靈芝多糖羧甲基化修飾及抗氧化性研究

張銀英,朱靜祎,潘裕添,2,林志超,2,吳啟賜,3*

（1.閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心,福建 漳州 363000；2.福建省菌類活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心,福建 漳州 363000；3.福建伯利賽克萊生物科技有限公司,福建 漳州 363000）

靈芝（Ganoderma lucidum）是世界名貴的食藥兩用菌，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1].據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“靈芝不燥不寒無毒，益心氣，助心充脈，補中，好顏色，增智慧，利關(guān)節(jié)，久食輕身不老，延年神仙”[2].靈芝多糖（Ganoderma lucidumpolysaccharide，GLP）存在于靈芝的菌絲體和子實體中，是靈芝的主要活性成分，目前已分離出200 多種靈芝多糖[3].構(gòu)成靈芝多糖的結(jié)構(gòu)單體除葡萄糖外，大多還有阿拉伯糖、木糖、半乳糖、巖藻糖、甘露糖、鼠李糖等單糖，單體間通過不同比例和類型的糖苷鍵連接而成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因而具有豐富的生物學(xué)活性.據(jù)報道，靈芝多糖有免疫調(diào)節(jié)[4]、抗腫瘤[5]、降血糖及抗糖尿病及其并發(fā)癥[6-9]、抗炎[10]、抗菌[11]、抗氧化[12]，促進腸上皮細胞修復(fù)[13]等功能，在國內(nèi)外被廣泛關(guān)注和應(yīng)用.

研究表明具有多種生物活性的多糖絕大多數(shù)是水溶性的，多糖結(jié)構(gòu)會直接或間接地影響其活性[14].通過化學(xué)改性，如羧甲基化、乙?；?、硫酸化、磷酸化等修飾手段，使多糖發(fā)生衍生化或轉(zhuǎn)化.一方面，可以改善水溶性，提高生物活性，甚至可以開拓新的生物學(xué)功能；另一方面，提高多糖水溶性還可以減少因多糖溶解所導(dǎo)致的時間和能量消耗，提高效率.因此，水不溶性多糖的改性研究對于改變多糖的性質(zhì)和生物活性具有重要意義.

羧甲基化是指向多糖中引入羧甲基官能團，進而提高多糖的水溶性和生物活性[15-19].本文采用堿溶性GLP 為原料，通過羧甲基化修飾，得到水溶性的羧甲基化靈芝多糖CM-GLP，并對不同取代度（degree of substitution，DS）的CM-GLP 進行了溶解性和紅外光譜分析，探索其體外抗氧化活性，研究結(jié)果可為堿溶性多糖的拓展應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GLP，福建省菌類活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心；氯乙酸，上海麥克林生化科技有限公司；透析袋MD77（3.5 kDμ），美國Viskase.其余試劑均為市售分析純，現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.2 儀器設(shè)備

恒溫水浴鍋（RE-2002），鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)設(shè)備（EV 322），北京萊伯泰科儀器股份有限公司；電子天平（TX323L），梅特勒-托利多儀器有限公司；pH 計（TX323L），梅特勒-托利多儀器有限公司；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（85-2A），金壇市江南儀器廠；紫外可見分光光度計（UV-3200PC），上海美譜達儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101 型），永光明醫(yī)療儀器有限公司；高速冷凍離心機（Centrifuge 5810 R），德國Eppendorf 公司；真空冷凍干燥機（LG-0.2），新陽速凍設(shè)備制造有限公司；紅外光譜掃描儀（NICOLET IS10），美國Nicolet公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 羧甲基靈芝多糖的制備及其制備工藝優(yōu)化

按照蘆昶通等人的方法[20]適當(dāng)修改.1 g靈芝多糖溶解在120 mL的NaOH 溶液中，室溫下堿化1 h.堿化結(jié)束后，將氯乙酸溶解于80 mL異丙醇中，然后邊攪拌邊緩慢滴加至上述反應(yīng)液中，放入水浴鍋醚化2 h.反應(yīng)結(jié)束后，室溫萃取，棄除上層醇液，收集下層水相，加入4 倍體積95%乙醇進行沉淀，靜置12 h.離心，沉淀用少量純水溶解，再用10%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 至中性，再次加入4 倍體積的95%乙醇，沉淀8 h，抽濾，95%乙醇洗滌沉淀兩次.將沉淀溶于少量純水，4 ℃純水透析48 h，經(jīng)凍干得羧甲基靈芝多糖CM-GLP.

（1）單因素實驗

（a）氯乙酸用量

固定醚化時間2 h、醚化溫度60 ℃、NaOH 濃度為4.5 mol/L，考察氯乙酸用量（分別為2.6、3、3.4、3.8、4.2、4.6 g）對CM-GLP取代度的影響.

（b）醚化溫度

固定醚化時間2 h、氯乙酸用量為3.4 g、NaOH濃度為4.5 mol/L，考察醚化溫度分別為（30、40、50、60、70、80 ℃）對CM-GLP取代度的影響.

（c）NaOH濃度

固定醚化時間2 h、氯乙酸用量為3.4 g、醚化溫度為60 ℃，考察NaOH 濃度（分別為3.5、4、4.5、5、5.5、6 mol/L）對CM-GLP取代度的影響.

（2）正交試驗

以CM-GLP 的取代度為指標(biāo)，根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取對取代度影響較大的三個因素即氯乙酸用量（A），NaOH 溶液濃度（B），醚化溫度（C）和其中三個最優(yōu)水平進行正交優(yōu)化試驗，進而確定靈芝多糖羧甲基化的最佳工藝參數(shù).其優(yōu)化試驗設(shè)計見表1.

表1 CM-GLP羧甲基化工藝優(yōu)化的因素水平表Tab.1 Orthogonal factors and levels table of carboxymethylation process of CM-GLP

1.3.2 CM-GLP取代度

按照蘆昶通等[20]的方法，取0.05 g CM-GLP 溶解在20 mL 標(biāo)準(zhǔn)HCl 溶液（0.1 mol/L）中，配制標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液（0.1 mol/L）并用其來滴定溶解好的溶液，記錄V1，V2.DS計算如下：

其中，V1：滴定過程中pH=2.1 時使用NaOH 溶液體積；V2：滴定過程中pH=4.3 時使用NaOH 溶液體積；m：CM-GLP質(zhì)量/g；C：NaOH溶液濃度/（mol/L）.

1.3.3 溶解性測定

根據(jù)2020 版《中國藥典》凡例項下溶解度測定方法，稍作修改，分別稱取100 mg GLP 和不同取代度CM-GLP加入含有10 mL純水的試管中，室溫下充分振搖再靜置30 min，觀察樣品在純水中的溶解情況.

1.3.4 紅外光譜分析

采用KBr壓片法進行紅外光譜分析[21].CM-GLP和GLP樣品與KBr粉末經(jīng)紅外干燥4 h，將1 mg樣品均勻混合至100 mg KBr 中，充分研磨后壓片，上機掃描，光譜范圍：4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描16次.

1.3.5 體外抗氧化性分析

（1）溶液配制

分別稱取100 mg 不同取代度的CM-GLP，溶于10 mL 純水中，配制成濃度為10 mg/mL 的母液，經(jīng)稀釋得質(zhì)量濃度為0.1、0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL的樣品溶液.

（2）羥基自由基（?OH）清除能力

羥基自由基清除能力測定根據(jù)文獻方法略作修改[22].取6根試管，分別依次加入2 mL CM-GLP溶液、2 mL 2 mmoL/L 的FeSO4溶液、2 mL 2 mmoL/L 的水楊酸溶液和1 mL 2 mmoL/L 的H2O2溶液，充分振蕩均勻后，室溫下避光靜置30 min，分光光度計測定（波長為510 nm）其吸光度值（A1）.空白組用蒸餾水替代樣品溶液，吸光度值（A0）；對照組用蒸餾水替代H2O2，吸光度值（A2）.以維生素C（VC）為陽性對照，按照CMGLP濃度梯度繪制變化曲線.

?OH清除率公式如式（3）所示：

其中，A0：空白組；A1：樣品組；A2：對照組.

（3）總還原力

總還原力測定根據(jù)文獻方法略作修改[23].將1 mL樣品添加到干燥試管中，加入2.5 mL磷酸緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液.將反應(yīng)液充分振蕩混合，50°C 水浴加熱20 min，然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，混合均勻，室溫下離心（8 000 rpm，10 min）.取2.5 mL 上清液，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%氯化鐵溶液，充分振蕩混勻，避光靜置10 min，分光光度計測定（波長為700 nm）樣品溶液吸光度值（A1），空白組用蒸餾水替代樣品溶液，其余處理同上，測定吸光度（A0）.以VC為陽性對照，按照CM-GLP 濃度梯度繪制變化曲線.

總還原力公式（4）為：

其中，A0：空白組；A1：樣品組.

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法

所有實驗都至少3次處理，所有數(shù)據(jù)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.采用SPSS Statistics 26.0軟件對實驗結(jié)果進行單因素顯著性分析，P<0.05表示結(jié)果顯著，并用不同字母標(biāo)示.

2 結(jié)果與分析

2.1 羧甲基靈芝多糖的制備

2.1.1 單因素實驗

（1）氯乙酸用量的影響

考察氯乙酸用量對CM-GLP 取代度的影響，結(jié)果如圖1所示，隨氯乙酸用量的增加，羧甲基取代度呈先增加后減小的趨勢.當(dāng)氯乙酸用量為3.4 g 時，CM-GLP 取代度到達最高值為4.72.在NaOH 堿化GLP過程中，由于加入的堿量一定，因此形成的多糖鈉鹽活性中心一定[24]，當(dāng)氯乙酸用量增加時，氯乙酸與GLP的活性中心相互碰撞的機率也會增加，所以CM-GLP的取代度增大；然而氯乙酸用量太高時，多余的氯乙酸會與堿反應(yīng)，從而改變整個堿性環(huán)境體系，堿性變?nèi)?，可能?dǎo)致兩種趨勢：一方面，醚化反應(yīng)速率逐漸降低，副反應(yīng)逐漸增加，因此羧甲基取代度降低，另一方面，堿溶性多糖溶解度下降，也可能導(dǎo)致反應(yīng)速率下降，所以選取3.4 g作為最佳氯乙酸用量.

圖1 氯乙酸用量對GLP取代度的影響Fig.1 Effect of chloroacetic acid dosage on the degree of substitution of CM-GLP

（2）NaOH濃度對CM-GLP取代度的影響

NaOH 濃度與取代度呈鐘形曲線關(guān)系（圖2），隨著NaOH 濃度的增大，CM-GLP 取代度呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當(dāng)NaOH 溶液濃度為4.5 mol/L 時，CM-GLP 取代度達到最大為4.10.在堿化反應(yīng)中，NaOH 溶液提供了堿性的反應(yīng)環(huán)境，而且NaOH 溶液可以中和反應(yīng)過程中釋放出來的酸類物質(zhì)，促進多糖溶脹[25]，從而可以提高醚化反應(yīng)活力，使得取代度上升.當(dāng)NaOH 溶液濃度過高時，靈芝多糖在強堿濃度下會發(fā)生降解，且降解比較嚴(yán)重[26]；另外，過高的NaOH濃度將影響氯乙酸濃度在體系內(nèi)的濃度，進而導(dǎo)致CM-GLP取代度下降，因此選取4.5 mol/L作為最佳NaOH濃度.

圖2 NaOH濃度對CM-GLP取代度的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the degree of substitution of CM-GLP

（3）醚化溫度對CM-GLP取代度的影響

醚化溫度對CM-GLP取代度的影響結(jié)果如圖3所示，隨醚化溫度的升高，羧甲基取代度呈先增加后減小的趨勢.當(dāng)醚化溫度為60°C時，CM-GLP取代度達到最大為4.87.溫度升高會加快反應(yīng)速率，因此能促進醚化反應(yīng)發(fā)生，取代度逐漸提高，然而隨著溫度進一步升高，副反應(yīng)速率也會隨之增加，并且在高溫下多糖通常會被降解[27]，導(dǎo)致已被取代的羧甲基再次被裂解[25]，也可能是因為不利于靈芝多糖羥基基團的顯露，而且逐漸縮小反應(yīng)空間，不利于取代反應(yīng)[19]，從而使羧甲基取代度逐漸降低.因此，選取60 ℃作為最佳醚化溫度.

圖3 醚化溫度對CM-GLP取代度的影響Fig.3 Effect of etherification temperature on the degree of substitution CM-GLP

2.1.2 CM-GLP羧甲基化工藝正交試驗優(yōu)化結(jié)果

CM-GLP 羧甲基化工藝正交試驗優(yōu)化結(jié)果見表2，根據(jù)R值大小可知，靈芝多糖羧甲基化結(jié)構(gòu)修飾的影響因素的主次順序為B>C>A，即NaOH 濃度>醚化溫度>氯乙酸用量，理論最優(yōu)工藝組合為A3B2C3，即氯乙酸添加量為4.0 g，NaOH 濃度為4.5 mol/L，醚化溫度為65 ℃，理論上此條件下取代效果最好.進一步對該工藝參數(shù)進行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），因素B 和C 對試驗結(jié)果有顯著影響，其中因素B 對CMGLP取代度的影響極顯著，而因素A各水平改變對CM-GLP取代度影響不顯著.

表2 CM-GLP羧甲基化工藝正交試驗優(yōu)化結(jié)果Tab.2 Optimization of carboxymethylation process of CM-GLP by orthogonal test

表3 CM-GLP羧甲基化工藝優(yōu)化結(jié)果的方差分析Tab.3 Variance analysis of carboxymethylation process of CM-GLP

然而，正交試驗結(jié)果中最高取代度（4.83）卻出現(xiàn)在工藝組合A2B2C3 中，即氯乙酸添加量為3.8 g，NaOH濃度為4.5 mol/L，醚化溫度為65 ℃.因此，需對理論最優(yōu)工藝進行驗證，結(jié)果如表4所示，理論最優(yōu)工藝的取代度為4.94，與正交試驗的最優(yōu)工藝結(jié)果相比，沒有顯著提高（僅提高2.49%）.因此，選擇組合A2B2C3為最優(yōu)工藝，不僅能節(jié)約氯乙酸用量，還能減少因過度使用氯乙酸而引起的一系列環(huán)境問題.

表4 工藝驗證Tab.4 Process verification

2.2 溶解性

采用藥典方法分析CM-GLP 的溶解性.選取取代度為4.58、3.54 和1.86 的CM-GLP，分別標(biāo)記為CM-GLP-H、CM-GLP-M 和CM-GLP-L.結(jié)果顯示，在該測試條件下，CM-GLP-H 的溶解度≥10 mg/mL；CM-GLP-M 和CM-GLP-L 在相同溶解條件下，均有不同程度的剩余量，并且CM-GLP-M 比CM-GLP-L 的不溶物更少；而GLP則大部分沒有溶解.可見GLP經(jīng)羧甲基化后，溶解性明顯提高，并且溶解性與羧甲基的取代度呈正相關(guān).

2.3 紅外光譜分析

GLP 和不同取代度CM-GLP 的紅外光譜如圖4所示.GLP 和CM-GLP 在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)圖譜基本相似，只存在部分差異.GLP 和CM-GLP 在1 000～1 100 cm-1、1 400～1 530 cm-1、2 800～2 900 cm-1和3 100～3 500 cm-1均有多糖的特征吸收峰.3 400 cm-1附近是羥基（O-H）的伸縮振動峰，經(jīng)羧甲基化后，吸收峰由3 408 cm-1高波數(shù)移動（3 423.8 cm-1）.2 920 cm-1附近是烷基的（C-H）的伸縮振動.CM-GLP在1 604 cm-1和1 324 cm-1附近發(fā)現(xiàn)吸收峰，說明存在羧基（C=O）的非對稱和對稱的伸縮振動[28]，意味著GLP 確實發(fā)生了醚化，表明（COO-）基團成功被連接到GLP上.

圖4 GLP和CM-GLP的紅外光譜分析Fig.4 Infrared spectrum analysis of GLP and CM-GLP

2.4 體外抗氧化性分析

考察CM-GLP的抗氧化性.如圖5A（A：清除?OH 自由基活性）所示，CM-GLP是具有很強的清除羥基自由基能力，其清除能力與CM-GLP 濃度和取代度呈正相關(guān).在0.5～10 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，CM-GLP 清除自由基能力約為10%～98%.當(dāng)濃度為10 mg/mL 時，CM-GLP-H 清除能力最強為97.99%，CM-GLP-M稍差（97.21%），CM-GLP-L最弱（94.60%）.

由圖5B（B：還原力）可知CM-GLP 具有一定的還原力，其變化規(guī)律與清除羥基自由基能力基本一致.隨著CM-GLP 濃度和取代度的增加，CM-GLP 還原力也隨之加強，說明還原力與CM-GLP 濃度和取代度呈正相關(guān).在0.5～10 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，CM-GLP 還原力為0.007～0.214.當(dāng)濃度為10 mg/mL 時，CMGLP-H還原力最強，為0.214.

圖5 CM-GLP的體外抗氧化性分析Fig.5 In vitro antioxidant analysis of CM-GLP

3 結(jié)論

本文以堿溶性靈芝多糖為原料，通過羧甲基化改性制備了羧甲基靈芝多糖CM-GLP，利用正交試驗優(yōu)化了靈芝多糖羧甲基化工藝，并對CM-GLP進行了水溶性和紅外光譜分析，研究其體外抗氧化活性，得到如下結(jié)論：

（1）通過單因素實驗可知，氯乙酸用量、NaOH濃度、醚化溫度等因素與CM-GLP取代度之間的關(guān)系呈鐘形曲線變化.在單因素的基礎(chǔ)上采用正交試驗設(shè)計探究CM-GLP 的最佳工藝為氯乙酸用量3.8 g，NaOH濃度4.5 mol/L，醚化溫度65 ℃；進行驗證實驗，得到CM-GLP的平均取代度為4.82，優(yōu)化工藝準(zhǔn)確可靠.

（2）對不同取代度CM-GLP 和GLP 進行溶解度測試.結(jié)果顯示，CM-GLP-H 的溶解度≥10 mg/mL，CM-GLP-M次之，CM-GLP-L最差，但溶解性優(yōu)于GLP，說明經(jīng)羧甲基修飾后，GLP溶解性有很大改善，并發(fā)現(xiàn)其溶解能力與羧甲基取代度呈正相關(guān).紅外光譜分析表明，CM-GLP具備多糖的特征吸收峰，1 604 cm-1和1 324 cm-1吸收峰的發(fā)現(xiàn)，說明（COO-）基團成功被連接到GLP上.

（3）體外抗氧化性分析顯示，CM-GLP 的清除羥基自由基能力和還原力與CM-GLP 的濃度和取代度之間均呈正相關(guān).