)譜分析。前處理參考：取600 mg植物樣本，加入5倍體積的甲醇溶液后，研磨組織45 s（4℃）并重復(fù)3次，超聲提取30 min（60 Hz、室溫），離心10 min（4℃、13 500 r/min），取上清液，過0.45μm濾膜后，取濾液進(jìn)樣分析。

1.5.2 HS-SPME-GC-MS分析。將植物樣品用液氮速凍后研磨粉碎，每2 g樣品加1 g NaCl和內(nèi)標(biāo)物。40℃下萃取30 min，平衡20 min。萃取后將樣液注入GC端口，解析4 min（250℃），無(wú)分流進(jìn)樣。

色譜：0.25μm涂層的DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm）；氦氣（99.999%）作載氣，進(jìn)樣溫度250℃。不分流進(jìn)樣3 min，流量為1.0 mL/min。

升溫：①起始溫度為50℃，2 min；②以4℃/min慢升溫至72℃；③以14℃/min升溫至100℃；④以2℃/min慢升溫至130℃；⑤以4℃/min慢升溫至145℃；⑥以8℃慢升溫至180℃，持續(xù)10 min。

質(zhì)譜：230℃，70 eV EI源電離；質(zhì)量范圍20～600 amu。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)蛞蝓取食前后的葉片重量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過分析蛞蝓的取食情況判斷植物的次生代謝物質(zhì)對(duì)蛞蝓的趨避作用是否顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 趨避試驗(yàn)結(jié)果分析

通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，分析結(jié)果認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)無(wú)明顯差異。表1結(jié)果表明，試驗(yàn)前、試驗(yàn)后、攝入的葉片質(zhì)量的試驗(yàn)組和對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。說明蒙古蕕乙醇提取物對(duì)蛞蝓的趨避作用不顯著，即蛞蝓對(duì)蒙古蕕乙醇提取物不敏感。因此，可初步認(rèn)為，蒙古蕕中可能不存在或僅存在少量對(duì)蛞蝓有防治作用的次生代謝產(chǎn)物。

表1 蛞蝓趨避試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析

2.2 毒殺活性測(cè)定結(jié)果分析

判斷依據(jù)：以毛筆觸及蟲體，其觸角和足完全不動(dòng)則判定該蟲體死亡。

以3次重復(fù)的死亡率平均值，代入公式計(jì)算校正死亡率。

從表2可知，蒙古蕕、百里香、艾蒿的乙醇提取物對(duì)菜蚜都有一定的毒殺作用，其中蒙古蕕乙醇提取物在作用24 h后毒殺效果最明顯，說明該提取物中的確含有某些殺蟲成分，且這些成分對(duì)菜蚜的防治有一定作用效果。因此，可將蒙古蕕醇提物進(jìn)行成分分析，并根據(jù)已有文獻(xiàn)對(duì)毒殺作用的主要作用成分進(jìn)行推測(cè)。

表2 三種植物提取物對(duì)菜蚜的毒殺測(cè)試（單位：%）

2.3 成分分析結(jié)果

將蒙古蕕的醇提取物進(jìn)行LC-MS和HS-SPMEGC-MS分析，結(jié)果表明：蒙古蕕中含有大量已知的生物堿、萜類、黃酮類化合物，其中生物堿有瓶千里光堿、葫蘆巴堿、3α·6β-二巴豆酰氧基莨菪烷-7β-醇、O-乙酰乙醇胺、巴豆苷、吲哚、甜菜堿等；萜類包括丹參新酮、靈芝酸、青蒿素、奇壬醇、乙酸香葉酯、3-蒈烯、β-石竹烯等；黃酮類有山萘酚3-O-洋槐糖苷、木犀苷、槲皮素3-O-葡萄糖酸苷、紫云英苷等。

其中表3所示成分具有殺蟲、驅(qū)蟲作用，推測(cè)可能在本試驗(yàn)中起主要作用，可作為下一步蒙古蕕殺蟲物質(zhì)研究的試驗(yàn)依據(jù)。

表3 蒙古蕕殺蟲成分分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

植物次生代謝物質(zhì)中的部分化合物具有驅(qū)殺、觸殺、胃毒等殺蟲作用，本研究以蒙古蕕為主要材料，對(duì)其次生代謝物質(zhì)進(jìn)行驅(qū)蟲、殺蟲測(cè)試，通過分析其次生代謝物的主要成分，推測(cè)驅(qū)蟲、殺蟲的主要有效物質(zhì)，為蒙古蕕次生代謝物的后續(xù)研究提供部分依據(jù)，也為植物源殺蟲劑的前期篩選做出了判斷。

次生代謝物中多數(shù)成分為醇溶性物質(zhì)，因此本試驗(yàn)以乙醇為溶劑進(jìn)行次生代謝物的提取，采用超聲波法處理，提高提取率。運(yùn)用浸蟲法模擬現(xiàn)實(shí)中殺蟲劑與蟲體的接觸。根據(jù)毒力測(cè)試結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)可分離提純對(duì)菜蚜有毒殺作用的成分，增加試劑的濃度梯度進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)試，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得出毒力回歸方程等。蛞蝓的趨避試驗(yàn)效果不顯著的原因可能是蛞蝓個(gè)體對(duì)氣味、物質(zhì)的敏感差異，或是提取物中主要驅(qū)蟲成分濃度低或部分成分相互抑制導(dǎo)致對(duì)蛞蝓的驅(qū)蟲效果不明顯等。可根據(jù)推測(cè)原因修改試驗(yàn)條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，也可更換其他試蟲如鱗翅目黏蟲進(jìn)行毒力測(cè)試，或根據(jù)成分分析結(jié)果提純化合物后再次進(jìn)行毒力測(cè)試試驗(yàn)。通過測(cè)試尋找最佳的殺蟲成分和有效成分比例，擬研究開發(fā)出新型、環(huán)保、高效的植物源殺蟲劑。

通過分析蒙古蕕次生代謝物對(duì)蛞蝓、菜蚜的作用結(jié)果，我們得到以下結(jié)論：蒙古蕕乙醇提取物對(duì)蛞蝓趨避作用效果不顯著。蒙古蕕、百里香、艾蒿的乙醇提取物對(duì)菜蚜都有一定的毒殺作用，其中蒙古蕕乙醇提取物在作用24 h后毒殺效果最明顯。在蒙古蕕的次生代謝物中，瓶千里光堿、新烏頭堿、β-石竹烯、土木香內(nèi)酯、蒎烯、異土木香內(nèi)酯等成分具有殺蟲作用。

本研究發(fā)現(xiàn)蒙古蕕的乙醇提取物中存在對(duì)菜蚜的毒殺成分，為菜蚜的防治提供研究方向，對(duì)蒙古蕕醇提物的成分分析為部分天然化合物的提取提供參考。