龍船花花藥愈傷組織誘導(dǎo)研究

余惠文,左 梅,柯玲俊,王玉玲,陸鑾眉*

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建 漳州 363000；2.閩臺特色園林植物福建省高校重點實驗室,福建 漳州 363000）

龍船花（Ixora chinensisLam）又名白日紅、仙丹花、山丹花等，是茜草科（Rubiaceae）、龍船花屬（IxoraLinn.）植物，龍船花花色艷麗、植株較矮，應(yīng)用廣泛[1]．茜草科龍船花屬植物世界上約有400 種，其中大多數(shù)品種分布在熱帶地區(qū)，而我國主要分布在云南省和福建省等大部分地區(qū)，約有19 種[2]．龍船花花期比較長，花期從3月至12月份[3]，可用于鮮切花[4]和園林景觀應(yīng)用[5-6]，此外龍船花具有一定的藥用價值[7].

花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的各種生長調(diào)節(jié)劑濃度組合、植物材料的基因類型、花蕾的生長發(fā)育時期、植物材料的預(yù)處理方法差異等培養(yǎng)條件都會對花藥愈傷組織的誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的影響[8]．龍船花組織培養(yǎng)和快速繁殖的相關(guān)研究為龍船花花藥愈傷組織誘導(dǎo)積累了理論基礎(chǔ)[9-11]．龍船花在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛，而相關(guān)育種研究相對滯后，尤其對其花藥愈傷誘導(dǎo)相關(guān)研究未見報道．花藥培養(yǎng)在植物育種中具有重要的用途，研究龍船花花藥誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)條件，建立龍船花花藥誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)體系，有利于龍船花育種以及開展相應(yīng)分子機理研究．因此，本研究應(yīng)用不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合的培養(yǎng)基對兩個不同品種的龍船花花藥進行愈傷誘導(dǎo)，并探索低溫預(yù)處理花藥時間對愈傷誘導(dǎo)的影響，篩選出適合龍船花花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及低溫預(yù)處理最佳時間．

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試驗的龍船花品種為“杏黃龍船花”和“宮粉龍船花”（圖1）．采集地點為閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物園．

圖1 本研究使用的龍船花品種Fig.1 Ixora chinensis accessions used in the study

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基+蔗糖30 g·L-1+活性炭0.5 g·L-1+瓊脂8 g·L-1，分別添加不同濃度的2,4-D和KT，本研究設(shè)計了25組誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表1），培養(yǎng)基的酸堿度調(diào)節(jié)至5.8．

表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基Tab.1 Induction medium with plant growth regulators(PGRs)

1.2.2 花穗取材及低溫預(yù)處理

花穗取材一般在晴朗的早晨9∶00至11∶00摘取，選取單核中晚期、外觀品質(zhì)正常、無病蟲害的龍船花花蕾，用枝剪將一整枝花團剪下，裝入保鮮袋帶回實驗室．把摘下的花蕾放入密封袋，在4 ℃冰箱中低溫預(yù)處理0、24、36、72 h后以備用，繼而用O13培養(yǎng)基進行愈傷組織誘導(dǎo)．

1.2.3 花藥接種

將花蕾置于體積為100 mL 的三角瓶里面，在紫外線滅菌后的超凈工作臺上先用75%乙醇浸泡30 s后，用無菌水沖洗1次；再用2%次氯酸鈉溶液浸泡10 min后，浸泡過程中輕微振蕩三角瓶，使其花蕾消毒徹底，最后用無菌水沖洗2至3次．把花蕾放在有無菌濾紙的培養(yǎng)皿里（挑選生長良好以及保存良好的花蕾）．選擇處于單核期的個頭飽滿的、無破損的花藥以備接種．在接種過程中，用滅菌后的鑷子和解剖刀將花藥輕輕剝開，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個皿接種20粒．

1.2.4 培養(yǎng)觀察及數(shù)據(jù)分析

將接種好的花藥培養(yǎng)皿放入(27±1)℃條件下的培養(yǎng)箱進行暗培養(yǎng)．培養(yǎng)三天左右開始觀察污染狀況，分別觀察培養(yǎng)3、4、5、6、7 d后的花藥，排除污染、褐化以及其他原因?qū)е滤劳龅幕ㄋ帲涗浧浠ㄋ幷T導(dǎo)出愈傷組織所需的培養(yǎng)時間，20 d 后觀察長愈傷組織的情況并統(tǒng)計數(shù)據(jù)，計算每個時間段愈傷組織的誘導(dǎo)率，然后每隔十天記錄一次．分別統(tǒng)計20、30、40 d 時的愈傷組織數(shù)目并計算愈傷組織的誘導(dǎo)率，整理數(shù)據(jù)并分析結(jié)果．誘導(dǎo)率計算公式為

誘導(dǎo)率=產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)/接種成活的花藥數(shù)×100%．

2 結(jié)果

2.1 花藥愈傷組織誘導(dǎo)

將生長狀況良好且不同生長時期的花藥進行分類，分別制片．用醋酸洋紅染液進行染色在40×顯微鏡下觀察，在花蕾長約為8 mm 時花粉發(fā)育時期處于單核期（圖2A、B），并取該時期花藥在MS 培養(yǎng)基＋蔗糖30 g·L-1＋活性炭0.5 g·L-1+瓊脂8 gL-1+3 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1KT 培養(yǎng)基中進行接種培養(yǎng)．兩種龍船花品種僅“杏黃龍船花”花藥可誘導(dǎo)出愈傷，花藥接種培養(yǎng)15 d 開始長出愈傷組織，愈傷組織比較光滑，呈半透明狀．繼續(xù)培養(yǎng)20 d后愈傷組織形狀不規(guī)整，顏色較淺（圖2C）．將愈傷組織轉(zhuǎn)移到光照條件下培養(yǎng)，愈傷組織即轉(zhuǎn)成綠色，整體質(zhì)地較硬（圖2D）.

圖2 花粉發(fā)育時期觀察Fig.2 Observation of pollen development period

2.2 不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合對龍船花花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

用含不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)的“杏黃龍船花”花藥均能誘導(dǎo)出愈傷組織，而“宮粉龍船花”均未誘導(dǎo)出愈傷組織．培養(yǎng)20 d時，“杏黃龍船花”花藥愈傷的誘導(dǎo)率在2.80%～47.00%之間，培養(yǎng)30 d 時花藥愈傷的誘導(dǎo)率在19.07%～69.44%之間，培養(yǎng)40 d 時花藥愈傷的誘導(dǎo)率在26.67%～73.06%之間（表2）．在KT 濃度分別為0.2、0.5 和2 mg·L-1時，愈傷誘導(dǎo)率隨著2,4-D 濃度的升高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且均在2,4-D 濃度為4 mg·L-1時為峰值．在MS 培養(yǎng)基+4 mg·L-12,4-D+2 mg·L-1KT 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20、30 和40 d 時龍船花花藥愈傷誘導(dǎo)率均為最高，且40 d 時龍船花花藥愈傷誘導(dǎo)率達到最高73.06%．不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出的龍船花愈傷組織生活力旺盛，形態(tài)外觀以及生長速率上沒有明顯差異.

表2 不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合對花藥培養(yǎng)的影響Tab.2 The influence of the medium with different concentrations of plant growth regulators on anther culture

續(xù)表2

續(xù)表2

2.3 低溫預(yù)處理對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

4 ℃條件下低溫預(yù)處理不同時間對“杏黃龍船花”花藥誘導(dǎo)愈傷效率的影響不同（表3）．龍船花花藥經(jīng)過4 ℃低溫分別預(yù)處理0、24、48、72 h后，花藥均能誘導(dǎo)出愈傷組織．預(yù)處理24 h的效果最佳，培養(yǎng)30 d和40 d的誘導(dǎo)率分別為67.78%和75.00%，40 d時愈傷誘導(dǎo)率顯著高于未經(jīng)低溫預(yù)處理的誘導(dǎo)率．

表3 不同預(yù)處理時間對愈傷誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effects of different pretreatments time on callus induction

3 討論

龍船花應(yīng)用廣泛，是十分重要的園林觀賞植物之一．花藥培養(yǎng)技術(shù)已廣泛用于十字花科[12]和禾本科[13-14]等農(nóng)作物研究，本研究首次報道了龍船花花藥誘導(dǎo)愈傷的研究，為龍船花育種以及基礎(chǔ)研究提供理論參考．

利用花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，不同材料的誘導(dǎo)成功率有很大差異[15]．馬洪民等[16]對26個不同草莓品種進行花藥培養(yǎng)研究時發(fā)現(xiàn)，草莓品種的基因型不同，其花藥的離體培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)能力上也有顯著不同.26個草莓品種中只有9個品種誘導(dǎo)出愈傷組織.不同基因型在燕麥花藥組織培養(yǎng)的影響表現(xiàn)為能否誘導(dǎo)出愈傷，誘導(dǎo)愈傷組織的多少等[17].由此可見，基因?qū)ㄋ幣囵B(yǎng)效果起主要決定作用．相同培養(yǎng)條件下，“杏黃龍船花”均能誘導(dǎo)出愈傷組織，而“宮粉龍船花”未能誘導(dǎo)出愈傷，結(jié)果表明不同基因類型的供體材料對花藥愈傷組織的誘導(dǎo)具有不同的影響.基因類型對龍船花花藥愈傷組織的誘導(dǎo)作用是決定性的，與“宮粉龍船花”相比，“杏黃龍船花”為較易誘導(dǎo)花藥愈傷的品種．

植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-D 常用于誘導(dǎo)植物組織分化愈傷組織，矮生龍船花莖段在2,4-D 濃度為2 mg·L-1的培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷組織[12]，“杏黃龍船花”花藥誘導(dǎo)愈傷的適宜2,4-D 濃度則為4 mg·L-1．低溫預(yù)處理有利于花藥愈傷組織的形成在其它物種中多有報道[13-14,17-19]．郭新梅等[19]研究比較了基因型、低溫預(yù)處理以及處理時間、及植物生長調(diào)節(jié)劑配比等因素對玉米花藥培養(yǎng)效率的影響，研究表明適當?shù)闹参锷L調(diào)節(jié)劑配比和低溫預(yù)處理均可提高花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率．本實驗研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果類似，同一培養(yǎng)基條件下，龍船花花藥在接種前進行適當?shù)牡蜏仡A(yù)處理，誘導(dǎo)率高于未經(jīng)預(yù)處理時的誘導(dǎo)率，由此可見，適當?shù)牡蜏仡A(yù)處理有助于龍船花花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，“杏黃龍船花”花藥在4 ℃低溫預(yù)處理24 h 后愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于未經(jīng)低溫預(yù)處理的誘導(dǎo)率．

綜上，“杏黃龍船花”花藥較易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，通過25 個處理組合試驗篩選出MS 培養(yǎng)基（含30 g·L-1蔗糖+0.5 g·L-1活性炭+8 g·L-1瓊脂）+4 mg·L-12,4-D+2 mg·L-1KT為誘導(dǎo)龍船花花藥產(chǎn)生愈傷組織的最適培養(yǎng)基．“杏黃龍船花”花藥在4 ℃低溫預(yù)處理24 h可提高愈傷誘導(dǎo)率．