間歇性禁食對(duì)小鼠腦缺血再灌注TLR4/NF-κB通路的作用

王欣格 劉恒方 田建榮 王成名 張 敏

腦血管病是常見的腦部疾病,復(fù)發(fā)率和病死率高。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)在腦血管病中占主要地位,其可以導(dǎo)致神經(jīng)元變性、壞死或凋亡,并且產(chǎn)生炎性反應(yīng)[1]。其中炎性反應(yīng)在缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵性作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB信號(hào)通路是炎癥形成的主要信號(hào)通路。一些內(nèi)生的配體通過激活TRL4受體激活NF-κB，導(dǎo)致其釋放促炎細(xì)胞因子[2]。而腦缺血再灌注損傷后可以使NF-κB信號(hào)通路激活,促進(jìn)炎性因子的大量表達(dá),腦組織損傷進(jìn)一步加重[3]。禁食是一種新的食物攝入方式，包括飲食限制(dietary restriction，DR)、熱量限制(caloric restriction，CR)、間歇性禁食(intermittent fasting，IF)[4]。近20年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)IF和CR可以延緩衰老，減少腫瘤及心腦血管疾病，增強(qiáng)生物體承受后續(xù)壓力的能力[5,6]。

本研究旨在通過間歇性禁食，觀察小鼠局部CIRI后神經(jīng)功能缺損評(píng)分及TLR4、NF-κB的表達(dá)，從動(dòng)物試驗(yàn)的角度探討間歇性禁食對(duì)CIRI是否具有抗炎作用，從而為缺血性腦血管病的預(yù)防性治療提供新的臨床思路。

材料與方法

1.材料:(1)動(dòng)物：健康6～7周齡雄性KM小鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量為20～25g，喂養(yǎng)于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室SPF動(dòng)物室[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXX(豫)2019-0002]。(2)試劑：兔抗小鼠TLR4一抗，兔抗小鼠NF-κB p65一抗(武漢三鷹有限公司)；HE(蘇木精-伊紅)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。(3)儀器：手術(shù)顯微鏡購自北京中西遠(yuǎn)大科技公司；電泳及轉(zhuǎn)膜槽購自美國(guó)Bio-Rad公司；高精度電子天平購自北京生物儀器有限公司；全自動(dòng)包埋機(jī)購自Leica公司；顯微鏡及其圖像分析軟件購自德國(guó)Carl Zeiss Jena公司；血糖測(cè)量?jī)x、血糖試條(葡萄糖脫氫酶法)購自北京怡成生物電子技術(shù)股份有限公司。

2.分組：將小鼠隨機(jī)分成3組，15只/組。分別為間歇性禁食組(IF組)、正常飲食組(CIRI組)和假手術(shù)組(Sham組)。IF組16：00時(shí)至次日8:00時(shí)禁食，其余時(shí)間隨意進(jìn)食，24h自由飲水。CIRI組及Sham組均24h隨意進(jìn)食。

3.小鼠體質(zhì)量及血糖測(cè)量：第0天、第3天、第7天、第11天、第14天15:00時(shí)左右用稱重儀器測(cè)量體質(zhì)量并記錄，同時(shí)檢測(cè)各組隨機(jī)血糖情況。

4.小鼠腦缺血再灌注模型制備：參考Longa等[7]線栓法堵塞小鼠大腦中動(dòng)脈構(gòu)建小鼠腦缺血再灌注模型，各組預(yù)處理完畢后，麻醉小鼠，用碘伏消毒頸部皮膚后縱行切開，暴露術(shù)野，在顯微鏡下分離出頸動(dòng)脈，結(jié)扎近心端，在其分叉處打活結(jié)，之間再打1個(gè)單結(jié)。在外科結(jié)和活結(jié)處剪口，插入線栓后將單結(jié)固定，線栓插入1.5cm時(shí)停止，固定，打結(jié)，縫皮。1h后，將線栓拔出少許，多余部分剪掉。各組模型制備成功約24h后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。Sham組除不插入線栓外，手術(shù)步驟相同。術(shù)后各組小鼠均在23℃條件下復(fù)蘇，此時(shí)均不控制進(jìn)食。

5.Longa神經(jīng)功能評(píng)分:小鼠造模24h后，參考Longa等(0～4分)5分制對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分[7]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分：無肢體偏癱、活動(dòng)正常者;1分：左側(cè)前爪不能完全伸展；2分：行走時(shí)向左轉(zhuǎn)圈；3分：爬走時(shí)身體向左傾倒；4分：不能行走，意識(shí)喪失。其中，0分及4分小鼠均棄用。

6.病理組織切片制備:各組隨機(jī)選取6只小鼠，心臟灌流直至血液變?yōu)榍宄?，隨后用4%多聚甲醛固定至小鼠四肢及軀干僵硬為止。取腦組織，4%多聚甲醛4℃固定24h后，依次完成脫水步驟，隨后進(jìn)行后續(xù)包埋等操作。

7.蘇木精-伊紅(HE)染色:石蠟切片按HE染色步驟經(jīng)脫蠟、脫水、染色、沖洗、中性樹膠封片,光鏡下觀察腦組織細(xì)胞形態(tài)。

8.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)NF-κB p65及TLR-4的表達(dá):腦組織切片經(jīng)脫蠟、脫水、PBS反復(fù)沖洗等步驟后再進(jìn)行抗原修復(fù),5%BSA封閉30min,棄去，加入一抗工作液,放于4℃冰箱過夜;次日復(fù)溫30min，沖洗,滴加二抗,室溫孵育30min,沖洗,滴加DAB顯色,中性樹膠封片。顯微鏡下用高倍鏡觀察，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行細(xì)胞陽性計(jì)數(shù)。

結(jié) 果

1.體質(zhì)量及血糖：IF組、CIRI組、Sham組的體質(zhì)量較分組處理前均增加。最初3天，各組小鼠的體質(zhì)量無明顯變化。7天后，與IF組比較，CIRI組和Sham組的體質(zhì)量均有明顯增長(zhǎng)，但CIRI組與Sham組體質(zhì)量變化比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組的隨機(jī)血糖變化比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見圖1。

圖1 小鼠體質(zhì)量及血糖變化

2.神經(jīng)功能評(píng)分：與Sham組比較，IF組及CIRI組神經(jīng)功能評(píng)分明顯改變，均有不同程度的神經(jīng)功能缺損。與CIRI組比較，IF組神經(jīng)功能評(píng)分明顯下降，詳見圖2。

圖2 小鼠神經(jīng)功能評(píng)分與IF組比較，*P<0.05；與CIRI組比較，#P<0.05；與Sham組比較，▲P<0.05

3.HE染色情況：(1)IF組：缺血半暗帶及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞深染明顯減輕，細(xì)胞皺縮及細(xì)胞形態(tài)明顯改善，細(xì)胞損傷程度較CIRI組明顯改善。(2)CIRI組：缺血半暗帶及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞深染皺縮，與周圍分界不清，細(xì)胞核固縮深染。(3)Sham組：缺血半暗帶及海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整。詳見圖3、圖4。

圖3 腦缺血半暗帶HE染色圖(×400)

圖4 海馬CA1區(qū)HE染色圖(×400)

4.TLR4、NF-κB免疫組化表達(dá)情況:鏡下觀察，呈棕黃色顆粒物質(zhì)的為陽性信號(hào)。IF組及CIRI組：腦組織TLR4及NF-κB 顯著表達(dá)。Sham組：腦組織細(xì)胞TLR4及NF-κB 微弱表達(dá)。與Sham組比較，CIRI組的TLR4及NF-κB 呈強(qiáng)陽性表達(dá)，IF組也呈較強(qiáng)陽性表達(dá)。與CIRI組比較，IF組的TLR4及NF-κB的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,詳見圖5～圖7。

圖5 TLR4免疫組化表達(dá)情況(×400，棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞)

圖6 NF-κB免疫組化表達(dá)情況(×400，棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞)

圖7 免疫組化結(jié)果

討 論

隨著腦血管病發(fā)生率的逐年升高，在腦血管病中占比極高的CIRI也被越來越多地研究，目前關(guān)于CIRI的發(fā)病機(jī)制，主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥和凋亡等，其中炎癥和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致CIRI的主要因素[8～10]。熱量限制指的是攝食種類正常，總量減少30%～40%，同時(shí)保證必須氨基酸的攝入，具有簡(jiǎn)單易施，無藥物毒性不良作用等優(yōu)點(diǎn)[11，12]。其中，IF是熱量限制較為常用的方案。研究表明，CR可減少炎癥和NF-κB信號(hào)表達(dá)并且對(duì)炎性反應(yīng)具有重要作用[13]。

吉曄楠[14]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠進(jìn)行8周的熱量限制可減小心肌缺血再灌注損傷后的心肌梗死面積，使心肌缺血再灌注損傷得到明顯改善，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)CR對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)與抑制TLR4/NF-кB通路激活有關(guān)。未造成小鼠的明顯損傷，還能優(yōu)化小鼠的基本生理指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過14天的間歇性禁食，各組小鼠體質(zhì)量均顯著增加。前3天，3組小鼠體質(zhì)量變化均不明顯，這可能與禁食期間攝食不足有關(guān)。7天后，各組體質(zhì)量變化出現(xiàn)明顯差異，多考慮為IF組小鼠習(xí)慣禁食方案，開始自我調(diào)節(jié)以保證能量需求。各組小鼠血糖比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明間歇性禁食未對(duì)小鼠血糖造成明顯影響，兩項(xiàng)研究結(jié)果相似，說明IF不會(huì)造成小鼠生理功能等的損傷。任晉軍[15]研究發(fā)現(xiàn)，在建立肝缺血再灌注模型前對(duì)小鼠進(jìn)行IF3個(gè)月，可以抑制NF-κB信號(hào)通路及肝組織TLR4的表達(dá)，對(duì)肝臟的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。以上研究均證實(shí)CR可能通過抑制炎性反應(yīng)來減輕機(jī)體缺血再灌注損傷的程度。但是間歇性禁食在腦缺血再灌注損傷中TLR4/NF-κB通路的抑制作用研究較為罕見。

Varendi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠模型造模前，給予大鼠3天禁食或者6天無蛋白飲食，與正常飲食組比較，可以減少腦梗死面積，改善腦缺血再灌注損傷。也有研究證實(shí)，在進(jìn)行大腦中動(dòng)脈阻斷術(shù)前進(jìn)行40 周的禁食能夠減少大鼠腦組織的梗死面積，降低腦卒中后的病死率[17,18]。本實(shí)驗(yàn)采用tMCAO模型，發(fā)現(xiàn)與Sham組比較，CIRI組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高，表明模型組腦缺血再灌注損傷嚴(yán)重，提示造模成功。與CIRI組比較，IF組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯下降，表明IF組可有效改善小鼠行為學(xué)，減輕腦缺血再灌注損傷程度。同時(shí)，HE染色顯示，與CIRI組小鼠比較IF組腦組織缺血半暗帶區(qū)及海馬CA1區(qū)細(xì)胞深染及皺縮明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)改善，說明IF可減輕腦組織壞死程度，緩解腦組織損傷。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與這些實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相同，表明間歇性禁食可減輕腦缺血再灌注損傷程度。

有研究表明，預(yù)防性IF可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路減輕炎性反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，曹參祥等實(shí)驗(yàn)采用TLR4功能缺陷的小鼠，制作小鼠大腦中動(dòng)脈再灌注模型，并對(duì)比神經(jīng)功能缺損評(píng)分及TLR4表達(dá)等情況，發(fā)現(xiàn)TLR4功能缺陷的小鼠CIRI程度比TLR4表達(dá)正常的小鼠明顯減輕[19,20]。本實(shí)驗(yàn)從免疫組化結(jié)果可看出CIRI組中TLR4及NF-κB 陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色顆粒,呈強(qiáng)陽性表達(dá)。IF組陽性細(xì)胞表達(dá)較CIRI組顯著減少，提示IF與TLR4/NF-κB通路有聯(lián)系,減輕了腦缺血再灌注的損傷程度，這與曹參祥等[20]、吉曄楠[14]及任晉軍[15]的研究結(jié)果類似，表明IF可能通過抑制TLR4/NF-κB通路從而減輕腦缺血再灌注損傷程度，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。

綜上所述，本研究證實(shí)，IF可能通過抑制TLR4、NF-κB的表達(dá)，來減輕CIRI造成的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可為臨床治療提供新的思路。但間歇性禁食也存在患者難以堅(jiān)持、依從性差等問題，后續(xù)可繼續(xù)尋找替代療法或加強(qiáng)患者依從性的方案，以尋求更好的治療效果。