人附睪蛋白4在炎癥相關(guān)疾病中的作用研究*

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院重癥醫(yī)學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

人附睪蛋白4(human epididymis 4，HE4)最早在人類附睪上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，屬于乳清酸性蛋白(whey acidic protein，WAP)或WAP四二硫核(WAP-type four disulphide core，WFDC)蛋白家族的成員，具有抗蛋白酶、抗菌、抗病毒和抗炎等多種功能，在一些炎癥相關(guān)疾病中呈高表達(dá)狀態(tài)。

1 HE4的基因及蛋白結(jié)構(gòu)

HE4最早由Kirchhoff C等[1]通過分子克隆技術(shù)從人附睪中提取，由位于染色體20q12-13.1上的WFDC2基因編碼。人類HE4基因中包含5個(gè)外顯子，HE4中的兩個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域由第2和第4外顯子編碼形成[2-3]，但可以通過選擇性剪接形成蛋白異構(gòu)體[3]，異構(gòu)體只包含1個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域。HE4有5個(gè)亞型，除HE4-V3外，其他亞型均含有N端分泌信號(hào)序列[1，3]。

成熟HE4為23kDa的小分泌蛋白，是由124個(gè)氨基酸組成的單肽鏈。其包含2個(gè)乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域和1個(gè)由8個(gè)半胱氨酸殘基組成的“4個(gè)二硫基核心”并且含有獨(dú)特的N-糖基化位點(diǎn)，位于14位(天冬酰胺)[4]。多肽序列的氨基酸末端區(qū)域約有30個(gè)氨基酸，其中含有大量疏水氨基酸殘基和特征性的富亮氨酸核心，呈典型的信號(hào)肽外觀[1]。HE4是一具有蛋白酶抑制劑活性的分泌蛋白[5]，參與了機(jī)體的蛋白清除、感染、先天免疫、炎癥、組織重塑和愈合等過程[6]。

2 HE4的表達(dá)

HE4早期被定義為附睪特異性、生育相關(guān)性的分泌蛋白，分布于核周的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，參與精子成熟過程[4，7-9]。在健康人體組織中HE4的表達(dá)受到高度限制。HE4 RNA和蛋白在生殖道和呼吸道的腺上皮中表達(dá)程度最高。在男性生殖道中，HE4在附睪管和輸精管上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，在前列腺腺上皮中呈局灶性低表達(dá)狀態(tài)，但在睪丸周圍的間質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)。在女性生殖道中HE4在輸卵管、子宮內(nèi)膜和宮頸腺體呈高表達(dá)狀態(tài)，在前庭大腺中呈低表達(dá)狀態(tài)，在子宮肌層、卵巢中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)。在呼吸道中，HE4在口腔上皮細(xì)胞、唾液腺、鼻咽部、氣管中呈高表達(dá)狀態(tài)。在腎遠(yuǎn)曲小管中HE4呈局灶性低表達(dá)狀態(tài)，而在腎臟、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)、輸尿管、膀胱和尿道未檢測(cè)出HE4表達(dá)。HE4在垂體前葉、甲狀腺、淚腺和小汗腺的散在細(xì)胞中呈局灶性低表達(dá)狀態(tài)。在胃腸道，血淋巴組織(骨髓、淋巴結(jié)、脾臟、胸腺和扁桃體)，肌肉骨骼組織(軟骨、脂肪、骨骼肌和滑膜)，神經(jīng)組織，皮膚和血管組織(主動(dòng)脈、心臟和淋巴管)中均未檢測(cè)出HE4表達(dá)[4，10-15]，見表1。血清HE4的表達(dá)同時(shí)也受年齡、性別、吸煙、月經(jīng)周期、更年期、懷孕、體重指數(shù)(BMI)等因素的影響[11，15-16]。血清HE4是監(jiān)測(cè)卵巢癌復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物之一，在惡性腫瘤、囊性纖維病變、良性盆腔、炎性相關(guān)疾病等呈過表達(dá)狀態(tài)。

表1 健康人體組織中HE4表達(dá)情況

3 HE4在炎癥反應(yīng)中的作用

HE4可抑制一系列絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、糜蛋白酶、前列腺特異抗原和蛋白酶K)以及半胱氨酸蛋白酶(如木瓜蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、胃蛋白酶)，以三聚體的形式發(fā)揮蛋白酶抑制劑的作用，當(dāng)三聚體中的二硫鍵被還原后，其蛋白酶抑制作用消失[17-18]。HE4在防止病原菌定植、入侵和防止上皮屏障破壞過程中起作用[19]。HE4可直接結(jié)合革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌菌膜，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[17-18]，通過抑制微生物分泌的外源性蛋白酶如枯草桿菌素樣絲氨酸蛋白酶，減低微生物對(duì)機(jī)體的侵害[20]。

4 HE4信號(hào)通路及病理生理機(jī)制

HE4被鑒定為組蛋白脫乙酰酶3(histone deacetylase 3，HDAC3)相互作用蛋白，HDAC3可增強(qiáng)HE4的表達(dá)，同時(shí)HDAC3與HE4的結(jié)合形成復(fù)合物可以上調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、p-PI3K和p-Akt 276的基因表達(dá)從而激活PI3K/Akt信號(hào)通路[21]。Nrf2(nuclear factor E2-related factor 2)作為PI3K/Akt通路的關(guān)鍵因子，其參與了機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[22]。HE4可能通過與HDAC3結(jié)合調(diào)節(jié)PI3K/Akt-Nrf2通路從而影響Nrf2因子的表達(dá)，從而參與了機(jī)體炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。也有研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的HE4促進(jìn)P65的磷酸化，P65的磷酸化可以激活磷酸化核因子B抑制蛋白激酶(phospho-inhibitor of NF-κB kinase，IKK)并進(jìn)行核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)通路信號(hào)的傳遞。HE4也可能通過P65的磷酸化調(diào)控NF-κB通路從而上調(diào)促炎細(xì)胞因子白介素和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)[23]。在前列腺癌組織中過度表達(dá)的HE4可以通過與表皮生長(zhǎng)因(epidermal growth factor，EGF)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的胞外結(jié)構(gòu)域從而抑制EGFR/Akt/GSK3B通路的激活進(jìn)而顯著抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[24]。在漿液性卵巢癌組織中高表達(dá)的HE4使p-EGFR、活化的細(xì)胞外激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)減少進(jìn)而抑制ERK通路，同時(shí)還使參與組織重塑的蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9、MMP-2和組織蛋白酶B減少。HE4通過對(duì)ERK通路和蛋白酶系統(tǒng)的抑制在漿液性卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等方面發(fā)揮重要作用[25]。

5 HE4在炎癥相關(guān)性疾病中表達(dá)情況

目前對(duì)于HE4的研究方向主要集中在卵巢癌等惡性腫瘤的相關(guān)研究。但在一些炎癥疾病及炎癥相關(guān)性疾病如：急性腎損傷、囊性纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生、發(fā)展過程中，HE4與炎癥反應(yīng)或炎癥指標(biāo)存在一定的相關(guān)性。

5.1腎臟疾病

5.1.1HE4與急性腎損傷(acute kidney injury，AKI) 已有研究發(fā)現(xiàn)AKI患者的血清HE4水平較健康對(duì)照組顯著升高，升高程度與肌酐、尿素、胱抑素C等指標(biāo)呈線性正相關(guān)，與腎小球?yàn)V過率(eGFR)呈負(fù)線性相關(guān)，特異度及敏感度均為100%[26]。腎衰竭是導(dǎo)致HE4升高的最重要的因素[27]。研究表明HE4對(duì)急慢性腎損傷患者的診斷價(jià)值均高于肌酐、尿素、胱抑素C[26]。

5.1.2HE4與腎纖維化 腎纖維化的特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、肌成纖維細(xì)胞和浸潤(rùn)性炎癥細(xì)胞的過度和持續(xù)積累，這些細(xì)胞對(duì)腎臟的正常組織結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重破壞，最終導(dǎo)致腎功能的進(jìn)行性喪失[28]。在纖維化的腎組織中HE4及其下游靶蛋白Prss35和Prss23水平升高。HE4通過抑制Prss35和Prss23絲氨酸蛋白酶活性，抑制Ⅰ型膠原的降解，發(fā)揮絲氨酸蛋白酶抑制劑活性[29]。HE4與可反映腎功能的肌酐之間存在強(qiáng)正相關(guān)性，與eGFR呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)該研究發(fā)現(xiàn)，在腎臟纖維化診斷中HE4比血清肌酐更具敏感性。HE4水平與CKD的嚴(yán)重程度有關(guān)，腎纖維化越嚴(yán)重的患者血清HE4水平越高，相關(guān)分析顯示HE4與腎纖維化程度顯著相關(guān)[30]。

5.2肺部疾病

5.2.1HE4與囊性纖維化(cystic fibrosis，CF) 在呼吸道、鼻和口咽部的正常組織以及囊性纖維化引起的炎癥性肺組織中，HE4在上呼吸道上皮細(xì)胞以及黏膜下腺體的黏液細(xì)胞有表達(dá)[12]。其中囊性纖維化患者的肺組織中HE4的表達(dá)顯著增加。對(duì)比分析研究CF及非CF肺疾病患者的血清HE4濃度，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，CF患者的血清HE4水平顯著升高；同時(shí)發(fā)現(xiàn)患有嚴(yán)重支氣管炎、哮喘、肺炎或支氣管擴(kuò)張的患者的血清HE4水平較正常對(duì)照組升高[16]。在CF患者中，HE4濃度和C反應(yīng)蛋白濃度呈正相關(guān)，可提示CF患者肺部炎癥的嚴(yán)重性。

5.2.2HE4與新生兒短暫性呼吸急促(transient tachypnea of the newborn，TTN) HE4在肺發(fā)育中具有重要的功能，HE4缺乏的新生兒肺泡間質(zhì)變厚，肺泡數(shù)量和質(zhì)量下降，導(dǎo)致呼吸困難和發(fā)紺[2]。在新生兒分娩24 h后其靜脈血HE4水平升高。在臍帶血樣本和分娩后24 h采集的新生兒靜脈血樣本中HE4濃度均無差異，而臍帶血樣本的HE4水平明顯高于新生兒母親的血液樣本?？梢娔殠а懈邼舛鹊腍E4來自于新生兒?？赡芤?yàn)樵诜置溥^程中，因新生兒體內(nèi)激素水平的變化刺激肺組織中WFDC2基因表達(dá)增強(qiáng)。雖然新生兒體內(nèi)的HE4的水平均升高，但在TTN患兒臍帶血及靜脈血中HE4水平較對(duì)照組仍顯著升高。同時(shí)TTN患兒體內(nèi)HE4與CRP值、降鈣素原濃度呈顯著正相關(guān)性[31]。

5.2.3HE4與肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB) 有研究發(fā)現(xiàn)PTB患者的血清HE4濃度較正常人明顯升高，PTB患者血清HE4濃度與白蛋白之間呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)。可用于評(píng)估患者的臨床情況。PTB患者血清HE4濃度越高與之對(duì)應(yīng)的肺空洞則越嚴(yán)重，血清HE4濃度與空洞嚴(yán)重程度高度相關(guān)，是PTB嚴(yán)重程度的證據(jù)之一。血清HE4濃度與CRP濃度、WBC計(jì)數(shù)升高明顯相關(guān)[32]。HE4可能與PTB患者的病情及肺部炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān)。

5.3其他系統(tǒng)疾病

5.3.1HE4與心力衰竭(heart failure，HF) 對(duì)比研究HF患者發(fā)現(xiàn)，HE4水平與n端b型利鈉肽前體(NT-proBNP)顯著相關(guān)。HE4與HF的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[33]，與參與心臟炎癥反應(yīng)的GDF15呈正相關(guān)[34]，表明HE4可能參與了心力衰竭過程的炎癥反應(yīng)。

5.3.2HE4與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種病因未明的慢性全身性炎癥，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)HE4進(jìn)行干擾后，細(xì)胞核抗原水平下調(diào)，細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控蛋白P12水平上調(diào)，表明HE4可能通過調(diào)控細(xì)胞核抗原和P12蛋白進(jìn)而在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮相關(guān)作用[35]。

5.3.3HE4與炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD) HE4在腸上皮組織的杯狀細(xì)胞中呈高表達(dá)，發(fā)揮蛋白酶抑制劑和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。在機(jī)體內(nèi)，HE4使上皮細(xì)胞之間保持緊密連接，并通過限制上皮細(xì)胞與腸道細(xì)菌接觸，防止了腸道細(xì)菌的入侵和腸黏膜的炎癥反應(yīng)。而IBD患者的腸上皮組織中杯狀細(xì)胞因炎癥作用導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)受到干擾，同時(shí)使HE4基因表達(dá)下調(diào)。通過比較輕度和重度潰瘍性結(jié)腸炎患者的組織切片發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)程度越重的組織切片內(nèi)的杯狀細(xì)胞分泌HE4減少越明顯。同時(shí)在干擾素-γ刺激的人結(jié)腸類器官模型的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HE4表達(dá)的下調(diào)與促炎因子的刺激明顯相關(guān)。HE4可能是一種重要的抗菌防御因子，它在防止病原菌定植、入侵和防止上皮屏障的破壞中起到關(guān)鍵性作用[20]。

5.3.4其他炎癥相關(guān)性疾病 HE4在急性炎癥損傷及炎癥患者體內(nèi)的血清及組織中HE4呈特異性增高[36]；陰道分泌物中的HE4濃度與MBL、IL-1、IL-1 ra和MMP-8水平呈正相關(guān)，HE4參與女性生殖道促炎癥反應(yīng)過程[37]。

5.4HE4與惡性腫瘤 在腫瘤組織中，HE4在卵巢漿液性癌表達(dá)水平最高，在肺腺癌、乳腺癌、移行細(xì)胞癌、胰腺癌HE4也有中高水平的表達(dá)[38]。1999年，Schummer M等[39]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中HE4的mRNA表達(dá)很高，但是在正常的卵巢組織中或癌細(xì)胞旁的組織中不表達(dá)，并且在早期卵巢癌組織中就有上升的趨勢(shì)。有文獻(xiàn)指出[38-39]，在腫瘤形成過程中，炎癥細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，產(chǎn)生有利于腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境，促使基因突變，促進(jìn)血管生成，在腫瘤微環(huán)境中，HE4同炎性細(xì)胞、炎癥趨化因子、細(xì)胞因子等共同調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、分化。HE4在惡性腫瘤中升高的意義及其機(jī)制，目前仍沒有揭示。HE4與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)是否相關(guān)仍需大量研究證實(shí)。

6 展望

HE4與炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在不同的疾病中均呈特異性高表達(dá)狀態(tài)。但目前對(duì)HE4是如何參與炎癥相關(guān)性疾病的機(jī)制尚未完全清楚，隨著對(duì)HE4研究的日益增多，HE4在炎癥反應(yīng)及炎癥相關(guān)性疾病中所起的作用會(huì)得到進(jìn)一步闡釋，有值得更深入研究的空間。