肥胖相關(guān)基因多態(tài)性與阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征遺傳易感性的關(guān)系

穆婭沙·塔衣爾 曹媛媛 朱 晴 木葉斯?fàn)枴つ竞纤?蔡昕添 古再麗努爾·吐爾遜 張德蓮 胡君麗 李南方

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)是一種睡眠障礙性疾病，作為多種心血管疾病的危險因素，以夜間反復(fù)低氧、睡眠結(jié)構(gòu)紊亂為特征[1]。估計全球有近10億年齡在30～69歲的成年人可能患有OSAHS，而且有增高趨勢[2]。這暗示此疾病常常被低估，給患者身心健康和社會經(jīng)濟(jì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[3]。與阻塞性睡眠呼吸暫停相關(guān)的主要臨床風(fēng)險是多器官系統(tǒng)損害，如心腦血管疾病、神經(jīng)認(rèn)知功能障礙和代謝綜合征[4,5]。OSAHS有明顯家族聚集性和遺傳性，有證據(jù)表明，遺傳因素對OSAHS易感性既有直接影響，也可通過肥胖、顱面結(jié)構(gòu)等“中間表型”間接影響，鑒定決定中間表型的基因可能有助于確定OSAHS易感基因[6，7]。肥胖是OSAHS最重要的危險因素之一，大約2/3的患者伴隨著肥胖[8]。體重指數(shù)(BMI)>29kg/m2會使OSAHS患病風(fēng)險增加10倍[9]。肥胖基因多態(tài)性與OSAHS易感性之間的關(guān)聯(lián)仍然知之甚少，且既往研究往往存在爭議[10,11]。本研究從現(xiàn)有文獻(xiàn)和PHGKB數(shù)據(jù)庫中選取肥胖相關(guān)基因，用二代目標(biāo)靶序列測序技術(shù)篩查可能與OSAHS相關(guān)的易感基因，探討基因位點與OSAHS易感性之間的關(guān)系，為后續(xù)的機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

對象與方法

1.研究對象: 納入標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)納入2016年4～12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓科住院并疑診OSAHS(有夜間打鼾、無誘因白天嗜睡者、不能解釋的口唇紫紺)的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在18周歲以下；②有其他呼吸系統(tǒng)疾病；③惡性腫瘤、急性感染及其他臨床診斷的全身性炎癥性疾病(結(jié)締組織性疾病、自身免疫性疾病)；④嚴(yán)重的心臟、腦、肝臟、腎臟疾??；⑤嚴(yán)重的睡眠障礙與精神障礙；⑥未能完成整夜多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(polysomnography，PSG)等。納入根據(jù) AHI值選擇表型極嚴(yán)重者(AHI≥50次/時)為重度 OSAHS組與表型正常者(AHI<5次/時)為非 OSAHS 組，研究對象簽署書面知情同意書[12]。本研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審批。

2.基線資料收集與檢測：所有受試者的過夜PSG監(jiān)測、臨床數(shù)據(jù)采集、血樣采集和基因組DNA提取均按照前面描述的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行[12，13]?；€資料包括年齡、性別、頸圍、腹圍、收縮壓、舒張壓，并計算體重指數(shù)(BMI)=體重/身高2(kg/m2)。利用采用BECKMAN全自動生化分析儀檢測高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)。

3.DNA提取和鑒定：將血樣從-80℃冰箱中拿出，室溫放置30～60min解凍。取EP管加入20μl蛋白酶K，加入200μl EDTA抗凝全血和等體積緩沖液BL，劇烈振蕩混勻；放入預(yù)熱至56℃金屬浴或水浴中反應(yīng)10min裂解細(xì)胞，待裂解物冷卻后加入200μl無水乙醇，振蕩混勻；將裂解物全部轉(zhuǎn)移至已活化的吸附柱中，12000r/min離心1min，更換新的收集管，加入500μl BW1，12000r/min離心1min，棄廢液，再加入500μl BW2，12000r/min離心1min，棄廢液；12000r/min離心1min，將吸附柱插在潔凈的EP管中，并加入60μl洗脫緩沖液BE，12000r/min離心1min，收集DNA；測定DNA濃度，范圍在20～50ng/μl，A280/A230>2.0，A260/A280為1.75～1.95。

4.候選基因選擇及二代靶向捕獲測序：聯(lián)合基因-表型數(shù)據(jù)庫(Public Health Gengmics Knowledge Base)，在大量文獻(xiàn)復(fù)習(xí)及以往研究基礎(chǔ)上，篩選了與肥胖相關(guān)基因17個候選基因，對通過目標(biāo)區(qū)域測序篩選出的高頻 SNPs 位點(MAF>1%)進(jìn)行進(jìn)一步關(guān)聯(lián)分析。實驗均由上海天昊生物技術(shù)有限公司實施。該測序采用多重PCR的方法及Lumina測序技術(shù)平臺，對100個樣本的目標(biāo)序列即所選研究基因的全部外顯子以及側(cè)翼序列(質(zhì)檢合格)進(jìn)行測序，要求測序深度達(dá)到100×通過與大型的人類學(xué)數(shù)據(jù)庫及千人組基因庫的數(shù)據(jù)比對分析篩選新的、特異性的突變體。對于發(fā)現(xiàn)的SNP位點應(yīng)在dbSNP數(shù)據(jù)庫中找到相應(yīng)的rs號，對于發(fā)現(xiàn)的突變要確定其在cDNA中的位置。

5.基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析：用GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選出跟OSAHS相關(guān)的基因，按相關(guān)分?jǐn)?shù)高低，選出的前50個基因，導(dǎo)入利用互作基因的檢索工具(STRING，11．0 版)，種屬限定為“Homo sapiens”，最小連接評分(combined score)值為0.4，再導(dǎo)出相應(yīng)結(jié)果文件，使用 Cytoscape 軟件(版本3.7.2)可視化 PPI 網(wǎng)絡(luò)。

結(jié) 果

1.兩組臨床資料比較：根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，納入100例受試者，包括非OSAHS組50例，重度OSAHS組50例。發(fā)現(xiàn)重度OSAHS組男性患者明顯高于女性患者(80% vs 20%，P<0.05)。重度OSAHS組患者的體重指數(shù)(BMI)、頸圍、腰圍、甘油三酯水平均明顯高于非OSAHS組，而高密度脂蛋白膽固醇含量明顯低于非OSAHS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而兩組在飲酒史、收縮壓、舒張壓、睡眠效率、總睡眠時間、膽固醇方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組臨床資料比較

2.基因及位點并與OSAHS人群的Logistic回歸分析：從現(xiàn)有文獻(xiàn)和PHGKB數(shù)據(jù)庫中選取肥胖相關(guān)基因(CCKAR、CRP、HCRTR2、HCRTR1、INSIG2、LEP、LEPR、LPL、PPARG、UCP1、FABP2、MC3R、MC4R、SERPINE1、TNF、UCP2、UCP3)，進(jìn)行二代高通量二代測序目標(biāo)靶序列測序，最終篩查遵循Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)并4種基因模型中至少有1種模型符合(P<0.1)的6個基因，11個位點，分別是：過氧化物酶體受體γ(PPARG)基因的rs12486170、rs17036160位點，解偶聯(lián)蛋白1 (UCP1)基因的rs3811790位點，解偶聯(lián)蛋白2 (UCP2)基因的rs660339位點，脂肪酸結(jié)合蛋白2 (FABP2)基因的rs2964、rs1511025位點，HCRTR2基因的rs12486170、rs6937662、rs9370399、rs77680302位點，腫瘤壞死因子(TNF)基因的rs1800630位點。對11個位點進(jìn)行簡單及多因素Logistic回歸分析，對性別、年齡、BMI校正以后，結(jié)果表明，PPARG基因rs12486170位點(OR=0.260，95% CI：0.079～0.852，P=0.026)和TNF基因rs1800630位點(OR=4.907，95% CI：1.112～21.666，P=0.036)分別是患OSAHS的保護(hù)因素和危險因素。與其余位點無相關(guān)性(P>0.05，表2)。

表2 基因位點與OSAHS人群的Logistic回歸分析

3.基因位點基因型及等位基因頻率分布特征：篩選的OSAHS易感基因位點基因型及等基因位分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律 (P>0.05)，基因頻率處于遺傳平衡狀態(tài)，具有群體代表性。由于篩選出的SNP位點數(shù)目較多，結(jié)果部分僅列出在后多因素Logistic回歸分析中兩組間有差異的變異位點。非OSAHS組與重度OSAHS組比較，兩組TNF基因rs1800630位點(χ2=6.282，P=0.043)位點基因型和等位基因分布頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，PPARG基因rs12486170位點基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表3)。

表3 基因多態(tài)性與非OSAHS組與重度OSAHS組分布頻率的比較[n(%)]

4.基因位點的各基因型與OSAHS易感性的關(guān)系：以研究對象是否患OSAHS為因變量，選取多因素有差異的PPARG基因rs12486170位點和TNF基因rs1800630的各基因型與等位基因為協(xié)變量，經(jīng)調(diào)整年齡、性別和BMI后進(jìn)行Logistic回歸分析，評估了在加性、顯性、隱性模型與OSAHS風(fēng)險。結(jié)果顯示，PPARG基因rs12486170位點在顯性模型當(dāng)AG和GG基因型聯(lián)合使用時，聯(lián)合組的OSAHS風(fēng)險降低(OR=0.260,95% CI：0.079～0.852，P=0.026)。其余加型、隱形模型差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。TNF基因rs1800630，在加性模型中，A等位基因攜帶者患OSAHS風(fēng)險明顯高于C等位基因攜帶者(OR=3.342,95% CI:1.013～11.029,P=0.048)。在顯性模型中，具有CA/AA基因型患OSAHS風(fēng)險相對于CC基因型顯著增加(OR=4.907，95%CI：1.112～21.666，P=0.036)。隱形模型基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表4)。

表4 基因位點各基因型與OSAHS易感性的關(guān)系

5.基因位點與OSAHS患者臨床指標(biāo)關(guān)系：基因型-表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，PPARG基因rs12486170位點AA基因型與AG/GG基因型及rs1800630位點CC基因型與CA/CC基因型分別與OSAHS患者的BMI、頸圍、腰圍、AHI、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而攜帶rs12486170 AG/GG基因型的受試者AHI明顯低于AA型(P=0.019)。TNF基因rs1800630有CA/AA基因型的個體OSAHS相對于CC基因型且AHI明顯低于CC型(P=0.013，表5)。

表5 基因型與各臨床指標(biāo)的關(guān)系

6.基因與OSAHS相關(guān)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析：用GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選出OSAHS相關(guān)的基因關(guān)聯(lián)強(qiáng)度最高的前50個基因，導(dǎo)入利用互作基因的檢索工具(STRING，11.0版)，種屬限定為“Homo sapiens”，最小連接評分(combined score)值為0.4，再導(dǎo)出相應(yīng)結(jié)果文件，使用 Cytoscape 軟件(版本3.7.2) 可視化 PPI 網(wǎng)絡(luò)，最終50個基因產(chǎn)物在字符串?dāng)?shù)據(jù)庫中顯示出潛在的物理相互作用，從而形成一個復(fù)雜的多中心互動網(wǎng)絡(luò)。將互作顯著的基因?qū)隒ytoscape計算拓?fù)涮卣鳌SAHS結(jié)47個結(jié)節(jié)和484個邊緣，最大連接值為43，越大的連接性值表明蛋白質(zhì)之間有很強(qiáng)的相互作用，因此有助于穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)模型的關(guān)鍵性質(zhì)，PPARG與TNF連接值分別為38與31，進(jìn)一步證實兩個基因與OSAHS的相關(guān)性(圖1)。

圖1 互動網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣?/p>

討 論

OSAHS是一種以夜間睡眠打鼾、呼吸暫停和日間嗜睡為特征的睡眠呼吸紊亂疾病，可導(dǎo)致間歇性低氧血癥、高碳酸血癥和睡眠結(jié)構(gòu)紊亂,是一種發(fā)生率較高且具有潛在危險的疾患，它能引起一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重時可導(dǎo)致睡眠時猝死[14]。OSAHS多發(fā)于肥胖患者大約2/3的患者伴隨著肥胖，已知 OSAHS是可遺傳的，大約 40% 的 AHI 變異可歸因于遺傳因素，可以通過肥胖等“中間表型”找到OSAHS的易感基因，可進(jìn)一步應(yīng)用到臨床實踐中[6]。本研究對選取的肥胖相關(guān)基因中進(jìn)行全部外顯子以及側(cè)翼序列進(jìn)行高通量二代測序，最后從選出的6個基因，11個位點中，發(fā)現(xiàn)PPARG基因rs12486170位點和TNF基因rs1800630位點分別是患OSAHS的保護(hù)因素和危險因素，且基因多態(tài)性增加了人群對OSAHS的易感性?？赏ㄟ^檢測位點基因型來評估OSAHS的風(fēng)險程度。

腫瘤壞死因子(TNF),又稱惡液質(zhì)素。TNF主要由活化的巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。既往研究主要聚集在TNF與冠心病、自身免疫性疾病、乙型病毒感染等疾病的關(guān)系[15，16]。人類肥胖與循環(huán)TNF增加有關(guān)，這是一種導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡的促炎性細(xì)胞因子。研究表明，肥胖人群和動物的血清TNF水平較高，是由脂肪組織來源的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的。TNF細(xì)胞因子通過自分泌和旁分泌機(jī)制調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的增殖和凋亡，促進(jìn)脂肪分解，抑制脂質(zhì)合成，降低血脂[17]。最近TNF與OSAHS風(fēng)險的關(guān)聯(lián)已被廣泛評估，TNF抑制已被證明改善OSAHS的進(jìn)展[18]。TNF基因多態(tài)性與OSAHS的關(guān)系也有研究[19，20]。過氧化物酶體受體γ(PPARG)是核受體家族的成員，PPARG與肥胖的發(fā)展有關(guān)，PPARG激活脂肪細(xì)胞分化，并介導(dǎo)脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，PPARG基因多態(tài)性與肥胖的關(guān)系也有研究[21]。研究顯示，PPARG在OSAHS底層病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用[22]。本研究中更加證實了OSAHS與這兩種基因的關(guān)系，并找到OSAHS易感基因位點。

本研究觀察到PPARG基因rs12486170位點中，具有AG/GG基因型比較，AA基因型的OSAHS的風(fēng)險降低，TNF基因rs1800630位點，具有CA/AA基因型中，OSAHS風(fēng)險相對于CC基因型顯著增加，在臨床上可作為遺傳性標(biāo)記進(jìn)行檢測，在一定程度上發(fā)現(xiàn)預(yù)防高危人群?；虮硇团c臨床資料的關(guān)系中，得出兩個位點與AHI有相關(guān)性，進(jìn)一步證實rs12486170與rs1800630是的OSAHS易感基因。最后的基因互做網(wǎng)絡(luò)圖中更容易看出，TNF與PPARG與OSAHAS的相關(guān)性強(qiáng)度，這個在人群中也被證實。

本研究雖然嚴(yán)格挑選了進(jìn)入對照組的非 OSAHS患者，使其能在性別、年齡、體重指數(shù)上與病例組患者相匹配，但由于這些混雜因素是該病的強(qiáng)危險因素，本研究未能找到足夠質(zhì)量的肥胖、男性而無OSAHS的對照樣本。因此在分析基因遺傳變異不同遺傳模型下對OSAHS的影響時，筆者利用多因素Logistic回歸校正了性別、年齡、BMI的影響。本研究存在一定局限性：(1)根據(jù)復(fù)雜疾病外顯子測序研究策略，考慮到實驗速度和成本，選擇了每組50 例作為樣本。小樣本篩選出的易感基因在驗證隊列中不能得到很好的復(fù)制，后續(xù)的研究需擴(kuò)大樣本量重復(fù)驗證本研究結(jié)果，以提高結(jié)論的外推性。(2)不同人群的遺傳背景不同，基因型分布頻率在不同人群中可能存在差異，為提高研究對象的群體代表性，今后可在不同民族人群中重復(fù)驗證。(3)篩選出的易感基因還需要通過細(xì)胞或動物實驗進(jìn)一步進(jìn)行功能研究，為最終揭示OSAHS發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，控制OSAHS的發(fā)生提供更多的科學(xué)依據(jù)。