MEBO對(duì)大鼠慢性難愈合創(chuàng)面中IL-18表達(dá)的影響*

2岑麗君2賀佐分

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院桂西高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

皮膚是體表重要的生理屏障，慢性難愈合創(chuàng)面(俗稱潰瘍) 是指由各種原因引起皮膚損傷后創(chuàng)面修復(fù)慢，導(dǎo)致局部皮膚缺失，正常的皮膚解剖和生理狀態(tài)不完整[1]。隨著社會(huì)發(fā)展，人口老齡化，慢性難愈合創(chuàng)面已演變成一個(gè)既古老又新近的醫(yī)學(xué)問(wèn)題，是目前臨床治療難題。濕潤(rùn)燒傷膏(MEBO)是在中醫(yī)理論基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種中成藥，在亞洲和中東地區(qū)的研究中已證明[2]，其在慢性難愈合創(chuàng)面過(guò)程中起著重要的作用，是治療皮膚潰瘍、燒傷的局部藥物之一。MEBO可在病灶表面形成保護(hù)膜[3]，將傷口保護(hù)在一個(gè)生理的濕潤(rùn)環(huán)境中，提高抗菌、消炎、抗水腫等潛力[4]。慢性創(chuàng)面的愈合實(shí)質(zhì)上是慢性炎癥的修復(fù)過(guò)程，包括緩解炎癥反應(yīng)、溶解和排泄壞死組織、肉芽生成等[4]。MEBO治療慢性創(chuàng)面的確切作用機(jī)制尚未完全闡明，已有研究發(fā)現(xiàn)焦亡是一種細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程，其參與多種疾病的發(fā)生[5]、發(fā)展及預(yù)后。焦亡由炎癥小體激活后產(chǎn)生Caspase-1[6]，活化的Caspase-1經(jīng)剪切釋放IL-18等炎性因子被認(rèn)為是細(xì)胞焦亡的輔助事件。長(zhǎng)期以來(lái)細(xì)胞焦亡被認(rèn)為參與了多種炎癥性疾病，而MEBO在創(chuàng)面修復(fù)中是否涉及細(xì)胞焦亡以及其機(jī)制尚不清楚。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡健康成年SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只，體重約230 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014。本研究所有程序均按右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)規(guī)定進(jìn)行。

1.2動(dòng)物分組及造模 將60只大鼠隨機(jī)分為：空白組、 急創(chuàng)組、 美寶組、貝復(fù)濟(jì)組、模型組，每組12只。造模方法參照趙京禹等[7]全層皮膚缺損法和沈氏改良塑料環(huán)肉芽腫定量法[8-9]。即在大鼠腹腔內(nèi)緩慢注射10%水合氯醛(3 ml/kg體重)進(jìn)行麻醉，起效后用電動(dòng)備皮刀進(jìn)行背部剃毛，生理鹽水擦洗背部皮膚，干燥后以直徑30 mm的圓形印章在脊柱兩側(cè)做大鼠體表標(biāo)識(shí)，沿脊柱兩側(cè)標(biāo)識(shí)線切除皮膚，深達(dá)筋膜，覆蓋無(wú)菌方紗，醫(yī)用半透明膠布固定。其中空白組為正常大鼠，僅做背部皮膚備皮，急創(chuàng)組直接進(jìn)行背部造模。美寶組、貝復(fù)濟(jì)組、模型組腹腔內(nèi)注射劑量為80 mg/kg的醋酸氫化可的松溶液，形成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。

1.3創(chuàng)面處理及標(biāo)本采集 造模成功后用茂康牌稀碘伏溶液消毒創(chuàng)面，其中空白組僅做背部脊柱兩側(cè)備皮處理，急創(chuàng)組僅在背部創(chuàng)面濕敷生理鹽水紗布。美寶組、貝復(fù)濟(jì)組、模型組分別使用濕潤(rùn)燒傷膏(0.2 g/cm2)、貝復(fù)新(60 U/cm2)和生理鹽水紗布覆蓋治療。每天換藥2次，分別于造模后第3天、第7天、第14天隨機(jī)將每組4只大鼠脫頸處死。 取造模創(chuàng)面組織置于冰上，使用組織剪剪成均等兩片。一片用于制作石蠟切片進(jìn)行病理學(xué)觀察；另一半用微量離心管保存置于-80 ℃冰箱，用于分子生物學(xué)檢查。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1創(chuàng)面細(xì)胞觀察 電鏡下觀察急創(chuàng)組、模型組細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 治療后第3天，各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后第7天和第14天，急創(chuàng)組、貝復(fù)濟(jì)組、美寶組大鼠創(chuàng)面愈合率均明顯高于模型組(P<0.05) ，美寶組與貝復(fù)濟(jì)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。見表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較

2.2各組大鼠創(chuàng)面肉眼觀及組織學(xué)檢查情況 造模及干預(yù)后第3天，空白組為正常大鼠皮膚結(jié)構(gòu)，各組無(wú)明顯差異。急創(chuàng)組可見部分痂皮，光鏡下(見圖1)可見明顯皮膚結(jié)構(gòu)損傷，肉芽組織形成，組織水腫明顯；貝復(fù)濟(jì)組及美寶組大鼠創(chuàng)面組織內(nèi)亦可見皮膚損傷，局部可見紅細(xì)胞溢出血管壁外；第7天模型組創(chuàng)面縮小不明顯，局部鮮紅，肉芽組織可見暗紅，水腫、鏡下可見少許出血。其余3組創(chuàng)面較前均明顯縮小、創(chuàng)面干燥；第14天，模型組創(chuàng)面愈合不佳，仍見肉芽組織且顏色暗紅、局部仍有水腫，鏡下僅見部分機(jī)化恢復(fù)。其余三組均已基本愈合，創(chuàng)面周圍有毛發(fā)覆蓋，急創(chuàng)組愈合最好，創(chuàng)面接近完全閉合(見圖2)。電鏡結(jié)果顯示模型組、美寶組中均存在細(xì)胞脹大，細(xì)胞破損，細(xì)胞內(nèi)容物釋放的細(xì)胞焦亡特征(見圖3)。

2.3IL-18表達(dá)水平 治療第3天、第7天、第14天，空白組為正常大鼠皮膚結(jié)構(gòu)，各時(shí)間點(diǎn)IL-18表達(dá)水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；急創(chuàng)組、貝復(fù)濟(jì)組、美寶組：大鼠創(chuàng)面組織內(nèi)IL-18表達(dá)水平先升高后降低；模型組：第3天到第7天升高，隨后逐漸維持在一個(gè)較高水平。各組對(duì)比情況：第3天：空白組和其余4組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組和其余4組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，急創(chuàng)組、貝復(fù)濟(jì)組、美寶組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第7天：空白組和其余4組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組和其余4組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，急創(chuàng)組、貝復(fù)濟(jì)組、美寶組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第14天：空白組和急創(chuàng)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，空白組和美寶組、空白組和貝復(fù)濟(jì)組、空白組和模型組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組和其余4組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；急創(chuàng)組、貝復(fù)濟(jì)組、美寶組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中模型組在第14天時(shí)表達(dá)水平為各組最高(見表2、圖4、圖5)。

空白組：皮膚組織結(jié)構(gòu)清楚飽滿，無(wú)明顯損傷。急創(chuàng)組：第3天出現(xiàn)明顯皮膚結(jié)構(gòu)損傷及肉芽組織，第7天肉芽部分機(jī)化，第14天機(jī)化完全。貝復(fù)濟(jì)組：第3天出現(xiàn)明顯皮膚結(jié)構(gòu)損傷，第7天肉芽組織較稚嫩，且可見明顯出血，第14天肉芽組織成熟，機(jī)化部分恢復(fù)。美寶組：第3天出現(xiàn)明顯皮膚結(jié)構(gòu)損傷，組織水腫且少量出血，第7天出現(xiàn)肉芽組織，第14天肉芽部分機(jī)化。模型組：第3天出現(xiàn)明顯皮膚損傷，第7天肉芽部分機(jī)化，第14天機(jī)化部分恢復(fù)。

圖2 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面情況

圖3 電鏡下亞細(xì)胞形態(tài)

表2 各組大鼠創(chuàng)面IL-18蛋白表達(dá)水平對(duì)比

1：空白組；2：急創(chuàng)組；3：貝復(fù)濟(jì)組；4：美寶組；5：模型組

圖5 各組大鼠創(chuàng)面IL-18蛋白表達(dá)水平

3 討論

慢性難愈合創(chuàng)面常好發(fā)于創(chuàng)傷、燒傷、癱瘓及糖尿病等，患者普遍高齡，身體狀況差，容易造成其他并發(fā)癥，住院時(shí)間增加，傷口長(zhǎng)期不適，顯著增加了醫(yī)療成本[10-11]。隨著現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，慢性疾病已經(jīng)成為威脅我國(guó)國(guó)民健康的頭號(hào)疾病，慢性難愈合創(chuàng)面就是其中之一。據(jù)資料顯示[12]，國(guó)內(nèi)每年復(fù)雜難治性創(chuàng)面治療需求在3 000萬(wàn)人次以上，常見有壓力性潰瘍、糖尿病足、軟組織缺損、放射性潰瘍等，治療難度較大，因此，對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面的研究，尋求一種更加有效的治療手段，具有重要意義。

慢性難愈合創(chuàng)面由于局部瘢痕形成，血管堵塞，全身靜脈用藥很難輸送至病灶，因此，局部用藥成為治療慢性難愈合創(chuàng)面的重要選擇。MEBO在臨床中廣泛應(yīng)用于慢性難愈合創(chuàng)面的局部治療，能保持局部傷口濕潤(rùn)，其中藥成分有抑菌消炎，緩解疼痛，促進(jìn)新生肉芽組織長(zhǎng)成的作用，有助于加快創(chuàng)面愈合。焦亡，也稱為炎性壞死，是一種具有內(nèi)在炎癥效應(yīng)的細(xì)胞死亡方式，通常由炎性小體觸發(fā)，經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡依賴于Caspase-1[13-14]的激活，激活后可釋放IL-18等炎性因子，已被證明與皮瓣缺血壞死、糖尿病腎小管上皮損傷、潰瘍性結(jié)腸炎、過(guò)敏性鼻炎、牙周炎、酒精性肝炎等多種炎癥性疾病有關(guān)。課題組前期研究證明MEBO能促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面的愈合[15-17]，也對(duì)其可能涉及的機(jī)制進(jìn)行了多項(xiàng)研究，但美寶促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面中的過(guò)程是否涉及細(xì)胞焦亡，尚未有涉及，故本研究通過(guò)觀察細(xì)胞焦亡的有關(guān)因子IL-18，探討其可能機(jī)制。

研究結(jié)果可見：治療第3天、第7天、第14天，由于空白組為正常大鼠皮膚組織，因此各時(shí)相IL-18表達(dá)水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與HE染色觀察到正常大鼠皮膚結(jié)構(gòu)一致。急創(chuàng)組、貝復(fù)濟(jì)組、美寶組：大鼠創(chuàng)面組織內(nèi)IL-18表達(dá)水平先升高后降低，考慮機(jī)體受到創(chuàng)傷后早期炎癥反應(yīng)明顯，在貝復(fù)新、美寶的干預(yù)治療下，炎癥反應(yīng)到達(dá)一定程度后逐漸受控，各種炎癥因子釋放減少，因此IL-18表達(dá)水平逐漸下降。模型組在第3天到第7天升高后可較長(zhǎng)時(shí)間維持在高水平，與第14天后鏡下仍可見顏色暗紅、局部水腫和少量炎性細(xì)胞及大量成纖維細(xì)胞，部分成纖維細(xì)胞排列紊亂相符，肉眼觀察亦可見模型組愈合最慢，考慮急性炎癥可能比慢性炎癥引起的炎癥反應(yīng)更加強(qiáng)烈，但沒(méi)有慢性炎癥持久，且在沒(méi)有藥物干預(yù)下IL-18檢測(cè)結(jié)果可持續(xù)升高。美寶中的黃岑在中醫(yī)藥典記載中就有較廣的抗炎作用，由此可以推測(cè)美寶、貝復(fù)濟(jì)均有可能通過(guò)減少細(xì)胞焦亡引起的炎癥反應(yīng)而加快慢性難愈合創(chuàng)面的愈合[18]，且作用相當(dāng)。同時(shí)電鏡可看到胞質(zhì)脹大，細(xì)胞膜孔形成的表現(xiàn)，雖然細(xì)胞凋亡也可由此類似表現(xiàn)，但結(jié)合IL-18表達(dá)水平升高，仍支持此為細(xì)胞焦亡的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

本研究證實(shí)了慢性難愈合創(chuàng)面的修復(fù)過(guò)程中涉及焦亡，并進(jìn)一步提供了證據(jù)。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)IL-18炎性因子在慢性難愈合創(chuàng)面中表達(dá)升高。同時(shí)運(yùn)用電鏡觀察到細(xì)胞焦亡典型的膜孔破裂形態(tài)，氣泡生成，這些結(jié)果提示細(xì)胞焦亡可能存在于創(chuàng)面修復(fù)中。

綜上所述，MEBO促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面的修復(fù)過(guò)程可能存在細(xì)胞焦亡，其機(jī)制可能與調(diào)控IL-18蛋白表達(dá)水平，減少焦亡反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，在減少焦亡反應(yīng)程度與貝復(fù)濟(jì)相似。但本研究具有一定局限性，IL-18除了存在細(xì)胞焦亡中，亦可存在其他炎癥反應(yīng)中，因此特異性不夠強(qiáng)，其確切機(jī)制需要更深入的研究。