毛蕊花糖苷對(duì)大鼠肝微粒體中6種CYP酶的體外抑制作用

王志 張海波 居博偉 胡君萍 楊建華

中圖分類(lèi)號(hào) R285.5;R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）06-0685-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.06.07

摘 要 目的 考察毛蕊花糖苷對(duì)大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450（CYP）酶的體外抑制作用。方法 采用探針底物法，在大鼠肝微粒體中加入0.1、0.3、1、3、10、30 μmol/L的毛蕊花糖苷，與探針底物非那西丁、美芬妥因、雙氯芬酸、香豆素、右美沙芬、睪酮（分別為CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2A6、CYP2D6、CYP3A4酶的底物）共同孵育。在另設(shè)空白對(duì)照組和陽(yáng)性抑制劑組[α-萘黃酮、噻氯匹定、磺胺苯吡唑、毛果蕓香堿、奎尼丁、酮康唑（分別為CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2A6、CYP2D6、CYP3A4酶的抑制劑）]的基礎(chǔ)上，以吲達(dá)帕胺為內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)相應(yīng)代謝產(chǎn)物（對(duì)乙酰氨基酚、4-羥基美芬妥因、4-羥基雙氯芬酸、7-羥基香豆素、右啡烷、6β-羥基睪酮）的含量，運(yùn)用GraphPad v8.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）;采用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接技術(shù)，將毛蕊花糖苷和陽(yáng)性抑制劑分別與CYP酶進(jìn)行分子對(duì)接，分析二者分子結(jié)合方式及結(jié)合能力強(qiáng)弱。結(jié)果 毛蕊花糖苷對(duì)CYP1A2、CYP2A6酶的IC50>30 μmol/L，對(duì)CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4酶的IC50分別為24.87、21.52、12.56、7.55 μmol/L。毛蕊花糖苷與CYP3A4酶之間可形成氫鍵并產(chǎn)生疏水作用力，酮康唑與CYP3A4酶之間可形成氫鍵并產(chǎn)生靜電相互作用;毛蕊花糖苷和酮康唑與CYP3A4酶的結(jié)合自由能分別為-10.2、-12.4 kcal/mol（1 kcal/mol=4.19 kJ）。結(jié)論 毛蕊花糖苷對(duì)大鼠肝微粒體中CYP3A4酶有中等強(qiáng)度的抑制作用，且親和力與陽(yáng)性抑制劑相當(dāng);該化合物對(duì)其他5種CYP酶的抑制作用弱。

關(guān)鍵詞 毛蕊花糖苷;大鼠肝微粒體;細(xì)胞色素P450酶;抑制作用;探針底物法;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;分子對(duì)接技術(shù)

In vitro inhibitory effects of acteoside on 6 kinds of CYP enzymes in liver microsomes of rats

WANG Zhi1，2，ZHANG Haibo1，2，JU Bowei1，HU Junping1，YANG Jianhua1，2（1. College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China; 2. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To investigate the in vitro inhibitory effects of acteoside on cytochrome P450（CYP） enzymes in liver microsomes of rats. METHODS Using probe substrates method， acteoside （0.1， 0.3， 1， 3， 10， 30 μmol/L） was incubated with probe substrates phenacetin， mephentoin， diclofenac， coumarin， dextromethorphan and testosterone （substrates of CYP1A2， CYP2C19， CYP2C9， CYP2A6， CYP2D6 and CYP3A4 enzymes， respectively） in liver microsomes of rats. Another blank control group and positive inhibitor group [α-naphthoflavone， ticlopidine， sulfabendazole， pilocarpine， quinidine and ketoconazole （inhibitors of CYP1A2， CYP2C19， CYP2C9， CYP2A6， CYP2D6 and CYP3A4 enzymes， respectively）] were set up. Using indapamide as the internal standard， the contents of corresponding metabolites （acetaminophen， 4-hydroxymephenytoin， 4-hydroxydiclofenac， 7-hydroxycoumarin， dextran， 6β-hydroxytestosterone） were detected by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The IC50 values were calculated by GraphPad v8.0 software. By computer molecular docking technology， acteoside and positive inhibitors were molecularly docked with the CYP enzyme， and the binding mode and strength of the two molecules were analyzed. RESULTS The IC50 values of acteoside to CYP1A2 and CYP2A6 enzymes were more than 30 μmol/L， and those of acteoside to CYP2D6， CYP2C19， CYP2C9 and CYP3A4 enzymes were 24.87， 21.52， 12.56 and 7.55 μmol/L， respectively. The hydrogen bond and hydrophobic force could form between acteoside and CYP3A4 enzyme， and the hydrogen bond and electrostatic interaction could form between ketoconazole and CYP3A4 enzyme. The binding free energy of acteoside and ketoconazole to CYP3A4 enzyme were -10.2 and -12.4 kcal/mol （1 kcal/mol=4.19 kJ）， respectively. CONCLUSIONS Acteoside shows moderate inhibitory effect on CYP3A4 enzyme in liver microsomes of rats， and its affinity is equivalent to that of positive inhibitor; the compound shows weak inhibitory effect on other 5 CYP enzymes.

KEYWORDS? ?acteoside; liver microsome in rats; cytochrome P450 enzymes; inhibitory effect; probe substrates method; ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; molecular docking technology

男性不育癥是目前臨床較為難治的疾病，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，男性不育癥的病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清晰，但可確定的是：人體的正常生殖活動(dòng)是在下丘腦-垂體-性腺軸的協(xié)調(diào)下完成的，所有異常的激素水平均可以影響男性生殖功能，導(dǎo)致男性生育能力降低[3]。睪酮是經(jīng)典的生殖內(nèi)分泌激素，在男性不育癥的診治中起著至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)有研究表明，細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶是影響睪酮生成及代謝的主要酶，是肝微粒體混合功能氧化酶系統(tǒng)的主要組成部分，是機(jī)體代謝藥物的重要酶[4-5]。CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2A6、CYP2D6、CYP3A4等CYP酶與藥物代謝功能的關(guān)聯(lián)尤為密切，其代謝的藥物占所有CYP酶代謝藥物的80%以上[6]。藥物產(chǎn)生相互作用的主要原因是CYP酶被抑制或誘導(dǎo)，約70%的代謝性相互作用主要是通過(guò)抑制藥物代謝酶而產(chǎn)生的[7]。

毛蕊花糖苷（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）是從列當(dāng)科Orobanchaceae肉蓯蓉屬Cistanche植物肉蓯蓉Cistanche deserticola Y. C. Ma中提取的一種含量較高的苯乙醇苷類(lèi)化合物[8-9]。2020年版《中國(guó)藥典》（一部）將毛蕊花糖苷列為肉蓯蓉藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[10]。肉蓯蓉是我國(guó)傳統(tǒng)名貴補(bǔ)益類(lèi)中藥，性溫、味甘，歸腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血等功效[11]。古代中醫(yī)藥典籍記載，肉蓯蓉為補(bǔ)腎要藥，是中醫(yī)治療男性不育癥的核心藥物，是歷代補(bǔ)腎陽(yáng)方劑中使用頻率較高的補(bǔ)益藥之一[12]。有研究表明，肉蓯蓉醇提物中的苯乙醇苷類(lèi)化合物可使大鼠血清睪酮水平和CYP酶表達(dá)水平均顯著升高[13]。睪酮水平的升高除了與其介導(dǎo)的CYP酶表達(dá)增多有關(guān)外，還與其介導(dǎo)的代謝相關(guān)CYP酶被抑制有關(guān)[14]。筆者由此推測(cè)，睪酮水平的升高可能與CYP酶被肉蓯蓉苯乙醇苷類(lèi)化合物抑制有關(guān)?；诖耍狙芯坷贸咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法結(jié)合肝微粒體體外代謝法[15]，選用《美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局藥物相互作用評(píng)價(jià)指南》推薦的底物[16]，考察毛蕊花糖苷對(duì)大鼠肝微粒體中6種常見(jiàn)CYP酶CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2A6、CYP2D6、CYP3A4的影響，探討該化合物是否會(huì)引起代謝性相互作用;同時(shí)，采用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)其潛在作用進(jìn)行驗(yàn)證，以期為毛蕊花糖苷的臨床前研究和新藥研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Acquity型UPLC-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）、Thermo Sorvall ST 16R型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、DK-S26型恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、DW-HL678型超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限責(zé)任公司）、雷磁PHSJ-3F型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、ME215S型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、MS3微型旋渦混合儀（德國(guó)IKA公司）、PURELAB Chorus 1 Complete型超純水儀（英國(guó)ELGA公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)516V079，純度≥98%）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉（批號(hào)310O021，純度≥98%）、葡萄糖-6-磷酸-二鈉（批號(hào)407H034，純度≥98%）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（批號(hào)821J012，純度為90%）、非那西丁對(duì)照品（批號(hào)517C025，純度≥98%）、對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（批號(hào)615C023，純度≥98%）、7-羥基香豆素對(duì)照品（批號(hào)923A024，純度≥98%）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;4-羥基美芬妥因?qū)φ掌罚ㄅ?hào)20J001，純度≥98%）、右啡烷對(duì)照品（批號(hào)202006，純度≥98%）、睪酮對(duì)照品（批號(hào)202006，純度≥98%）、6β-羥基睪酮對(duì)照品（批號(hào)20J001，純度≥98%）均購(gòu)自北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司;吲達(dá)帕胺對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)C10982435，純度≥98%）、無(wú)水磷酸氫二鉀（批號(hào)C10124744，純度≥98%）、磷酸二氫鉀（批號(hào)C11768869，純度≥99.5%）、雙氯芬酸對(duì)照品（批號(hào)C10093999，純度≥98%）、香豆素對(duì)照品（批號(hào)C10929365，純度≥98%）、α-萘黃酮對(duì)照品（批號(hào)C10983885，純度≥98%）、磺胺苯吡唑?qū)φ掌罚ㄅ?hào)C10648002，純度≥98%）、奎尼丁對(duì)照品（批號(hào)C10709588，純度≥98%）、噻氯匹定對(duì)照品（批號(hào)C11608567，純度≥98%）均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;美芬妥因?qū)φ掌罚ㄅ?hào)C34141133C65B，純度≥98%）購(gòu)自北京愛(ài)普拜生物科技有限公司;4-羥基雙氯芬酸對(duì)照品（批號(hào)Y19O11W125336，純度≥98%）、毛果蕓香堿對(duì)照品（批號(hào)Y19O11W125514，純度≥98%）、酮康唑?qū)φ掌罚ㄅ?hào)C11573894，純度≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司;右美沙芬對(duì)照品（批號(hào)1911271150R，純度≥99%）購(gòu)自廣東翁江化學(xué)試劑有限公司;甲醇（色譜純）和甲酸（色譜純）均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 其他

SD大鼠肝微粒體（20 mg/mL）購(gòu)自北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)為20190910RS。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，用甲醇稀釋并定容，配制成濃度為3 000 μmol/L的貯備液，于4 ℃下保存，備用。臨用前，精密量取毛蕊花糖苷貯備液適量，依次用甲醇稀釋成濃度分別為30、10、3、1、0.3、0.1 μmol/L的系列對(duì)照品溶液。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱(chēng)取吲達(dá)帕胺對(duì)照品適量，用甲醇稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，于4 ℃下保存，備用。臨用前，精密量取內(nèi)標(biāo)貯備液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為25 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸再生系統(tǒng)溶液的配制

稱(chēng)取煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉、葡萄糖-6-磷酸-二鈉、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶各適量，分別用水溶解，分裝并于-80 ℃下保存。使用時(shí)，取三者混合，配制成含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉7.5 mmol/L、葡萄糖-6-磷酸-二鈉75 mmol/L、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶15 U/mL的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸再生系統(tǒng)溶液（后文簡(jiǎn)稱(chēng)“再生系統(tǒng)溶液”）。

2.3 探針底物溶液、代謝產(chǎn)物溶液及陽(yáng)性抑制劑溶液的配制

精密稱(chēng)取CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2A6、CYP2D6、CYP3A4的探針底物（非那西丁、美芬妥因、雙氯芬酸、香豆素、右美沙芬、睪酮）、代謝產(chǎn)物（對(duì)乙酰氨基酚、4-羥基美芬妥因、4-羥基雙氯芬酸、7-羥基香豆素、右啡烷、6β-羥基睪酮）和陽(yáng)性抑制劑（α-萘黃酮、噻氯匹定、磺胺苯吡唑、毛果蕓香堿、奎尼丁、酮康唑）對(duì)照品各適量，用甲醇稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的貯備液，于4 ℃下保存，備用。臨用前，精密量取上述單一貯備液，用甲醇稀釋成濃度分別均為0.1、2.5、1、1、2、1 mmol/L的溶液，備用。

2.4 肝微粒體孵育體系的建立

肝微粒體孵育體系終體積為200 μL，體系中包含再生系統(tǒng)溶液60 μL、4 mmol/L氯化鎂20 μL、肝微粒體20 μL、探針底物20 μL、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4，下同）100 μL，其中甲醇含量不超過(guò)1%。配制方法如下：將磷酸鹽緩沖液、肝微粒體、探針底物溶液、毛蕊花糖苷溶液或陽(yáng)性抑制劑溶液混勻，于37 ℃水浴中預(yù)孵育5 min，加入再生系統(tǒng)溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，再于37 ℃水浴中孵育相應(yīng)時(shí)間（表1）后取樣。向取出的孵育液中加入冰甲醇（終止反應(yīng)）和內(nèi)標(biāo)溶液各100 μL，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液。將上述6種上清液等體積渦旋混合，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)樣測(cè)定。每個(gè)樣本平行操作3次。

2.5 分析方法的建立

2.5.1 色譜條件 以Acquity UPLCⅢ BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）為色譜柱，以甲醇為流動(dòng)相A、0.5%甲酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表2）;流速為0.2 mL/min;柱溫為35 ℃;樣品室溫度為4 ℃;運(yùn)行時(shí)間為10 min;進(jìn)樣量為5 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離源，離子源溫度為150 ℃;毛細(xì)管電壓為0.5 kV;脫溶劑氣溫度為350 ℃;錐孔氣流量為1 L/h;脫溶劑氣流量（氮?dú)猓?50 L/h;碰撞氣為氬氣（純度大于99.999%）;掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，掃描方式為正離子掃描;數(shù)據(jù)采集范圍為m/z 10～1 000，數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站，通過(guò)調(diào)諧優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，最終確定6種探針底物的代謝產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件如表3所示。

2.5.3 專(zhuān)屬性考察 取空白肝微粒體，除不加探針底物、毛蕊花糖苷、內(nèi)標(biāo)外，其余按“2.4”項(xiàng)下方法處理，按“2.5.1”“2.5.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖略）;將“2.3”項(xiàng)下代謝產(chǎn)物溶液和“2.1.2”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液加至滅活的空白肝微粒體中，離心后同法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖2A）;按“2.4”項(xiàng)下方法制備肝微粒體孵育液，同法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖2B）。結(jié)果顯示，代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚、4-羥基美芬妥因、4-羥基雙氯芬酸、7-羥基香豆素、右啡烷、6β-羥基睪酮和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為1.0、5.5、4.4、2.4、2.2、5.2、3.4 min，各色譜峰峰形和分離度均良好，表明本方法專(zhuān)屬性良好。

2.5.4 線(xiàn)性關(guān)系與定量下限考察 分別吸取對(duì)乙酰氨基酚、4-羥基美芬妥因、4-羥基雙氯芬酸、7-羥基香豆素、右啡烷、6β-羥基睪酮單一貯備液適量，用甲醇稀釋?zhuān)渲瞥蓪?duì)乙酰氨基酚濃度分別為0.26、0.52、1.04、2.09、4.18、8.35 μmol/L，4-羥基美芬妥因、4-羥基雙氯芬酸、7-羥基香豆素、右啡烷濃度分別均為0.36、1.44、4.32、8.64、17.28、34.56 μmol/L，6β-羥基睪酮濃度分別為1.72、6.91、4.32、20.76、82.94、165.89 μmol/L的對(duì)照品溶液。將上述6種代謝產(chǎn)物對(duì)照品溶液加至滅活的空白肝微粒體中，制成不同濃度的系列工作溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，按“2.5.1”“2.5.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，每個(gè)濃度進(jìn)行雙樣本分析。以代謝產(chǎn)物的濃度（x）為橫坐標(biāo)、其與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5.5 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按“2.5.4”項(xiàng)下方法配制6種代謝產(chǎn)物定量下限和低、中、高濃度工作溶液，每個(gè)濃度平行6份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，按“2.5.1”“2.5.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算批內(nèi)精密度RSD和批內(nèi)準(zhǔn)確度[準(zhǔn)確度=（測(cè)得值/真實(shí)值）×100%，下同];連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算批間精密度RSD和批間準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5.6 基質(zhì)效應(yīng) 取空白肝微粒體，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，分別加入相應(yīng)濃度的6種代謝產(chǎn)物的對(duì)照品溶液（按“2.3”項(xiàng)下方法配制），制成低、中、高濃度工作溶液，每個(gè)濃度平行6份，按“2.5.1”“2.5.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積（A1）。另制備不含肝微粒體但含6種代謝產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)的對(duì)照品溶液，溶液終濃度與上述濃度保持一致，同法進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積（A2）。以A1除以A2計(jì)算代謝產(chǎn)物、內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，以代謝產(chǎn)物的基質(zhì)因子除以?xún)?nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.5.4”項(xiàng)下方法配制6種代謝產(chǎn)物低、中、高濃度工作溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，分別考察室溫下放置4 h、進(jìn)樣器（4 ℃）中放置24 h、 -20 ℃凍存20 d條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.6 肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)

2.6.1 肝微粒體孵育方法 肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)設(shè)置為空白對(duì)照組、陽(yáng)性抑制劑組和毛蕊花糖苷組。按“2.4”項(xiàng)下方法建立體外孵育體系，毛蕊花糖苷組孵育體系中分別加入濃度為0.1、0.3、1、3、10、30 μmol/L的毛蕊花糖苷溶液，陽(yáng)性抑制劑組孵育體系中分別加入α-萘黃酮、噻氯匹定、磺胺苯吡唑、毛果蕓香堿、奎尼丁、酮康唑的磷酸鉀緩沖液使各個(gè)陽(yáng)性抑制劑的終濃度分別為25、20、10、10、10、1 μmol/L，空白對(duì)照組孵育體系中用等體積的磷酸鉀緩沖液代替藥物，各組孵育體系中探針底物非那西丁、美芬妥因、雙氯芬酸、香豆素、右美沙芬、睪酮的濃度分別為150、25、30、10、10、50 μmol/L[17]。孵育相應(yīng)時(shí)間后取樣，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，再按“2.5.1”“2.5.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各探針底物對(duì)應(yīng)代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚、4-羥基美芬妥因、4-羥基雙氯芬酸、7-羥基香豆素、右啡烷、6β-羥基睪酮的含量。以空白對(duì)照組中代謝產(chǎn)物的含量為100%，以其余各組代謝產(chǎn)物的含量與空白對(duì)照組的百分比計(jì)算剩余酶活性（%）。以藥物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、剩余酶活性為縱坐標(biāo)，采用GraphPad v8.0軟件進(jìn)行非線(xiàn)性擬合并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50）。

2.6.2 陽(yáng)性抑制劑的酶抑制作用 陽(yáng)性抑制劑α-萘黃酮、噻氯匹定、磺胺苯吡唑、毛果蕓香堿、奎尼丁、酮康唑?qū)Υ笫蟾挝⒘ｓw中CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2A6、CYP2D6、CYP3A4的IC50分別為2.16、1.19、0.75、3.34、0.16、0.06 μmol/L，與相關(guān)文獻(xiàn)[18]結(jié)果基本一致，證明了本方法具有可行性。

2.6.3 毛蕊花糖苷的酶抑制作用 毛蕊花糖苷對(duì)大鼠肝微粒體中CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2A6、CYP2D6、CYP3A4酶的抑制曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。毛蕊花糖苷對(duì)大鼠肝微粒體中CYP1A2、CYP2A6酶的IC50>30 μmol/L（本研究將毛蕊花糖苷的最高濃度設(shè)定為30 μmol/L，IC50超過(guò)30 μmol/L則認(rèn)為無(wú)抑制作用），對(duì)大鼠肝微粒體中CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4酶的IC50分別為24.87、21.52、12.56、7.55 μmol/L。參考國(guó)際通用的CYP酶抑制劑強(qiáng)度分級(jí)規(guī)則——IC50小于1 μmol/L為強(qiáng)抑制劑，IC50介于1～<10 μmol/L為中等強(qiáng)度抑制劑，IC50介于10～50 μmol/L為弱抑制劑[19]，毛蕊花糖苷是CYP3A4的中等強(qiáng)度抑制劑，對(duì)其他CYP酶的抑制作用弱。

2.7 分子對(duì)接

為了更好地理解毛蕊花糖苷與CYP酶之間的相互作用，采用分子對(duì)接法進(jìn)行解釋。CYP酶的蛋白結(jié)構(gòu)從PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）下載;生成X、Y、Z坐標(biāo)尺寸為50×50×50的網(wǎng)格框，網(wǎng)格點(diǎn)間距為0.375 ?（1 ?=1×10-10 m）。使用AutoDock Vina 1.1.2軟件分別將毛蕊花糖苷和陽(yáng)性抑制劑的小分子連接到CYP酶的剛性蛋白中，采用拉馬克學(xué)習(xí)遺傳算法（Lamarckian genetic algorithm，LGA）計(jì)算毛蕊花糖苷和陽(yáng)性抑制劑與CYP酶之間的分子對(duì)接活性域。根據(jù)對(duì)接結(jié)果，可以得到若干個(gè)對(duì)接結(jié)構(gòu)，根據(jù)最低對(duì)接能量選擇最優(yōu)構(gòu)象。利用Discovery Studio 2019軟件打開(kāi)CYP酶蛋白結(jié)構(gòu)和對(duì)接結(jié)果，分析毛蕊花糖苷和陽(yáng)性抑制劑與CYP酶之間的結(jié)合靶點(diǎn)和作用方式，同時(shí)計(jì)算兩個(gè)復(fù)合物的結(jié)合自由能并進(jìn)行比較，以判斷親和力的強(qiáng)弱。根據(jù)“2.6.3”項(xiàng)下結(jié)果，選擇CYP3A4酶分別與毛蕊花糖苷、陽(yáng)性抑制劑酮康唑進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷與CYP3A4酶的相互作用（圖4A）主要是通過(guò)氫鍵以及疏水作用力來(lái)介導(dǎo)的，包括該化合物分別與GLN-79、LYS-390形成氫鍵，與GLN-79、PRO-107形成C—H鍵，與PRO-227、LYS-378具有π-烷基相互作用;酮康唑與CYP3A4酶的相互作用（圖4B）主要是通過(guò)氫鍵以及靜電相互作用來(lái)介導(dǎo)的，包括該化合物分別與ALA-370、ARG-372、PRO-107形成C—H鍵，與LEU-373具有π-烷基相互作用，與PHE-213、PHE-304具有烷基相互作用，與PHE-215、PHE-108具有π-π堆積作用，與ARG-106、GLU-374具有π-陽(yáng)離子靜電相互作用，其咪唑環(huán)與ARG-105、ARG-375具有π-陰離子靜電相互作用。毛蕊花糖苷和陽(yáng)性抑制劑酮康唑與CYP3A4的結(jié)合自由能分別為-10.2、-12.4 kcal/mol（1 kcal=4.19 kJ）。結(jié)合自由能絕對(duì)值越大，代表體系能量越穩(wěn)定，結(jié)合能力越強(qiáng)[20]。

3 討論

酶抑制作用是預(yù)測(cè)藥物相互作用的常用核心指標(biāo)，被認(rèn)為是研究藥物代謝的關(guān)鍵[21]，因此近年來(lái)關(guān)于藥物對(duì)CYP酶的抑制作用研究較常見(jiàn)，且多以促進(jìn)臨床安全用藥為目的[22-23]。本課題組以毛蕊花糖苷對(duì)CYP酶的抑制作用為機(jī)制研究的切入點(diǎn)，探究毛蕊花糖苷對(duì)睪酮水平調(diào)節(jié)的影響：首先以毛蕊花糖苷為研究對(duì)象，采用經(jīng)典的大鼠肝微粒體體外孵育體系，借助快速靈敏的UPLC-MS/MS分析方法并結(jié)合探針底物法，對(duì)CYP酶探針底物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，綜合評(píng)估了毛蕊花糖苷對(duì)大鼠肝微粒體中6種CYP酶活性的影響;隨后根據(jù)體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果，借助計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)，針對(duì)性地將CYP3A4酶分別與毛蕊花糖苷、陽(yáng)性抑制劑酮康唑進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算并比較兩者的親和力。由體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，毛蕊花糖苷對(duì)大鼠肝微粒體中CYP3A4酶有中等強(qiáng)度抑制作用，而對(duì)其他5種CYP酶的抑制作用弱。由分子對(duì)接計(jì)算出的結(jié)合自由能可知，毛蕊花糖苷和陽(yáng)性抑制劑酮康唑與CYP3A4酶的結(jié)合能力相當(dāng)，且可通過(guò)氫鍵、疏水作用等方式發(fā)生相互作用，其結(jié)果可間接印證體外抑制實(shí)驗(yàn)。

影響肝微粒體體外孵育反應(yīng)的條件主要有肝微粒體濃度、底物種類(lèi)及濃度、孵育時(shí)間以及再生系統(tǒng)，這些條件在實(shí)驗(yàn)中相互影響、相互制約。為了使肝微粒體孵育反應(yīng)的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，本課題組前期盡可能地優(yōu)化了孵育體系的反應(yīng)條件。（1）肝微粒體濃度：為了使代謝產(chǎn)物的形成速率與孵育時(shí)間、肝微粒體濃度成線(xiàn)性[24-25]，本實(shí)驗(yàn)以不同肝微粒體濃度（0.2、0.5、0.8 mg/mL）進(jìn)行孵育，選擇了代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高且線(xiàn)性關(guān)系良好的0.5 mg/mL作為最終的肝微粒體濃度。（2）底物種類(lèi)及濃度：因肝微粒體種屬不同、體內(nèi)外抑制條件不同，選擇的底物種類(lèi)也不同，故應(yīng)根據(jù)《美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局藥物相互作用評(píng)價(jià)指南》[16]及CYP酶的種屬對(duì)應(yīng)關(guān)系選擇合適的底物，這樣才能得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果;同時(shí)在濃度方面，因?yàn)檫x擇的底物種類(lèi)可能不同，故不宜直接照搬文獻(xiàn)記載的濃度，而應(yīng)當(dāng)在保證規(guī)定的底物清除率[26]范圍內(nèi)，設(shè)定均勻的若干個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行考察以選擇最優(yōu)解。因本實(shí)驗(yàn)涉及底物較多，具體優(yōu)化濃度過(guò)程不做贅述。（3）孵育時(shí)間：通常肝微粒體實(shí)驗(yàn)所用的孵育時(shí)間為5～60 min，但不同底物反應(yīng)速率差異性大。為達(dá)到各CYP酶的最佳代謝產(chǎn)物量，本實(shí)驗(yàn)考察了每個(gè)CYP酶的孵育反應(yīng)時(shí)間，并以文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[27]為參照，選擇±10 min進(jìn)行優(yōu)化預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定最優(yōu)孵育時(shí)間（表1）。（4）再生系統(tǒng)：對(duì)于肝微粒體來(lái)說(shuō)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉、葡萄糖-6-磷酸-二鈉及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是激活CYP酶介導(dǎo)代謝所需的關(guān)鍵輔助因子。該再生系統(tǒng)所含物質(zhì)的保質(zhì)期通常為3～6個(gè)月，在配制后酶活性隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)而下降，因此配制成貯備液后，應(yīng)保證在適宜的儲(chǔ)存條件（-80℃）下儲(chǔ)存并盡早使用，以防儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致再生系統(tǒng)失活。

綜上所述，毛蕊花糖苷對(duì)大鼠肝微粒體中CYP3A4酶有中等強(qiáng)度的抑制作用，且親和力與陽(yáng)性抑制劑相當(dāng);對(duì)其他5種CYP酶的抑制作用弱。但本研究也存在著一定的局限：由于在體研究涉及復(fù)雜的生物膜、調(diào)節(jié)通道等生理機(jī)制，故體外研究的預(yù)測(cè)性可能不完全準(zhǔn)確[28];同時(shí)，考慮到大鼠和人的CYP酶存在種屬差異，且體內(nèi)外代謝也存在一定的差異，故本課題組后期將在人源肝微粒體中繼續(xù)研究毛蕊花糖苷對(duì)CYP3A4酶代謝的影響，進(jìn)一步探究其對(duì)體內(nèi)睪酮水平調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。

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（收稿日期：2021-10-20 修回日期：2022-02-14）

（編輯：鄒麗娟）