化學藥劑脅迫下6 株生防菌在黃瓜植株的定殖能力分析

鄭 麗，黃杰豪，劉紅霞，羅玉明，郭堅華

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院植物健康創(chuàng)新研究院/仲愷農(nóng)業(yè)工程學院農(nóng)業(yè)與生物學院，廣東 廣州 510225；2.南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/江蘇省生物源農(nóng)藥工程中心，江蘇 南京 210095；3.淮陰師范學院生命科學學院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 淮安 223001）

【研究意義】隨著人們對環(huán)境問題的重視程度增加以及化學農(nóng)藥帶來的弊端日益凸顯，具備健康、安全、無毒等優(yōu)點且對環(huán)境和人類友好的生物防治已經(jīng)成為今后防治植物病害的一種趨勢，生防菌作為生物防治的一種手段已被廣泛應用于防治植物病害［1-2］。與此同時，在實際生產(chǎn)中，難以避免低毒溫和型化學藥劑的使用，那么生防制劑和化學藥劑的相容性研究顯得非常重要。

【前人研究進展】生防菌可以通過競爭、誘導抗性、頡頏、水解酶等發(fā)揮生防的作用［3］，而發(fā)揮生防效果的第一步是穩(wěn)定定殖，這也是生防菌有效重置微環(huán)境的關(guān)鍵一步。重置后的微生物能形成類似自然微生物群的群落，且對各自的生態(tài)位具有專一性和適應性［4-5］。BBS（Bacillus cereusAR156,B.subtilisSM21 andSerratiasp.XY21）處理土壤后抑制甜菜疫病的發(fā)生［6］；接種B.amyloliquefaciensFZB42 可抵御青枯病的發(fā)生［7］；施加B.amyloliquefaciensNJN-6 可減輕香蕉枯萎病的發(fā)生［8］；近緣毛殼菌（Chaetomium subaff ine）LB-1 可有效抑制黃瓜白粉病發(fā)生，且促進黃瓜種子萌發(fā)和植株生長［9］；假蕈狀芽孢桿菌（Bacillus pseudomycoides）NX-2 可在黃瓜植株定殖，誘導黃瓜葉片EIN-3、ETR-1等抗病基因表達上調(diào)，從而控制黃瓜角斑病的發(fā)生［10］。另一方面，將化學殺菌劑與生防制劑混合，雖是目前植物保護制劑采用的主要方法之一，但利用化學殺菌劑時，沒有區(qū)分有害病原菌與非目標生物，使有益微生物數(shù)量減少，導致生物防治無效［11］。熒光假單胞菌屬（Pseudomonadaceae）Ps 和Ap 與化學藥劑多菌靈、戊唑醇+肟菌酯、丙環(huán)唑的推薦使用劑量有較高相容性，且經(jīng)復配后表現(xiàn)出對菊花枯萎病更高的防效［12］；甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）TA-1的體外生長不受0.1 mg/mL 氟吡咪胺的影響，且在其聯(lián)合處理下，對番茄灰霉病的防效比任一單一處理都高［13］；Wylie 等通過體外試驗檢測ACT（Aerated vermicompost tea）對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）QST 713 和玫瑰炭疽菌（Clonostachys roseaf.catenulata）J1446抑制黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.raciscucumerinum,Forc）的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACT 與玫瑰炭疽菌J1446 復配對病原菌的抑制作用更強，而ACT 對芽孢桿菌QST713 有一定毒副作用，其混合產(chǎn)物抵御病原菌能力減弱［14］；因此，尋求與化學殺菌劑有較高相容性的生防菌，對提高植物防病能力具有重要意義［15］。

【本研究切入點】將實驗室前期篩選獲得的6 株生防菌處理黃瓜植株，分析化學藥劑使用情況下生防菌在黃瓜根圍土和葉片上的定殖?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在日光溫室大棚的蔬菜種植過程中，篩選和化學藥劑相容性程度較好的生防菌，降低黃瓜霜霉病等在生產(chǎn)過程中的損失。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 生防菌來自香蕉生境，參照鄭穎的方法［16］，6 個菌株鑒定的結(jié)果分別為：Bacillus cereus1BS4（香蕉土壤）、Bacillussp.2BS5（香蕉土壤）、Bacillus meqaterium3BS3（香蕉土壤）、Bacillus cereus3BY4（香蕉葉圍）、Enterobactersp.3BJN7（香蕉假莖內(nèi)）、Pantoea dispersa5BJN1（香蕉假莖內(nèi)）。

1.1.2 供試植物 供試黃瓜品種為津優(yōu)35，實驗室盆栽黃瓜培育方法：將黃瓜種子進行表面消毒（70%無水乙醇表面消毒1～2 min，0.05%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，滅菌水潤洗5 次），播種于育苗盤中后放置于28 ℃、16 h/8 h 光周期、70%相對濕度以上溫室中進行培育。待黃瓜苗長到3～4 片真葉（25 d 左右）時進行移栽。將黃瓜幼苗移栽入裝滿基質(zhì)的盆缽（上口外徑14.7 cm、內(nèi)徑12.8 cm，底徑9.3 cm，高11 cm）中，每缽1 株，置于28 ℃、相對濕度85%以上、16h/8h 光周期溫室。黃瓜霜霉病為日光溫室大棚自然發(fā)病。試驗在江蘇省淮安市丁集鎮(zhèn)共和六組日光溫室大棚進行。黃瓜種植連續(xù)15 年以上。土壤質(zhì)地為黃潮土類，輕壤質(zhì)土。土壤有機質(zhì)含量1.8%～1.9%，土壤pH 值6.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌菌懸液制備 將-70 ℃保存的菌株在LB 固體培養(yǎng)基上劃線活化，于32 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種到LB 培養(yǎng)液中，32 ℃、180 r/min 培養(yǎng)16 h，每隔2 h 取樣測量600 nm 處的OD 值，直至OD 值為0.8，并將此濃度的菌液作為種子菌液。以1∶500 體積比將種子菌液接種至LB 發(fā)酵培養(yǎng)液，32 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h后4 000 r/min 離心15 min，去除上清液，用同等體積滅菌水重懸浮，采用液滴法測得生防菌的活菌濃度為109CFU/mL。

1.2.2 生防菌菌株的利福平抗性標記 將活化后的生防菌菌液涂在含1 μg/mL利福平平板上培養(yǎng)，挑取單菌落（Rif1）至含1 μg/mL 利福平的LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，得到的菌液涂在含2.5 μg/mL 利福平的平板上培養(yǎng)。重復上述步驟，直至菌株抗性標記至100 μg/mL。純化，并經(jīng)過多代培養(yǎng)穩(wěn)定其性狀后保存?zhèn)溆??？股貥擞浘攴€(wěn)定性試驗參照鄭穎的方法［16］，野生型及抗生素標記菌株基因組DNA 采用BOX-PCR 指紋圖譜分析。

1.3 測定項目及方法

實驗室溫室條件下，將10片真葉黃瓜植株（未接種黃瓜霜霉病原菌，未使用化學藥劑，2011-04-17）進行噴霧（108CFU/mL的菌液60 mL，空白對照噴施等體積滅菌水）和灌根處理，每個處理3 次重復，每個重復8 棵苗；田間日光溫室條件下，將14 片真葉黃瓜植株噴施生防菌菌懸液，5 d 后不噴施（2011-05-14）和噴施化學藥劑百菌清（2011-03-24）于葉片上，每個處理4 次重復，每個重復10 棵苗。

采樣時間為接菌后0、3、7、14、21、30 d。根圍土取樣時，從盆缽中收集根系以及緊密黏附于根系上的土壤；葉片取樣時，用滅菌剪刀剪取噴施生防菌的葉子。獲得的樣品按照1∶10 比例浸沒于滅菌的0.85% NaCl 中，室溫下200 r/min離心30 min，得到10-1稀釋液，再用0.85% NaCl進行梯度稀釋，從合適濃度的稀釋液中吸取100 μL 涂布于含有利福平（100 μg/mL)、放線菌酮（100 μg/mL）的LB 平板。對照樣品處理同上。平板置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d 后記錄菌落數(shù)。

在SPSS 25.0 軟件中對定殖量數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并用LSD text 比較數(shù)據(jù)間的差異顯著性，在GraphPad Prism 8.0 對相關(guān)數(shù)據(jù)進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

1.1 生防菌在溫室條件（無藥劑、無病原菌）下的定殖量

在無化學藥劑和無霜霉病病原菌的溫室條件下，6 種生防菌在黃瓜葉片和根圍的定殖量總體上呈現(xiàn)降-增-穩(wěn)定的趨勢，即在接菌后0～3 d下降，接菌后3～7 d 上升，接菌后7～30 d 趨于穩(wěn)定。接菌后30 d，6 種生防菌（1BS4、2BS5、3BS3、3BY4、3BJN7、5BJN1）在葉片上的定殖量依次為105.21、104.86、105.00、108.00、103.92、105.41CFU/g(FW)，在根圍上的定殖量依次為105.65、104.38、103.76、105.35、103.86、103.76CFU/g(FW)。接菌后30 d，生防菌1BS4、2BS5、3BS3 在葉片和根圍的定殖量相較于初始接種量（107CFU/g，F(xiàn)W）均有所下降，菌株2BS5、3BS3 和3BJN7的定殖量保持在104CFU/g(FW)左右，而菌株1BS4 和3BY4 在葉片和根圍的定殖量菌均接近106CFU/g(FW)，定殖情況較為理想（圖1）。

2.2 生防菌在日光溫室條件（無藥劑、有病原菌）下的定殖量

在無化學藥劑脅迫和存在霜霉病病原菌的田間條件下，6 種生防菌在黃瓜葉片和根圍的定殖量總體上呈現(xiàn)降-增-降-穩(wěn)定的趨勢，即在接菌后0～3 d 下降，接菌后3～7 d 上升，接菌后7～14 d 下降，接菌后14～30 d 趨于穩(wěn)定。接菌后30 d，6 種生防菌（1BS4、2BS5、3BS3、3BY4、3BJN7、5BJN1）在葉片上的定殖量依次為103.92、103.70、103.66、103.83、103.85、105.92CFU/g(FW)，在根圍上的定殖量依次為104.56、104.71、103.62、102.44、104.57、104.95CFU/g(FW)。可知接菌后30 d，菌株3BJN7 和5BJN1的定殖量最高，3BY4 定殖量最低，菌株1BS4、2BS5 和3BS3 介于兩者之間。其中，3BY4 定殖量受病原菌影響較大，而3BJN7和5BJN1 在病原菌出現(xiàn)時還有助于定殖，1BS4、2BS5 和3BS3 定殖量不受病原菌影響或影響較弱（圖2）。

圖2 田間條件下6 種生防菌在黃瓜葉片與根圍的定殖情況（無藥劑脅迫）Fig.2 Colonization of six biocontrol bacteria in cucumber leaves and roots under field conditions (without fungicide stress)

2.2 生防菌在大田條件（有藥劑、有病原菌）下的定殖量

在化學藥劑和霜霉病病原菌存在的田間條件下，6 種生防菌在黃瓜葉片和根圍的定殖量總體上呈現(xiàn)降-增-降-穩(wěn)定的趨勢，即在接菌后0～3 d 下降，接菌后3～7 d 增加，接菌后14～30 d 趨于穩(wěn)定。接菌后30 d，6 種生防菌（1BS4、2BS5、3BS3、3BY4、3BJN7、5BJN1）在葉片上的定殖量依次為103.14、102.58、102.83、102.75、103.88、104.23CFU/g(FW)，在根圍上的定殖量依次為103.65、102.40、102.68、102.63、102.80、103.00CFU/g(FW)?？芍泳?0 d，多數(shù)菌株在葉片和根圍的定殖量分布在 102～103CFU/g(FW)，與初始接種量相比均有較大幅度降低（約103CFU/g，F(xiàn)W）。相較于無藥劑脅迫和存在病原菌的的田間條件下，定殖量均略有下降，但菌株3BJN7 和5BJN1 在葉片的定殖量仍可保持在104CFU/g(FW)左右（圖3）。

圖3 田間條件下6 種生防菌在黃瓜葉片與根圍的定殖情況（有藥劑脅迫）Fig.3 Colonization of six biocontrol bacteria in cucumber leaves and roots under field conditions (fungicide stress）

2.3 3 種不同條件生防菌在黃瓜葉片的定殖量比較

在無藥劑脅迫條件下，病原菌的出現(xiàn)一定程度上影響了生防菌在黃瓜葉片上的定殖，如菌株1BS4、2BS5 和3BY4 在黃瓜葉片的定殖量在多個時間點與無病菌出現(xiàn)時相比具有顯著差異，定殖量降幅在102CFU/g(FW)左右；而病原菌對生防菌3BS3 和5BJN1 在葉片定殖量的影響相對較小，大部分時間點的定殖量有較小程度的降低（約101CFU/g，F(xiàn)W），甚至基本持平；菌株5BJN1 在接菌后0、3、7、14、21 d，定殖量均比無病原菌存在時高出許多（圖4 箭頭），表明當病原菌出現(xiàn)時，該菌株的定殖能力有所提升。在病原菌存在的條件下，使用化學藥劑對絕大多數(shù)菌株（如1BS4、2BS5、3BS3、3BY4、3BJN7）在黃瓜葉片上的定殖較為不利，它們在各時間點的定殖量均有所下降，只有菌株5BJN1 對藥劑的耐受能力相對較強，且其和3BJN7 在葉片的定殖量在各時間點均可保持在104CFU/g(FW)。

圖4 不同條件下6 種生防菌在黃瓜葉片的定殖量比較Fig.4 Comparison of colonization quantities of six biocontrol bacteria in cucumber leaves under different conditions

2.4 3 種不同條件生防菌在黃瓜根圍的定殖量比較

3 種不同條件下，6 種生防菌株在黃瓜根圍的定殖與在葉片的定殖情況類似。即在無藥劑脅迫條件下，病原菌出現(xiàn)與否，對部分菌株（1BS4、2BS5、3BY4）的定殖都較為不利，在多個時間點的定殖量與無病菌出現(xiàn)時均有所下降，降幅在102CFU/g(FW)左右，與無病菌時的定殖量差異顯著，而病原菌對3BS3、3BJN7 和5BJN1 在根圍上的定殖受到這種影響程度較小，甚至病原菌出現(xiàn)還有助于它們在根圍上定殖。在病原菌存在的條件下，使用化學藥劑，多數(shù)菌株（如1BS4、2BS5、3BS3）在根圍上的定殖量都有一定程度的降低，降幅在101CFU/g(FW)左右，這種影響隨著菌株的不同而有所差異。部分對藥劑耐受性較好的菌株（3BJN7 和5BJN1），在接種30 d 后，定殖量仍可保持在104CFU/g(FW)左右（圖5）。

圖5 不同條件下6 種生防菌在黃瓜根圍的定殖量比較Fig.5 Comparison of colonization quantities of six biocontrol bacteria in cucumber roots under different conditions

3 討論

目前，黃瓜霜霉病生防因子的篩選研究已成為關(guān)注的熱點，尋找穩(wěn)定有效且能大規(guī)模生產(chǎn)開發(fā)的潛力微生物方面成功的報道也屢見不鮮［17-19］。本實驗也發(fā)現(xiàn)，多種生防菌株如短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等發(fā)揮生防功效的關(guān)鍵在于它們能否在植株上穩(wěn)定定殖，只有對外界脅迫耐受能力強的的菌株才可進一步作為潛力的生防因子推廣應用，這與報道［19-21］的結(jié)果一致。

應用微生物及其制劑進行農(nóng)作物防病增產(chǎn)的研究工作，已經(jīng)有數(shù)十年的歷史。而生防菌在田間的防治效果是否穩(wěn)定，影響的因素很多。Kolepper 認為，植物病害生物防治的第一步是拮抗微生物能在植物上成功定殖，只有具有較強的與常駐微生物競爭、定殖能力好的菌株才能增殖，否則，會被常駐微生物取代。已有的研究結(jié)果顯示，定殖能力也許是生防菌能否成功控制病害的決定性因子［22-23］。

本實驗選擇先前防效趨于穩(wěn)定的6 個生防菌株測定其在不同條件下的定殖能力，發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)相似的變化趨勢，噴施后7 d 其定殖量變化幅度微小，噴施后30 d 在黃瓜葉片的定殖量由初始的107CFU/g(FW)左右下降到104CFU/g(FW)。在化學藥劑存在條件下，生防菌仍可定殖于黃瓜葉片，后期化學藥劑對生防菌的影響逐漸消失。該結(jié)果與Palazzini 等研究數(shù)據(jù)相似，在不同殺真菌劑存在下，3 種生防單菌在小麥植株上定殖能力的改變程度有所差異；受藥劑影響程度小的組合，對小麥赤霉病菌Fusarium head blight的抑制作用更強［24］；聯(lián)合使用化學藥劑有助于提高熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）Pf1 在辣椒葉片上的存活率，并對辣椒炭疽病和白粉病的防效更明顯［25］；此外，使用無毒抗菌化合物（如有機酸、生物調(diào)節(jié)劑和揮發(fā)性精油）對BCA 發(fā)揮生防功效也有促進作用［26］；以上研究表明，在植物疾病防治的管理策略中，綜合z 使用生防菌劑與較小劑量的化學藥劑是控制植物病害的有效手段。

推測預先使用頡頏菌，再使用化學藥劑，可能頡頏菌面對脅迫，改變生存戰(zhàn)略，產(chǎn)生一些代謝物能協(xié)同化學藥劑發(fā)揮防病效果，而不被化學藥劑殺死，使得其定殖量仍能保持相當數(shù)量。本研究的發(fā)現(xiàn)，在日后開展篩選到的生防菌大規(guī)模大田示范推廣過程中，如何選擇合適的低毒低殘留化學藥劑與生防菌復配提供了一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

6 種菌株定殖規(guī)律趨于相似：①降—增—穩(wěn)定，②降—增—降—穩(wěn)定，③降—增—降—穩(wěn)定，生防菌的定殖量大多呈現(xiàn)降—增—穩(wěn)定的趨勢。病原菌的出現(xiàn)，較大程度影響了菌株3BY4在黃瓜葉片的定殖，使其在接菌后30 d 定殖量由108.00CFU/g(FW) 減少至103.83CFU/g(FW)，但 也增加了菌株5BJN1 在黃瓜葉片的定殖能力，使其在接菌后30 d 定殖量由105.41CFU/g(FW)增加至105.92CFU/g(FW)；使用化學藥劑對生防菌在黃瓜葉片的定殖較為不利，各菌株的定殖量降低約101CFU/g(FW)，但在30 dpi 時各菌株的定殖量仍可保持在102～104CFU/g(FW)，說明化學藥劑與這些菌株間存在一定相容性。相關(guān)機制將在后續(xù)實驗中探究。