建蘭花葉病毒廣東分離物的全基因組序列分析

魏永路，任 銳，高 潔，劉偉平，謝 琦，朱根發(fā)，楊鳳璽

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東 廣州 510640；2.廣東翁山蘭花研究有限公司，廣東 韶關(guān) 512600）

【研究意義】建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）屬于馬鈴薯X 病毒屬（Potaxvirus），是分布最廣、危害最重的蘭花病毒病原之一。CymMV 侵染引起的蘭花病毒病在荷蘭、美國、韓國、日本和東南亞，以及我國浙江、廣東和海南等蘭花主產(chǎn)區(qū)均廣泛流行［1-11］。CymMV的寄主廣泛，能侵染蘭屬（Cymbidium）、卡特蘭屬（Cattleya）、石斛屬（Dendrobium）、蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）和萬代蘭屬（Vanda）等諸多蘭科植物［12-13］。CymMV 侵染蘭花后常造成葉片褪綠、枯斑、壞死，植株矮化和畸形等癥狀，嚴(yán)重影響其生長發(fā)育和觀賞價值，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失［14］。目前國際上還沒有有效的防治植物病毒病的藥劑，但頻繁的國際國內(nèi)貿(mào)易、種質(zhì)資源交換及分株的繁殖方式，均加劇了CymMV等蘭花病毒病的廣泛傳播，對蘭花產(chǎn)業(yè)化發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，研究CymMV 全基因組對病毒的檢測、監(jiān)測預(yù)警和脫毒技術(shù)的開發(fā)具有重要意義

【前人研究進(jìn)展】國內(nèi)外對蘭花病毒病的流行及檢測和病毒分子生物學(xué)等相關(guān)研究已逐步展開。研究發(fā)現(xiàn)，CymMV 基因組包含1 條單鏈正義RNA（約6 200 nt），編碼多個功能蛋白，包括依賴RNA的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）、運(yùn)動蛋白（Movement Protein，MP）和外殼蛋白（Coat Protein，CP），其中，MP 編碼基因包含3 個開放閱讀框（TGB1、TGB2 和TGB3）［15］。RdRp 具有介導(dǎo)病毒復(fù)制的功能，MP 和CP 蛋白能分別介導(dǎo)病毒細(xì)胞間和長距離移動。最新研究表明，當(dāng)CymMV 和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV) 復(fù)合侵染蝴蝶蘭時，其小RNA 在感染宿主和免疫逃逸過程中發(fā)揮重要作用［16］。對受到CymMV 侵染的國蘭進(jìn)行分析，結(jié)果表明，CymMV 侵染確實(shí)可以促進(jìn)國蘭1 個非表達(dá)病程相關(guān)蛋白（Nonexpresserof Pathogenesis Related Genes 1，NPR1）基因和2 個病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis Related Genes 1，PR1）基因表達(dá)［17］，基于病毒與宿主的相互作用開發(fā)快速檢測傳感器成為可能［18-19］。對病毒全基因組序列及其功能蛋白編碼基因的研究，為病毒關(guān)鍵致病因子的挖掘、病毒-蘭花分子互作機(jī)制的解析及抗病毒病基因工程等相關(guān)研究打下基礎(chǔ)［20-24］。

【本研究切入點(diǎn)】目前GenBank 數(shù)據(jù)庫共登錄了14 個CymMV 分離物的全基因組序列，其中包括2 個日本分離物Cat（LC125633.1）和Japan（AB197937.1），1個韓國分離物Korean type 2（AF016914.1），1 個印度分離物plm1（AM055720.1），1 個新加坡分離物Singapore（U62963.1），3 個美國分離物Clone 18-29（EF125180.1）、Clone 18-1（EF125178.1）和Clone 18-30（EF125179.1），以及6 個中國分離物NJ-1（JQ860108.1）、China（KR185347.1）、SMi2（AM055640.2）、HNXL（HQ681906.1）、Taiwan（AY571289.1）和M2（EU314803.1）。上述6 個中國分離物分別來自南京、?？凇⒃颇虾团_灣等地，其自然寄主包括海南紅殼松（Cephalotaxus hainanensis）和香莢蘭（Vanilla planifolia）等。迄今為止未見有關(guān)來自廣東省CymMV 分離物全基因組序列的報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了探究蘭屬CymMV的遺傳信息和演化，本研究在對廣東蘭屬花卉主產(chǎn)區(qū)病毒調(diào)查和檢測的基礎(chǔ)上，首次進(jìn)行CymMV 廣東分離物病毒全基因組測定、序列同源性分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析和選擇壓力分析，以進(jìn)一步明確廣東地區(qū)CymMV的病毒種類及分類地位，以期為廣東省蘭花病毒病的監(jiān)測預(yù)警和蘭花抗病毒病基因工程提供重要的科學(xué)依據(jù)和試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

CymMV 分離物GZV13 和ZC29 分別來源于廣東省廣州市天河區(qū)和增城區(qū)，均從疑似病毒病墨蘭葉片中分離純化，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）及雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析（DA-SELISA）［25-30］檢測均為CymMV 陽性。

總RNA 提取試劑盒和大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；cDNA第一鏈合成試劑盒PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA 聚合擴(kuò)增酶PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、TA克隆載體pMD19-T Vector、5′RACE 和3′RACE 試劑盒均購自日本TaKaRa Bio 株式會社；DNA 純化試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek 公司；其他化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純。本氏煙種子（Nicotiana benthamiana）由廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物合成 從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲得已公布的14 個CymMV 全基因組序列（表1），在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行序列在線分析。選擇相對保守區(qū)段，用Primer Premier 5.0 軟件［31］設(shè)計特異性引物，用于2 個CymMV 分離物的基因組全序列測序（表2）。相鄰的兩個擴(kuò)增片段之間至少有800 bp的重疊區(qū)域。引物由美國英杰生命技術(shù)有限公司合成。

表1 16 種已測序完成的CymMV 全基因組Table 1 16 genomes of CymMV

表2 用于CymMV 病毒測序的引物序列信息Table 2 Information of primers used for the sequencing of CymMV disease

1.2.2 總RNA 提取、cDNA 第一鏈合成 將CymMV 分離物GZV13 和ZC29 接種于本氏煙20～30 d 后，取發(fā)病的新鮮上位葉片，用Total RNA Kit 提取植物總RNA，用Oligo (dT) primers和PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3 RT-PCR 擴(kuò)增及凝膠電泳檢測 以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，以引物組合CymMV-N-F/CymMV-N-R、CymMV-M-F/CymMV-M-R 和CymMV-C-F/CymMV-C-R-3 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括10× PCR 緩沖液5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，反轉(zhuǎn)錄模板cDNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，補(bǔ)足ddH2O 至50 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s、54～ 68 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.2.4 CymMV 全基因組序列測定與基因組結(jié)構(gòu)預(yù)測 對獲得預(yù)期大小的病毒基因組片段CymMV-N、CymMV-M 和CymMV-C 進(jìn)行割膠回收后連接到pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆搖菌，對經(jīng)菌液PCR 檢測正確的單克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序。測序由深圳華大基因股份有限公司完成。序列經(jīng)Blast 比對，確定為CymMV 基因組片段后，用Contig Express 軟件進(jìn)行CymMV 分離物GZV13 和ZC29的基因組序列拼裝，并用NCBI 網(wǎng)站的ORF finder 程序，對CymMV 全基因組序列各功能蛋白編碼基因的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF) 及基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.2.5 CymMV 全基因組序列分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析及選擇壓力分析 對CymMV 全基因組序列及各功能蛋白編碼基因，通過在線軟件Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行序列比對和同源性分析；采用MEGA 5.10 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，通過Neighbor-joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap 值為1 000，并隱藏可信度小于70%的值；采用DNASP 5.0 軟件進(jìn)行基因組核苷酸多態(tài)性分析及選擇壓力中性檢測，通過計算Pi值估算核苷酸多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 CymMV 分離物基因組片段擴(kuò)增及結(jié)構(gòu)預(yù)測

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，分別以3對引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，最終獲得長度分別為2 800、2 825、3 102 bp的病毒基因組擴(kuò)增片段CymMV-N、CymMV-M 和CymMV-C（圖1）。測序及Blast 序列比對發(fā)現(xiàn)，這些片段均為CymMV基因組序列。用Contig Express 軟件進(jìn)行CymMV基因組序列拼裝。

圖1 CymMV 分離物基因組片段擴(kuò)增及結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Genome fragment amplification and structure prediction of CymMV isolates

除3'-端poly (A) 外，CymMV 分離物GZV13和ZC-29的基因組全長均為6 227 nt，5'-和3'-非翻譯區(qū)(UTR) 分別為73、76 nt。GZV13 全基因組核苷酸序列中A、G、C 和T 堿基含量分別為26.53%、19.59%、29.05% 和24.83%，ZC-29 全基因組核苷酸序列中A、G、C 和T 堿基含量分別為26.4%、19.83%、29.03% 和24.73%。全基因組編碼5 個功能蛋白，包括RdRp(4 254 nt)、TGB 1（701 nt）、TGB 2（339 nt）、TGB 3（276 nt）和CP（276 nt）。以上結(jié)果表明，GZV13 和ZC-29 與大部分已報道的CymMV 分離物的基因組結(jié)構(gòu)相同。

2.2 序列一致性分析

為了探尋CymMV 分離物GZV013 和ZC-29與其他已報道分離物之間的差異，對其基因組核苷酸序列和各功能蛋白氨基酸序列進(jìn)行一致性分析。

全基因組核苷酸序列分析表明，16 個CymMV 分離物中序列一致性最高的是Clone 18-1和Clone 18-30，為98.31%；最低的是HNXL 與Clone 18-30，為86.85%；GZV013 與ZC-29 一致性介于兩者之間，為97.01%。與GZV013 和ZC-29 一致率最高的分別是Korean_type_2 和NJ-1，分別為97.36%和97.69%；最低的均是Clone 18-30，均為87.40%。

各區(qū)段核苷酸序列分析表明，5'UTR、3'UTR、RdRp、TGB1、TGB2、TGB3 和CP基因的一致率分別為86.11%～100%、82.86%～100%、8 7.0 2%～9 6.6 7%、8 2.8 8%～9 8.5 8%、8 7.0 9%～9 8.5 2%、8 9.4 9%～9 9.2 8% 和89.43%～99.11%。如表3 所示，各分離物中，與GZV013的5'UTR 一致性最高的是Korean type 2（97.36%），最低的是ZC29（91.67%）；其3'UTR 與ZC29、China、HNXL 和Korean type 2 完全一致（100%），而其與Taiwan的差異最大（82.86%）；與GZV013的RdRp、TGB1、TGB2、TGB3 和CP 基因序列一致性最高的分別 是Taiwan（97.27%）、Japan（97.86%）、Taiwan（98.23%）和Singapore（99.64%），最低的均為Clone 18-30，分別為87.09%、84.45%、89.09%、90.94%和97.92%。

各區(qū)段氨基酸序列分析表明，各編碼蛋白RdRp、TGB1、TGB2、TGB3 和CP的一致率分別為94.71%～97.81%、84.48%～99.57%、9 4.6 4%～1 0 0.0 0%、8 7.9 1%～1 0 0% 和97.31%～99.10%。如表3 所示，各分離物中，與GZV013的RdRp、TGB1 和TGB2 一致率最高的分別是Taiwan（97.67%）、ZC29（99.57%）和Taiwan（100%），其TGB3 序列與NJ-1 和China完全一致（100%），而與其RdRp、TGB1、TGB2和TGB3 一致率最低的均是Clone 18-30，分別為94.71%、84.48%、94.64%和87.91%。與GZV013的CP 基因氨基酸序列一致性最高的包括ZC29、NJ-1、Cat 和Japan，均為99.1%；氨基酸序列一致性最低的是印度分離物plm1 和美國分離物Clone 18-29，均為97.31%。

表3 GZV013 與其他CymMV 分離物的核苷酸和氨基酸序列相似性Table 3 Nucleotide and amino acid sequence identities between GZV013 and other CymMV isolates

綜合以上結(jié)果，16 個CymMV 分離物全基因組序列一致性為86.85%～98.31%；GZV013 和ZC-29 與中國（NJ-1、China 和HNXL 等）和韓國（Korean_type_2）等鄰近廣東省的地區(qū)分離物的核苷酸和氨基酸序列一致性較高，而與美國分離物Clone 18-1 和Clone 18-30 最低。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

用 MEGA5.0 軟件，對16 個CymMV 分離物進(jìn)行基于全基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果（圖2）顯示，16 個分離物共可聚類為A、B 兩個類群。其中，8 個中國分離物（ZC29、GZV013、China、NJ-1、SMi2、HNXL、Taiwan 和M2）、2個日本分離物（Cat 和Japan）、1 個韓國分離物（Korean_type_2）、1 個新加坡分離物（Singapore）、1 個印度分離物（plm1）和1 個美國分離物（Clone 18-29）聚類為A 群；2 個美國分離物（Clone 18-1 和Clone 18-30）聚類為B 群。

圖2 CymMV 分離物全基因組核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the complete genomic nucleotide sequence of CymMV isolates

A 群又可分為Ⅰ和Ⅱ兩個亞群。其中，2 個中國分離物（HNXL和China）、2個日本分離物（Cat和Japan）、1 個韓國分離物（Korean_type_2）、1 個印度分離物（plm1）和1 個美國分離物（Clone 18-29）聚類為亞群Ⅰ，這些分離物的自然寄主包括海南紅殼松（Cephalotaxus hainanensis）、香莢蘭（Vanilla planifolia）、石斛蘭屬（Dendrobium）和卡特蘭屬（Cattleya）等。ZC29 與南京分離物NJ-1的親緣關(guān)系最近，GZV013 與臺灣分離物M2的親緣關(guān)系最近，它們與中國云南分離物SMi2聚類成亞群Ⅱ，且這5 個分離物的寄主多為蘭屬和蝴蝶蘭屬。結(jié)果表明CymMV 多樣性種群的分化與寄主種類和地理隔離關(guān)系密切。

2.4 基因組多態(tài)性和選擇壓力分析

為了研究CymMV 基因組在自然選擇壓力下的進(jìn)化和遺傳變異，對16 個CymMV 分離物的全基因組序列進(jìn)行核苷酸多樣性分析和中性檢測。

從CymMV 不同區(qū)域基于Pi值的多態(tài)性圖譜（圖3）可見，RdRp的C 端、TGB1、TGB2在全基因組中Pi值最高，即變異性最高；而5'UTR、3'UTR、RdRp的N 端、TGB2 和CP的Pi值較低，即多態(tài)性較低。

通過Tajima 中性檢測的D值估計CymMV 基因組每個區(qū)域的變異情況，D值越小，受到負(fù)選擇的影響越大。結(jié)果（圖3）顯示，整個基因組的D值均為負(fù)值，說明整個基因組序列都在不同程度上受到負(fù)選擇壓力。

為進(jìn)一步確定CymMV 種群是否滿足中性進(jìn)化模型，本研究用Fu 和Li 檢驗計算CymMV 基因組每個區(qū)域的F?值，F(xiàn)?值越小，受到負(fù)選擇的影響越大。結(jié)果（圖3）顯示，各F?值均為負(fù)值，與上述D值一致，表明CymMV 基因組每個區(qū)域均受到負(fù)選擇的影響，并符合中性進(jìn)化模型；RdRp、TGB1 和TGB2 在全基因組中變異性最高。

圖3 CymMV 基因組多態(tài)性和選擇壓力分析Fig.3 CymMV genome polymorphism and selection pressure analysis

3 討論

蘭花一般指蘭科（Orchidaceae）植物，是被子植物中最大科之一。其中，國蘭是中國十大傳統(tǒng)名花之一，是廣東省最具優(yōu)勢和高產(chǎn)值的花卉種類之一，在國內(nèi)外花卉市場上占有重要地位［32］。CymMV 作為分布最廣、危害最重的蘭花病毒病原之一，能侵染蘭屬、卡特蘭屬、石斛蘭屬、蝴蝶蘭屬和萬代蘭屬等諸多蘭科植物。因此，展開蘭花病毒病的病害檢測和病毒分子生物學(xué)等相關(guān)研究，將為蘭花病毒病防控體系的建立及蘭花產(chǎn)業(yè)化的健康發(fā)展提供支持。

我國是多數(shù)地生蘭科植物的起源地［33］，國蘭（Cymbidium）作為重要的特色花卉，被出口到韓國、日本和東南亞各國［34］，而蝴蝶蘭等洋蘭也日益受到青睞。由于頻繁的國際和國內(nèi)貿(mào)易、種質(zhì)資源交流，以及蘭花病毒病檢測檢疫技術(shù)手段的局限性，導(dǎo)致蘭花病毒病在蘭花主產(chǎn)區(qū)和主要消費(fèi)地區(qū)廣泛傳播。本研究發(fā)現(xiàn)，CymMV 廣東分離物GZV013 和ZC-29，與我國臺灣等其他省份以及韓國等鄰近國家和地區(qū)分離物的序列一致性及親緣關(guān)系最高，說明它們可能有共同的起源。

病毒進(jìn)化有一定隨機(jī)性，但又受選擇壓力而呈現(xiàn)一定穩(wěn)定性。在蘭花病毒病隨寄主材料傳播的過程中，CymMV 等病毒逐漸進(jìn)化出能侵染更多蘭科植物的新株系。本研究發(fā)現(xiàn)與GZV013 和ZC-29 親緣關(guān)系最近的分離物的寄主均為蘭屬和蝴蝶蘭屬，與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)分離物的寄主則包括海南紅殼松、香莢蘭、石斛蘭屬和卡特蘭屬等蘭科植物，說明CymMV 多樣性種群的分化與寄主種類關(guān)系密切。能侵染其他蘭科植物的CymMV新分離物的出現(xiàn)，對蘭科植物種質(zhì)資源保護(hù)和利用提出了新挑戰(zhàn)。因此，研發(fā)操作簡單、靈敏度高和成本低廉的蘭花病毒病檢測技術(shù)，建立有效的蘭花病毒病防控體系是遏制蘭花病毒病廣泛傳播的關(guān)鍵。

CymMV 在不同的選擇壓力下，會發(fā)生基因組突變和遺傳進(jìn)化。本研究表明，CymMV 基因組每個區(qū)域均受到負(fù)選擇的影響，且RdRp、TGB1和TGB2 在全基因組序列中變異度最高，說明自然選擇壓力下（如新寄主等）這些基因發(fā)生的有益變異更多。但無數(shù)據(jù)表明這些基因顯著地受到了更大的選擇壓力。因此RdRp、TGB1 和TGB2在CymMV 侵染寄主過程中的作用還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究利用RT-PCR、DA-SELISA 和3 對通用引物，對采自廣州地區(qū)疑似病毒病癥狀的墨蘭進(jìn)行鑒定，并完成了GZV13 和ZC29 兩個毒株的全基因組組裝、功能注釋及核苷酸序列分析。通過國內(nèi)外16 個毒株全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析，明確了廣東地區(qū)發(fā)生的CymMV的分類地位。同時序列相似性也暗示了危害廣東蘭科植物的CymMV可能來自南京、臺灣等地，也可能來自與廣東農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易頻繁的日本、韓國等國家。提示應(yīng)在國內(nèi)地區(qū)間及進(jìn)出口貿(mào)易中加強(qiáng)相關(guān)檢疫措施?；蚪M多態(tài)性和選擇壓力分析表明，CymMV 易產(chǎn)生大量的低頻突變，為病害在蘭科植物間的傳播帶來較大不確定性，提示應(yīng)在廣東地區(qū)蘭科種植早期做好病蟲害綜合防治、關(guān)鍵抗病基因篩選及鑒定、抗病品種篩選及靶標(biāo)藥劑研發(fā)等方面工作。